Name: 从富足人类记忆B细胞群中选择和恢复具有所需特异性的抗体的单细胞筛选方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 了解BSelex单细胞筛选方法，从人类记忆B细胞群中分离抗原特异性抗体，结合流式细胞术与单细胞PCR技术，实现天然配对的抗体重链和轻链的高效回收与克隆，为治疗性抗体开发提供可靠方案。

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作者谨此感谢 Lucy Chammas、Martha Costa、Julie Kim、Nancy Heredia 和 Jeremy Macedo 在多次方法改进测试以及当前 BSelex 平台优化过程中所做的大量工作。

使用人类志愿者样本遵循斯克里普斯研究所机构审查委员会批准的方案。在献血前，已从捐献者处获得知情同意。
1. 试剂配制
<ol>
	<li>外周血单个核细胞（PBMCs）
	<ol>
		<li>通过Ficoll-Plaque Plus分离法从健康人供体中分离外周血单个核细胞。以每毫升含5000万个细胞的浓度，用90%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）进行冻存。先将细胞在-80 °C条件下冷冻，随后转移至液氮中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于分选的靶抗原肽标记
	<ol>
		<li>制备或获取针对目标蛋白的特异性肽段（长度不超过70个残基），并在末端连接生物素。</li>
		<li>在不同的离心管中，分别将每种生物素化肽段各4 nmol与共价连接了PE（R-藻红蛋白）或APC（别藻蓝蛋白）的链霉亲和素进行标记。按9:1的肽段与链霉亲和素（SA）摩尔比进行配制，SA-PE终浓度约为3.2 µM，SA-APC终浓度约为5.7 µM。同时制备生物素四聚体作为阴性对照。</li>
		<li>将各肽段混合物在4 °C避光、缓慢振荡条件下孵育过夜。</li>
		<li>将标记后的肽段通过含有聚丙烯酰胺珠的微柱，以去除未结合的荧光染料。</li>
		<li>肽段四聚体可在4 °C条件下储存最多2个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞分选
<ol>
	<li>在进行 CD22+ 分离前至少 1 小时至 16 小时，解冻供体 PBMCs 并于 37 °C 静置。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出冻存的外周血单个核细胞小管，立即放入37 °C水浴中。当小管几乎完全解冻时，转移至工作区域。</li>
		<li>将每支小瓶中的内容物转移至含有预热培养基的50 mL离心管中（保持不同供体分开）。加入培养基至终体积为50 mL。轻轻混匀管内物质。</li>
		<li>370 x g 离心 g 室温孵育6分钟。弃去上清液，将细胞重悬于15 mL RPMI完全培养基中，并进行细胞计数。</li>
		<li>调整细胞浓度至 2.0 x 107 以 RPMI 完全培养基重悬至细胞密度为 cells/mL，转移至 T75 培养瓶或更大容器中，于 37 °C 培养至少 1 小时，最长可至 16 小时，以使冻存细胞恢复。</li>
		<li>收集细胞（可根据需要合并），在370 x g下离心 g 4 °C下离心6分钟。弃去上清液，将细胞重悬于5 mL预冷的MACS缓冲液（PBS，pH 7.6，含0.5% BSA和2 mM EDTA）中，用MACS缓冲液定容至50 mL，并进行细胞计数。</li>
		<li>以 400 x g 离心细胞 g 4 °C下离心7分钟。</li>
		<li>分离CD22+ 通过CD22微珠捕获进行阳性选择分离B细胞。所有洗涤步骤均使用MACS缓冲液。计数后以400 × g离心 g 4 °C下离心7分钟。预期回收率占总PBMC群体的5-10%。</li>
		<li>将细胞重悬于FACS缓冲液（含0.5% BSA和2 mM EDTA的Tris缓冲液，pH 8.0）中，浓度为4000万细胞/mL，随后对供体细胞进行单独或混合染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于记忆B细胞分选的细胞染色
	<ol>
		<li>取出部分细胞用于流式细胞仪的校准及所用每种荧光染料的补偿调节。以未染色细胞作为对照。</li>
		<li>计算针对CD22抗体的最终染色体积+ 每100 μL染色200万个细胞后获得的细胞</li>
		<li>加入B细胞的细胞外标记物（CD19-PerCP-Cy5.5）、IgG（IgG-FITC）以及记忆细胞区室标记物（CD27-PECy7），按照生产商推荐的稀释比例添加，并轻轻混匀。分装10 μL7 将细胞转移至1.5 mL离心管中作为阴性对照，并将剩余细胞转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>将双标记的生物素-SA四聚体以每种（PE和APC）36 nM的终浓度加入阴性对照管中，乘以分选管中肽段的数量，并用FACS缓冲液调整终体积至0.5 mL（例如，10种肽段 × 36 nM = 360 nM）。</li>
		<li>将PE和APC标记的肽四聚体分别以36 nM的终浓度加入分选管中，并将细胞调整至2×10⁶6 每100 μL用TBS缓冲液重悬，在4 °C避光、温和旋转条件下孵育30–60分钟。</li>
		<li>4 °C 下以 400 x g 离心洗涤 2 次 g，7 分钟，最后一次洗涤前取出等分试样进行计数。使用 5 mL 带滤帽离心管过滤细胞。分选前加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染料至终浓度 0.3 µM，作为细胞膜完整性的标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过流式细胞术进行单细胞分选
	<ol>
		<li>准备用于分选的96孔PCR板中的48个孔。
		<ol>
			<li>配制主混合液：每份样品加入 2 μL 10x RT 缓冲液、0.5 μL RNase 抑制剂、7.5 μL 无菌 PCR 级水。每孔分装 10 μL，盖好后置于 4 °C 保存，待分选时使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在细胞分选仪上运行阴性对照，分析整个样本。
		<ol>
			<li>设置流式细胞术门控以分离用于单细胞分选的适当细胞群体。
			<ol>
				<li>绘制FSC面积与SSC面积的关系图，并设置R1门以分离淋巴细胞。</li>
				<li>绘制FSC高度与FSC宽度的散点图，并设置门控R3以排除FSC双联体。</li>
				<li>绘制SSC高度与SSC宽度的关系图，并设置门R4以排除SSC双联体。</li>
				<li>绘制SSC高度与DAPI的关系图，并设置门控R5以分离活细胞（DAPI-).</li>
				<li>绘制IgG与CD19的散点图，并设置R6门以圈定IgG+ B细胞（CD19+ IgG+).</li>
				<li>绘制IgG与CD27的散点图，并设置R7门以圈选记忆B细胞（CD27高).</li>
				<li>绘制抗原-PE（Ag-PE）与抗原-APC（Ag-APC）散点图，并将Ag-PE设为门R8+/Ag-APC+ 双阳性门内事件数较少的象限。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从抗原阳性（Ag）样本中收集等量的记忆细胞+用于信噪比测定的样本</li>
		<li>分选具有 CD19 表型的单个细胞+ CD27+ Ag-PE+ Ag-APC+ （门控R8）加入预先准备的96孔PCR板中。</li>
		<li>用铝箔胶带封板，400 × g 离心 1 分钟，随后于 -80 °C 保存，以备后续克隆使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞克隆
<ol>
	<li>逆转录反应
	<ol>
		<li>将单个B细胞分选板从-80 °C取出，在冰上解冻2分钟。以3,300 × g离心2分钟，使液体汇集至各孔底部后再打开。</li>
		<li>配制含有10%非离子型去污剂和oligo(dT)作为逆转录引物的dNTP/缓冲液主混合液。向含有单个细胞的每个孔中加入酶混合液，切勿混匀。</li>
		<li>在65 °C孵育5分钟。加入含有100 mM DTT、RNase抑制剂和逆转录酶的酶主混合液，使总体积达到20 µL。在50 °C孵育10分钟，然后在80 °C孵育10分钟。</li>
		<li>在开始PCR步骤前转移至冰上</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多步巢式PCR反应
	<ol>
		<li>分别使用独立的巢式PCR反应扩增重链（HC）和轻链（LC）。</li>
		<li>在第一轮PCR扩增（步骤I）中，使用一组正向引物和单一的反向引物，在独立的PCR反应中分别扩增HC和LC的可变区（图2）。设计上，该组正向引物可扩增大部分胚系前导（L）序列，而反向引物则特异性针对每条链下游的恒定区，包括轻链中的kappa（κ）和lambda（λ）16。
		<ol>
			<li>以2.5 µL cDNA产物作为每个PCR（步骤I）反应的模板。每种引物的终浓度为1 µM。将10×聚合酶缓冲液稀释至2×浓度，每反应总体积补至25 µL。HC PCR反应程序为：[94 °C/4 min；94 °C/15 s，55 °C/20 s，68 °C/60 s；68 °C/3 min]，共50个循环。LC PCR反应程序为：[98 °C/4 min；98 °C/15 s，72 °C/20 s，72 °C/60 s；72 °C/3 min]，共50个循环。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>以2.5 µL步骤I的产物作为每个（步骤II）PCR反应的模板。加入特异性针对HC和LC（κ和λ）框架区1（framework 1）的一组正向引物，以及特异性针对每条抗体链连接区的一组反向引物。将10×聚合酶缓冲液稀释至2×浓度，并按照与步骤I相同的参数进行50个循环的PCR扩增。</li>
		<li>将完成的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以观察阳性扩增条带。回收成对的扩增子（来自同一细胞的重链和轻链），并通过凝胶回收试剂盒进行纯化。通过OD260测定DNA片段浓度，以准确计算连接反应体系。</li>
		<li>使用商业化试剂盒，通过四片段连接反应将回收的重链和轻链片段与连接子片段及表达载体骨架连接。</li>
		<li>使用商业化试剂盒将连接产物转化至感受态细菌中。接种至含抗生素的平板后，向剩余的转化菌液中加入4 mL含抗生素的培养基，在37 °C、250 rpm条件下过夜培养。此即为&#34;连接混合物培养液&#34;。</li>
		<li>使用商业化试剂盒从过夜培养的连接混合物培养液中提取质粒DNA，并测定所得质粒DNA的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过ELISA筛选确认抗原特异性
<ol>
	<li>将10 µg质粒DNA与阳离子脂质转染试剂共同转染至10 mL悬浮培养的293细胞中，在37 °C、8% CO2条件下以125 rpm振荡培养3–4天。收获时，将细胞培养物在1,000 × g离心10分钟，并收集澄清的上清液。
	<ol>
		<li>通过蛋白A亲和法测定上清液中的IgG浓度。</li>
		<li>使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测每种IgG（在上清液中），浓度为20 µg/mL，靶标为分选时所用的各个肽段，肽段固定于链霉亲和素包被的板上；以肌动蛋白作为阴性对照。采用辣根过氧化物酶标记的 goat anti-human 二抗识别人IgG Fab段，以检测重组克隆。扣除背景后，OD值&#62; 0.5 定义为筛选阳性。</li>
		<li>通过进一步ELISA验证筛选阳性的克隆，使用IgG上清液进行系列稀释，起始浓度为每毫升20 µg，绘制针对初始ELISA筛选中显示反应性的各抗原的OD值浓度曲线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Janssen Vaccines & Prevention B.B. US patent. , U.S. Patent Application No. 20170210787, Published July 27, 2017 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本文介绍的方法结合了流式细胞术和单细胞克隆技术，所描述的方法基于Tiller及其同事先前开发的方法11。他们的研究描述了单克隆抗体的回收与克隆，旨在单细胞水平上研究人类B细胞受体库。我们对该方法的主要步骤进行了改进，使其能够从记忆B细胞群体中回收抗原特异性的单克隆抗体，包括采用多步扩增引物策略。主要的改进在于加入了标记抗原作为&#34;诱饵&#34;。此外，我们还对已发表的实验方案进行了其他优化，包括（但不限于）将克隆载体骨架改造为单一表达质粒、增加对种系受体库（包括信号肽序列和框架区1）的引物覆盖范围、转染悬浮培养的HEK293细胞以提高表达水平，以及在PCR扩增过程中使用高保真聚合酶。
在本文所述方法中，最关键的步骤集中在流式细胞术与单细胞克隆之间的过渡环节。首先，将分选后的单个细胞准确地放置到孔板中至关重要。在分选仪上正确设置液滴延迟时间是关键步骤之一。还需考虑环境因素，例如低湿度环境；我们发现，除非在目标分选板上使用防静电枪，否则细胞回收效率会显著下降。在完成细胞放置后，需对孔板进行离心，以确保细胞与孔底的10 µL缓冲液充分接触。上述所有措施对于后续分子生物学实验的成功至关重要。如果单个细胞的逆转录反应条件不理想，即使对β-actin进行PCR扩增也可能变得困难。本方法的优势在于能够检测数百万个细胞，并仅分选出符合针对目标抗原的抗原反应性标准的细胞。这要求信噪比尽可能高，因此需要在分选前优化诱饵抗原的浓度。采用双标记的抗原诱饵有助于减少假阳性细胞的回收，因为单一荧光染料可能存在较高的背景信号。使用多种抗原诱饵可能会增加信噪比优化的难度，但该方法的另一优势在于能够同时检测多个肽段。
当回收效率较低时，可使用一组嵌套式β-actin引物来确认模板cDNA的存在。该方法的缺点在于难以判断是由于孔中原本无细胞，还是逆转录反应失败所致，从而增加了故障排查的难度。偶尔也会出现相反情况，即回收效率高于预期。重链的典型回收率为30–45%，轻链则更高，为40–60%。每个PCR反应（第一步 &amp;#38; II）采用50个循环从单个细胞进行扩增。总循环数较高也使得该方法容易受到污染。通过对扩增产物进行序列分析，可以判断是否存在污染物引入，或是否真正实现了异常高的回收率。
该方法在回收针对特定抗原的天然人源抗体方面存在若干重要局限性。首先，流式细胞术中仅能使用可标记的可溶性蛋白作为&#34;诱饵"。在代表性结果所展示的实验中，我们采用了由tau蛋白合成的一系列重叠线性肽段，因为使用完整蛋白的尝试被证明较为困难。使用线性肽段可能并非最佳选择，因其可能限制对非线性或构象性表位抗体的识别。然而，我们仍成功鉴定出多个针对tau蛋白的独特抗体，目前这些抗体正在接受进一步评估8,9。另一项局限性在于IgG抗体的分子生物学回收与克隆过程通量较低。初始分选策略可实现对数百万个细胞的筛选，但后续的分子生物学操作包含多个步骤。尽管目前正在进行优化，尝试引入如Gibson Assembly10等新技术以简化多个流程，但瓶颈仍在于单个重链与轻链配对的克隆环节。
的 &#34;“BSelex”方法利用记忆B细胞表面表达的BCR来鉴定具有抗原反应性的细胞，随后通过流式细胞术回收这些单个细胞11,12由于该方法依赖于BCR，因此仅限于记忆B细胞群体，无法捕获抗体分泌细胞（ASCs），例如浆母细胞。然而，与ASCs相比，该方法在回收更广泛的抗原特异性免疫球蛋白库方面可能具有优势。流感疫苗研究显示，尽管反应性ASCs通常由少数扩增的B细胞克隆主导，抗原特异性记忆B细胞群体却很少呈现单克隆特征12T细胞表面的T细胞受体（TCR）在基因排列和重排机制上与B细胞受体相似，以实现多样性的最大化。类似于本文所述方法的单细胞技术已用于评估T细胞受体库，包括α链和β链的回收及单细胞克隆13然而，T细胞受体（TCR）的识别需要肽段由MHC分子呈递，这为利用标记饵料法鉴定肽特异性T细胞带来了显著的复杂性。与B细胞不同，T细胞不会对整个可变区进行亲和力成熟，因此只需鉴定短小的CDR3区及其部分侧翼序列，即可实现T细胞的识别与重建。最后，本方法描述了通过流式细胞术鉴定IgG分子，但也可使用其他表型标志物来鉴定不同同种型的B细胞。
目前，研究人员正在开发一些方法，以将下一代测序技术产生的海量数据与抗原特异性的功能分析相连接，但这些方法仍在不断完善中。尽管存在局限性，本文所述方法已成功用于发现对传染性和非传染性疾病具有潜在治疗价值的抗体8,14,15，并代表了一种可靠的技术途径，可直接从人体中回收相关抗原特异性的IgG抗体，而无需对B细胞进行大规模操作或长时间的细胞培养。

抗体是一类不断发展的治疗性分子，而任何人体内现有的B细胞库都是此类抗体的潜在来源。从人类供体中获取的抗体无需进行适应性改造或&#34;人源化&#34;步骤，而这些步骤是其他动物系统中产生的抗体所必需的。目前已有多种方法可用于鉴定和分离人源抗体，包括B细胞活化与增殖1、通过EBV转化实现永生化2,3，以及杂交瘤细胞系的建立4,5。然而，所有这些方法都需要大量的细胞培养工作，以筛选和获得抗原特异性抗体。随着下一代测序（NGS）技术的发展，人们对人源抗体库的认识得到了极大拓展，使得能够鉴定供体样本中存在的大量个体序列。然而，由于NGS提供的是对所有存在序列的无偏视图，因此无法实现对抗原特异性抗体的鉴定与分离，尤其是在稀有或低频抗体的情况下。 
该实验的目的在于 &#34;“BSelex”方法旨在从人类供体的外周血单个核细胞中鉴定抗原特异性抗体，并分离和回收这些抗体的序列以进行进一步分析。该方法利用流式细胞术和细胞分选技术，针对记忆B细胞表面表达的B细胞受体（BCR）进行筛选。在启动通量较低的分子生物学方法之前，可通过流式细胞术对数百万个B细胞进行抗原特异性筛选。大多数NGS方法在批量分析细胞序列时无法实现重链与轻链的配对鉴定。而本文所述方法可对单个细胞进行分离，实现重链和轻链序列的配对回收，从而允许直接克隆并表达完整的IgG。

<table><tbody><tr><td>MoFlo Astrio EQ 细胞分选仪</td><td>MoFlo</td><td></td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>生物素化肽段</td><td>New England Peptide</td><td></td><td>细胞分选 &quot;诱饵&quot;</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P30 凝胶柱</td><td>BioRad</td><td>#7326223</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素（R-PE）</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA10041</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素（APC）</td><td>Thermo Scientific</td><td>S32362</td><td></td></tr><tr><td>CD22 MicroBeads，人源&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>#130-046-401</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi</td><td>#130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>#130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-Cy5.5 标记的小鼠抗人 CD19 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>BD#340951</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 标记的小鼠抗人 CD27 抗体&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>#560609</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的小鼠抗人 IgG 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>#560952</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>#D21490</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>#10777-019</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Hyclone</td><td>#SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（HI FBS）</td><td>Invitrogen</td><td>#10082147</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>型号 #6325</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>PCR 96 孔板</td><td>Phenix</td><td>MPS-500</td><td></td></tr><tr><td>PCR 板封膜</td><td>Phenix</td><td>SMX-PCR96</td><td></td></tr><tr><td>Advantage UltraPure PCR 脱氧核苷酸混合物</td><td>Clontech</td><td>#639125</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV 第一链合成系统</td><td>Invitrogen</td><td>#18091050</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531-L</td><td></td></tr><tr><td>Platinum 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>#10966108</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>QIAGEN</td><td>#129114</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸引物</td><td>IDT</td><td>多种</td><td>所有 PCR 步骤所用引物</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>#28706</td><td></td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>#28106</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>#27106</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装克隆试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>Gibson 组装</td></tr><tr><td>Expi293 表达培养基</td><td>Invitrogen</td><td>#A14351-01</td><td></td></tr><tr><td>ExpiFectamine 293 转染试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>#A14525</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>#31985070</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱（Multitron）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octet&amp;nbsp;RED384 系统</td><td>Pall/ Forte Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 链霉亲和素包被高结合力透明 96 孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>#15500</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 96 孔聚苯乙烯高结合半面积板</td><td>Corning</td><td>#3690</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人 IgG Fab 二抗</td><td>Jackson Labs</td><td>#109-036-097</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 HRP 二抗</td><td>Jackson Labs</td><td>#115-035-072</td><td></td></tr><tr><td>SureBlueTM TMB 微孔过氧化物酶底物（单组分）&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>#52-00-03</td><td></td></tr><tr><td>TMB 终止液</td><td>KPL</td><td>#50-85-06</td><td></td></tr></tbody></table>

从富集的人类记忆b细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

人类抗体库是尚未充分开发的潜在治疗性抗体和有用生物标志物的重要来源。尽管当前的计算方法（如下一代测序技术，NGS）能够在序列水平上产生大量关于抗体库的数据，但仍需要功能数据来确定哪些序列对特定抗原或一组抗原具有相关性。本文介绍一种从人类献血者的外周血单个核细胞（PBMCs）中识别并回收单个抗原特异性抗体的方法。该方法首先对成熟B细胞进行富集，并结合表型细胞标志物与荧光标记蛋白，通过流式细胞术分离IgG记忆B细胞。随后对重链和轻链可变区进行克隆并重新筛选。尽管该方法仅限于记忆B细胞群体，但它利用流式细胞术检测数百万个B细胞，能够以适合表达和特异性验证的格式，获得来自单个细胞的配对重链与轻链序列。通过该方法获得的抗体可被评估其治疗潜力，也可结合生物信息学方法将特异性与功能关联，用于分析个体内的B细胞库。

本方法涵盖了一种从人类供体中分离抗原特异性抗体的多步流程。在本研究展示的代表性数据中，细胞与一组荧光标记的多肽混合物共同孵育，这些多肽代表了tau蛋白的多个不同结构域，包括模拟潜在磷酸化位点的磷酸化多肽。这些多肽作为“诱饵”，用于识别对特定tau表位具有反应性的细胞。在分选准备过程中，使用一组荧光标记的表型标志物，以鉴定富集后的B细胞群体中的不同细胞亚群。通过一系列流式细胞术设门策略，分离目标记忆B细胞（图1）。在流式细胞术中，根据细胞大小和颗粒度，利用前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图对淋巴细胞进行初步圈选6,7。在排除多重细胞（“双联体”）和死细胞后，通过IgG、CD19（B细胞）和CD27（记忆）等表型标志物，进一步区分出IgG+记忆B细胞。在此方法中，CD27标志物的表达未形成两个明显分离的细胞群，因此将CD27+表达水平最高的45%细胞纳入最终设门范围。最后，在APC和PE两种荧光染料上均呈双阳性的细胞位于设门图的右上象限，表明其对两种标记多肽均有反应性。位于设定门区内的细胞被分离并分选至96孔板的各个独立孔中。使用两种不同标签标记的抗原可提高信噪比，并减少后续分子生物学操作中的假阳性数量。经分选的细胞约占最终设门内记忆B细胞的0.1%，占起始细胞样本的0.001%。
单细胞克隆的第一个检测结果是确认相应重链和轻链可变区的扩增（图2）。由于需要同时回收两条扩增产物，因此在琼脂糖凝胶上并排评估PCR反应结果，并从凝胶中切取匹配的条带，提取DNA片段。典型的扩增效率为重链30–50%，轻链（κ链）50–70%。成对扩增产物的回收效率通常在25–40%之间。这些效率因供体样本池的不同而有所差异，代表性数据（图3）展示了从24个单细胞中进行高效扩增的示例（成对回收率达42%）。在完成IgG克隆后，将IgG表达载体转染至人胚胎肾（HEK-293）悬浮细胞中，以最大化蛋白表达量。使用无血清培养基可减少重组抗体制备物中的污染蛋白，有助于降低后续结合实验中的背景干扰。回收的抗体通过ELISA法对原始tau多肽组进行筛选，并根据反应性评分（图4）。以OD值高于背景0.5作为初始阈值，判断为抗原阳性反应；β-actin蛋白用作非特异性结合的对照。如果流式细胞术及分选步骤使用的是混合多肽池，则筛选ELISA是解析回收IgG特异性反应的第一步。在检测的10种IgG中，有3种对磷酸化的CBTAU22.1多肽表现出反应性，1种对非磷酸化的CBTAU27.1多肽有反应性（图4A）。进一步通过相同重组抗体样品对初筛中鉴定出的多肽以及一个额外的阴性对照多肽进行浓度梯度实验，以进行额外验证（图4B）。对于每个阳性结果，均从转化后的菌池中分离出单个质粒克隆，并通过相同的ELISA方法重新验证。本文仅展示了克隆34的数据，结果显示其对非磷酸化的CBTAU27.1多肽的反应性得到确认，但也观察到其对磷酸化的27.1多肽存在较低亲和力的结合（图4C）。
<img alt="分析淋巴细胞、DAPI 染色、CD19-IgG、CD27 标记物及 tau 肽的流式细胞术图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过流式细胞术分离抗原反应性单细胞。（A）显示一个代表性图谱，其中淋巴细胞群位于划定的门控区域内。（B）根据前向散射与侧向散射（FSC-高度 对 FSC-宽度（R3）；SSC-高度 对 SSC-宽度（R4））设置门控以排除双联体。仅门控区域内的细胞进入后续图谱分析。DAPI+ 细胞被视为死亡细胞并予以排除（R5）。本实验中共检测了 3.7 × 107 个“活”细胞。活细胞中大部分为B细胞（CD19+），从中分离出IgG+细胞（占4.66%）（R6）。CD27+表达的记忆细胞中信号最强的前43.2%被纳入筛选门控（R7）。（C）象限2（Q2）包含对两种标记抗原均有反应的细胞（肽-APC 对 肽-PE），这些细胞被分选并单独回收至96孔板中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抗体表达载体构建示意图，PCR，连接，轻链/重链，基因工程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过 PCR 扩增回收 IgG 重链和轻链可变区序列用于克隆。（A）使用巢式 PCR 反应回收重链（VH）和轻链（Vk 或 Vl）的可变区。第一步引物从前导序列起始正向扩增，从恒定区内部起始反向扩增。多个箭头代表一组包含 7–12 个引物的混合物，用于确保对可能的种系序列实现广泛覆盖。第二步引物为巢式引物，特异性结合可变开放阅读框的两端，并在扩增子末端添加与表达载体中相邻序列同源的序列。（B）连接片段包含恒定轻链（Ck 或 Cl），随后是重链启动子和一个非天然的信号肽序列。扩增子、连接片段和质粒骨架通过第二步 PCR 扩增产生的重叠同源序列同时进行连接，并作为完整的质粒被分离出来。最终表达载体中的重组重链和轻链由独立（且相同）的 CMV 启动子驱动，翻译为两种独立的蛋白质。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA分离的电泳结果；含有分子量标记物的凝胶泳道，大小为400-500 bp。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：从单个细胞中回收IgG重链和轻链可变区扩增产物。嵌套PCR反应（第二步）直接上样至1%琼脂糖凝胶并进行可视化检测。来自同一细胞的重链（H）和κ轻链（L）PCR产物分别加样于相邻泳道，以便于观察成对的扩增产物。成功的重链和轻链扩增产物大小分别约为400 bp和350 bp。成功回收的成对扩增产物以（*）标示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Tau 肽反应性筛选；ELISA 图表；IgG 克隆分析；OD450 与 IgG 浓度关系" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59809/59809fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图 4：通过重组 IgG 确认抗原特异性。 将含有回收的重链和轻链序列的质粒转染至HEK细胞中进行表达。四天后，通过ELISA评估重组抗体的反应性。A澄清的培养基中的IgG浓度被测定并稀释至 20 µg/mL用于分选的肽段混合物在链霉亲和素包被的酶标板中以每孔40 pmol的量进行单独评估。所有IgG均在复孔中进行检测。B) 显示 OD450 测量值的克隆 &gt;0.5 的克隆（克隆编号 #32、#34、#35）使用筛选中鉴定出的肽段，以 1:5 的稀释梯度重新评估。C确认为阳性结果后，从第34号克隆的转化连接产物中分离单个质粒克隆，进行转染，并通过ELISA重新验证。对第32号和第35号克隆进行了相同操作（数据未显示）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59809/59809fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

通过流式细胞术结合单细胞PCR与克隆技术，BSelex方法可用于从人外周血单个核细胞中鉴定并回收特异性抗原抗体。

从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法

人类抗体库代表了一个尚未被充分开发的潜在治疗性抗体和有用生物标志物的来源。尽管当前的计算……

本方案具有重要意义，因为它可用于分析人类供体的免疫组库，以鉴定稀有的抗原特异性B细胞。该技术使我们能够获得天然配对的重链和轻链，这些序列可被快速克隆，并直接用于针对目标抗原或多种抗原进行检测。本实验操作将由本实验室的技术员 Mike Morton 进行示范。解冻并复苏后至少一小时，通过离心收集供体外周血单个核细胞（PBMC）。将细胞重悬于50毫升冰上预冷的MES缓冲液中进行计数。再次离心形成细胞沉淀，然后根据标准操作流程，使用CD22磁珠通过阳性选择法分离CD22阳性B细胞。通过离心收集磁珠分离的CD22阳性细胞，并将细胞重悬于Vax缓冲液中，浓度为每毫升4 × 10⁷个细胞。根据生产商推荐的稀释比例，向细胞中加入IgG CD19 CD27抗体混合物，轻轻混匀，并将10⁷个细胞分装至1.5毫升微量离心管中作为阴性对照。向阴性对照管中加入双标记的生物素-链霉亲和素四聚体复合物，每种四聚体终浓度为36 nmol/L，并根据分选管中肽段的数量乘以PE和APC标记的浓度。用新鲜的Vax缓冲液将每管的终体积补至2.5毫升，并向分选管中加入PE和APC标记的肽四聚体，每种终浓度为36纳摩尔。离心后，将细胞重悬于100微升TBS缓冲液中，细胞浓度为2×10⁶，于4°C避光、旋转孵育30至60分钟。孵育结束后，用新鲜TBS缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后将样品滤入各自的5毫升带滤网帽的试管中。使用终浓度为 0.3 微摩尔的 DAPI 对样品进行染色，作为细胞膜完整性的标记。将整个阴性对照样本上样至细胞分选仪，以设定流式细胞术门控，用于分离适合单细胞分选的细胞群体。绘制抗原 PE 与抗原 APC 的散点图，并将 R8 门设定为抗原 PE 阳性且 APC 阳性的象限，双阳性门中的事件数应较少。随后，将单个CD19阳性、CD27阳性、抗原PE阳性、抗原APC阳性的细胞分选至已预先加入主混合液的96孔板的各个孔中。分选结束后，用铝箔封板膜覆盖板孔，并在400 × g条件下离心1分钟，随后于-80 °C保存。进行逆转录反应时，先将分选后的B细胞置于冰上解冻2分钟，然后以3300 × g离心2分钟，使孔内液体沉降至板底，再打开封膜。用适当的酶Master Mix处理细胞后，每个PCR反应中加入2.5微升互补DNA作为模板，并加入引物使每个反应的终浓度达到1微摩尔。然后，向每个反应孔中加入2倍浓度的10倍聚合酶缓冲液，使每个反应的终体积达到25微升。随后，重链和轻链PCR反应均进行50个循环。反应结束后，将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，以观察阳性扩增结果。通过凝胶回收法从同一细胞中分离配对的重链和轻链扩增产物。通过光密度测定DNA片段浓度至60，以准确计算连接反应体系。按照制造商的说明，使用四片段连接反应将回收的重链和轻链片段与连接子片段及表达载体骨架进行连接。然后按照制造商的说明，将连接反应产物转化至感受态细菌中。接种至含抗生素的平板后，向剩余的转化菌液中加入四毫升含抗生素的培养基，在37摄氏度、每分钟250转的条件下过夜培养。第二天早晨，根据试剂盒说明书，从过夜连接反应的菌液中制备质粒DNA小量提取物，并测定所得质粒DNA的浓度。为验证所分离抗体的抗原特异性，将10微克质粒DNA提取物与阳离子脂质转染试剂共同转染至含有293细胞的10毫升悬浮液中。将细胞培养物在37摄氏度、8%二氧化碳及125转/分钟的条件下孵育3至4天。孵育结束后，将培养物在1000 × g条件下离心10分钟，收集澄清的上清液。通过蛋白A亲和法测定上清液中的IgG浓度，并根据标准ELISA操作流程，使用上清液中浓度为25 µg/mL的抗体，针对分选时所用的各个肽段进行ELISA检测。随后，通过额外的ELISA实验验证初筛阳性结果，对IgG上清液进行系列稀释，起始浓度为20 µg/mL，绘制针对各抗原的浓度-吸光度曲线，以确认其在初筛ELISA中的反应性。为了从人类供体中分离抗原特异性抗体，可设计一系列流式细胞术门控策略以分离目标记忆B细胞。首先根据细胞大小和颗粒度，利用前向散射和侧向散射分离淋巴细胞。在排除双联体细胞和死细胞后，通过表型标志物进一步区分IgG阳性CD19阳性B细胞和CD27阳性记忆B细胞。单细胞克隆的首次检测结果是确认相应重链和轻链可变区的扩增情况。此处展示了一个从24个单细胞中进行高效扩增的示例，PCR后配对回收率为42%。在完成IgG克隆后，将IgG表达载体转染至人胚胎肾293细胞中。回收的抗体通过ELISA法对原始Tau多肽组进行筛选，根据反应性进行评分。随后，使用相同重组抗体样品对初筛中鉴定出的多肽进行浓度梯度实验，以进一步确认结果。对于每个阳性信号，可从转化后的文库中分离出单个质粒克隆，并通过相同的ELISA方法重新验证。目标是从单个细胞扩增序列，因此需要牢记的最重要事项是，任何污染都会在此实验的PCR步骤中被扩增。该实验流程可获得完整的人源重组抗体，从而能够纯化并进行功能表征，抗体产量可根据需要任意制备。

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