Name: 성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 성인 인간 뇌 조직에서 자유 부동 슬라이스 배양을 준비하는 간단하고 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 신경퇴행 메커니즘 연구와 생화학 및 면역조직화학 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 FAPESP에 의해 지원된다 (그랜트 25681-3/2017 에 AS), CAPES (박사 후 펠로우십 PNPD / INCT-HSM A.F.와 N.D.M.에 박사 전 펠로우십) 및 FAEPA. G.M.A.는 FAPESP (MS 2018/06614-4)에서 석사 펠로우십을 보유하고 있습니다. N.G.C.는 CNPq 연구 펠로우십을 보유하고 있습니다. 우리는 이 연구 결과에 대한 절제된 조직을 기증해 준 환자와 그들의 가족에게 감사드립니다. 우리는 리베이라오 프레토 의과 대학, 상파울루 대학의 임상 병원에서 주민, 간호사, 기술자 및 CIREP 팀의 지원을 인정하고 싶습니다.

살아있는 성인 뇌 조직은 약전성 측두엽 간질치료를 위한 용단신경외과를 받은 환자로부터 수득하였다(도1A). 모든 절차는 리베이라오 프레토 의과 대학 (17578/2015)의 클리닉 병원에서 윤리위원회의 승인을 받았으며 환자 (또는 법적 책임자)는 정보에 입각한 동의 조건에 동의하고 서명했습니다. 조직의 수집은 간질 외과 센터에서 신경 외과 팀에 의해 수행되었다 (CIREP - 리베라오 프레토 의과 대학에서 클리닉 병원, 상파울루 대학, 브라질).
1. 재료의 살균
참고: 모든 재료와 용액은 사용하기 전에 멸균해야 합니다.
<ol><li>모든 수술 도구와 진동 슬라이스 재료 (나이프 홀더, 시편 디스크, 버퍼 트레이)를 180 °C에서 4 시간 동안 건식 살균 오븐에서 살균하십시오.</li>
	<li>UV 또는 감마 조사에 의해 온도에 민감한 물질 또는 장비를 살균하십시오.</li>
	<li>0.22 μm 기공 멤브레인을 통해 오토클레이브 또는 여과하여 매개체 및 용액을 살균합니다.</li>
</ol>2. 솔루션 준비
<ol><li>수송 용액의 15-20 mL 준비: 50% v/v Hanks의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS) pH 7.4, 50% v/v 기저 배지 산후 및 성인 뇌 뉴런 유지 보수(재료 표),10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- 피페라진에탄설포닉산(헤페스), 3 mg/mL 포도당, 33 μg/mL 겐타미신. 참고: 운송 용액은 시료 채취 최소 20분 전에 냉장 및 산소(카보겐 가스로 버블링)해야 합니다.</li>
	<li>300 mL의 슬라이스 용액 (HBSS는 10 mM HEPES 및 3 mg / mL 포도당으로 보충)을 준비하고 초기 결정 형성 지점까지 냉동고에서 식힙니다.</li>
	<li>배양 배지 20 mL 준비: 산후 및 성인 뇌 뉴런 유지를 위한 기초배지(재료표)1% L-글루타민 유도체(재료표),신경 배양용 2% 보충제(표 재료),1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B.</li>
</ol>3. 슬라이스 장치 설정
참고 : 이 프로토콜은 수술실에서 샘플 수집의 물류로 인해 동료의 도움으로 이상적으로 수행됩니다.
<ol><li>소금 첨가 얼음 양동이에, 슬라이스 용액을 사용 하기 전에 적어도 20 분 동안 carbogen 혼합물 버블링 (95% O2,5% CO2)에서휴식 하자.</li>
	<li>아가로즈 3% 블록을 준비하고(약 2 cm x 2 cm x 2 cm) 및 진동기 시편 디스크에 슈퍼접착제를 사용하여 슬라이스 시중 시료에 추가적인 기계적 지지체를 생성한다(도1E).</li>
	<li>슬라이스를 위한 진동 설정: 단면 두께 200 μm, 진동 주파수 100Hz, 슬라이스 속도 0.5-1.0 mm/s.</li>
	<li>진동 완충트레이를 진동 기저에 고정하고 얼음을 추가하여 슬라이싱 용액과 시료를 받기 전에 냉장 보관하고 슬라이싱 절차 전반에 걸쳐 보관합니다.</li>
</ol>4. 샘플 수집
참고 :이 프로토콜에서, 인간의 신피질 조직은 수술실에서 수집되어 실험실로 이송되었습니다.
주의: 인간 샘플을 다룰 때, 기관이 수립한 적절한 안전 프로토콜을 따르십시오.
<ol><li>가스 출력을 수송에 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력을 제어하는 압력/플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물이 있는 휴대용 가스 실린더로 구성된 운송장치(그림 1C)를설정합니다. 용기; 수송 용기, 일반적으로 수송 용액을 포함하는 가스 입력을 위한 천공 된 뚜껑을 가진 50 mL 원점 원심 분리기 튜브; 및 운송 중 시료 냉각을 위한 얼음.</li>
	<li>시편을 수집하고운반합니다(그림 1B)를즉시 실험실로 이송합니다. 차가운 수송 용액에 표본을 잠수하십시오 (지속적으로 카보겐 혼합물로 거품을 낸다).</li>
</ol>5. 슬라이스
<ol><li>시편을 슬라이스 용액을 함유한 페트리 접시(100 mm x 20 mm)로 옮기고, 미세한 수술 도구로 시료에 남아있는 수막의 가능한 한 많이 조심스럽게 제거한다(그림1D).</li>
	<li>실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생산하기위한 최적의 시편 방향을 선택하고, No. 24 메스 블레이드와 함께, 편평한 표면을 다듬어 시편 디스크에 접착된 베이스가 될 수 있습니다.</li>
	<li>일회용 플라스틱 숟가락과 섬세한 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 필터 용지를 사용하여 여분의 용액을 건조하십시오 (모세 혈관에 의해 건조되고 종이로 조직 조각을 만지지 마십시오).</li>
	<li>수퍼글루를 사용하여, 디스크에 단단히 부착되고 아가로즈 블록과 접촉할 때까지 조직을 진동 시편 디스크에 부착한다(그림1E).</li>
	<li>전체 공정 중에 버블링해야 하는 슬라이싱 용액으로 채워진 진동 버퍼 트레이에 진동 시편 디스크(조직이 제대로 부착된)를 놓습니다.</li>
	<li>면도날을 단단히 고정하여 칼 홀더를 제자리에 고정시고 고정합니다.</li>
	<li>슬라이싱 용액은 시편과 블레이드를 모두 덮어야 하며, 슬라이스를 시작한다음(그림 1F)에서만슬라이스를 시작해야 합니다.</li>
	<li>시편을 200 μm 슬라이스로 자른다. 참고: 일부 진동체는 시편을 자동으로 잘라내지만, 공정 중 슬라이싱 속도를 면밀히 관찰하고 약간의 조정을 하면 더 나은 슬라이스를 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 초기 불규칙한 슬라이스를 버립니다.</li>
	<li>버퍼 트레이에서 슬라이스를 슬라이스 용액으로 페트리 접시로 옮기고 느슨한 가장자리와 여분의 흰색 매더를 약 70 % 피질 / 30 % 백색 물질의 비율로 다듬습니다.</li>
</ol>6. 문화
참고: 멸균 환경에서 층류 캐비닛에서 이 단계를 수행합니다.
<ol><li>웰당 배양 배지 600 μL(24웰 플레이트)을 첨가하고 슬라이스를 도금하기 전에 36°C 및 5%CO2에서 적어도 20분 동안 배양한다.</li>
	<li>페인트 브러시를 사용하여 잘 당 하나의 슬라이스 를 접시(그림1G).</li>
	<li>플레이트에 사용하지 않은 우물이 있으면 400 μL의 멸균수로 채우십시오.</li>
	<li>플레이트를 36 °C, 5 %CO2에서배양합니다. 참고 : 슬라이스의 크기에 따라 도금 후 8-16 시간 사이에 첫 번째 중간 교체가 이루어져야합니다.</li>
	<li>보충 10 이전에 준비 된 배양 매체의 mL 50 ng/mL 뇌 파생 신경 영양 인자 (BDNF). 참고 : 처음 8-16 시간 동안, 슬라이스는 이 단계에서 중간 소비가 가속화되기 때문에 영양 부족과 산성화를 피하기 위해 600 μL의 배지로 배양됩니다. 다음 단계에서, 웰당 배지의 부피는 400 μL로 조정된다.</li>
	<li>각 우물에서 컨디셔닝된 배지의 333 μL을 제거하고 신선한 BDNF 보충 배지 133 μL을 첨가합니다.</li>
	<li>24시간마다 컨디셔닝된 배지의 1/3을 신선한 BDNF 보충 매체로 교체하여 중간 교체 과정을 반복합니다.</li>
</ol>7. 배양된 슬라이스의 건강, 형태 및 기능 평가
참고: 대표적인 결과에 예시된 목적으로 세포 사멸을 유도하기 위해, 일부 슬라이스는 산화 스트레스 유도제H2 O2를사용하여 24시간 치료에 제출되었다. 단계 7.1.2 및 7.1.3은 세포 사멸을 유도하기 위해H2O2의 사용을 설명한다.
<ol><li>세포 생존력 참고 : 도전 슬라이스 배양에서 신경 독성 / 신경 보호를 평가하는 간단하고 간단한 방법은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테틀라졸륨 (MTT) 분석법36,대사 활성 세포의 비율을 측정합니다. 처리된 샘플과 비교하여 정상 조건에서.<ol>
<li>층상 흐름 캐비닛에서 매질의 3 분의 1을 신선한 매체로 교체하십시오.</li>
		<li>30% H2O2 스톡 솔루션에서 웰당H2O2의 부피를 추가하여 의도한 최종 농도(30 mM 또는 300 mM)에 도달합니다. 참고:H2O2는 도전 하기 전에 신선한 영양소의 적절 한 공급을 보장 하기 위해 매체의 일일 변경 후 추가 되었습니다.</li>
		<li>36 °C, 5 %CO2에서24 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 참고:H2O2 처리(또는 관심 있는 다른 독성 자극) 후, 다음 단계는 MTT 분석에 의한 세포 생존성 측정을 기술한다.</li>
		<li>40 μL의 MTT 용액을 플레이트의 각 우물에 0.5 mg/mL의 최종 농도에 추가합니다.</li>
		<li>플레이트를 36°C, 5%CO2에서 3시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>인산염 완충 식염수 (PBS)로 슬라이스를 씻고 마이크로 튜브로 옮니다.</li>
		<li>파이펫팅을 하여 남은 용액을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
		<li>각 슬라이스의 질량을 결정하기 위해 슬라이스를 포함하는 마이크로 튜브의 무게를 측정합니다 (이것은 얻은 흡광도 판독값을 정규화하는 열쇠입니다). 참고: 필요한 경우, 시료를 나중에 처리하기 위해 이 단계에서 냉동(-20°C)할 수 있습니다.</li>
		<li>전동 유봉을 사용하여 이소프로판올/HCl 200 μL의 슬라이스를 균질화합니다.</li>
		<li>2600 x g에서2 분 동안 실온 (RT)에서 원심 분리기.</li>
		<li>상한체를 수집하고 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>KCl 유도 신경 탈분극 참고: 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 인산화는 캐스케이드 단백질 ERK를 시그널링하고, 이어서 서쪽 블로팅, KCl 유도 탈분극에 대한 뉴런 반응의 정량화에 사용될 수있다 37.<ol>
<li>유량 캐비닛에서 배양 배지를 이전에 36°C로 평형화한 HBSS의 300 μL로 교체하십시오.</li>
		<li>HBSS를 이전에 36°C로 평형화한 300 μL의 신선한 HBSS로 교체하십시오.</li>
		<li>플레이트를 36°C, 5%CO2에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>HBSS를 신선한 HBSS 또는 80 mM KCl 탈분극 용액(36°C)으로 교체하고 36°C, 5%CO2에서 15분 동안 배양합니다.</li>
		<li>접시에서 마이크로튜브로 슬라이스를 옮김을 옮김. 이 단계에서, 슬라이스는 나중에 처리를 위해 -20°C에서 저장될 수 있다.</li>
		<li>150 μL의 방사성 면역 침전 분석 분석 (RIPA) 완충액에서 조직 추출물을 준비하십시오 (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% 요노닉 계면 활성제; 0.1% 나트륨 도데실 황산염; pH 7.5). 원심분리기 추출물은 4°C에서 16000 x g에서10분 동안, 상급체를 수집하고, 브래드포드 방법을 사용하여 총 단백질 농도를 결정한다.</li>
		<li>총 단백질 30 μg를 12% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동(SDS-PAGE)에 로드합니다.</li>
		<li>전기 동동 후, 겔 함량을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮김.</li>
		<li>TBS플러스 0.1% 트웬에 5% 무지방 건조 우유로 막을 차단한 후, 4°C에서 16시간 동안 마우스 안티-pERK(1:1,000)로 배양하였다. 세척 후, 토끼 안티 ERK1/2 (1:1,000)로 RT에서 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
		<li>1 시간 동안 RT에서 적절한 HRP-컨쥬게이트 이차 항체와 배양.</li>
		<li>바람직한 HRP 기판으로 공개한다.</li>
	</ol></li>
	<li>형태학적 평가 참고 : 세포 생존 및 기능 적 평가 외에도 조직 형태를 분석하는 것이 중요합니다. 배양된 슬라이스를 절제하는 것은 형태학적 분석을 위해 가능한 한 많은 고품질 의 재료를 생산하는 중요한 단계라는 점에 유의하십시오.<ol>
<li>슬라이스 고정, 냉동 보호 및 절제<ol>
<li>배양 배지가 있는 우물에서 PBS를 포함하는 새로운 24개의 웰 플레이트로 슬라이스를 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김.</li>
			<li>PBS를 제거하고 4% 파라포름알데히드(PFA)의 1 mL을 추가합니다. PFA를 추가하기 전에 슬라이스를 평평하게 유지하는 것이 중요합니다. 4 °C에서 밤새 배양.</li>
			<li>조심스럽게 PFA 용액을 제거하고 30 % 자당 용액 1 mL을 추가하십시오. 4 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오.</li>
			<li>동결 마이크로토메를 -40°C로 설정합니다.</li>
			<li>슬라이스를 배치해야 하는 마이크로토메 스테이지에 자당 베이스를 준비합니다(그림2A). 그것은 완전히 동결하고 조심스럽게 슬라이스가 배치 될 평평한 표면을 생산하기 위해 냉동 자당의 일부를 잘라 보자.</li>
			<li>각 슬라이스를 늘어난 플라스틱 필름 위에 놓고 페인트 브러시를 사용하여 티슈를 평평하게 합니다.</li>
			<li>단 한 번의 이동으로 늘어난 슬라이스를 얼어붙은 자당 베이스로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김. 참고: 동결된 자당 베이스 위에 있으면 슬라이스를 이동할 수 없습니다. 이 전송 단계를 신중하게 수행합니다.</li>
			<li>슬라이스를 5-10 분 동안 놓아 두십시오.</li>
			<li>슬라이스를 30 μm 섹션으로 자른다.</li>
			<li>30 μm 섹션을 PBS가 들어 있는 페트리 접시로 옮니다.</li>
			<li>실험 설계에 더 적합한 신체 학 프로토콜로 진행하십시오. 참고 : 30 μm 섹션은 자유 부동 면역 조직 화학에 쉽게 사용할 수 있으며, 추가 조직학을 위해 현미경 슬라이드에 장착되거나 -20 °C의 부동액에 보관 할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>면역화학 참고: 면역성 화학 및 면역 형광 표준 프로토콜은 실험실마다 다릅니다. 여기에 사용되는 프로토콜의 자세한 버전은 Horta 등38을참조하십시오. 그림 2에 제시된 면역 염색에 사용되는 1차 항체에는 신경핵(NeuN), 건강한 성숙한 뉴런 마커, 신경교 섬유성 단백질(GFAP), 시세포 마커, 이온화된 칼슘 결합 어댑터(Iba-1), 및 마이크로글리아가 포함됩니다. 마커.<ol>
<li>슬라이스를 블로킹 용액(예를 들어, PBS에서 2% 정상 당나귀 혈청)에서 40분 동안 배양합니다.</li>
			<li>4 °C에서 온화한 교반의 밑에 1 차적인 항체로 밤새 배양하십시오.</li>
			<li>PBS로 세척한 후, RT에서 경증 교반하에 생체이식 이차 항체로 120분 동안 배양하였다.</li>
			<li>PBS로 세척한 후, 아비딘-퍼옥시다아제 컨쥬게이트(재료표)로RT에서 120분 동안 배양합니다.</li>
			<li>DAB + 0.04% 니켈 암모늄으로 공개하십시오.</li>
			<li>젤라틴 코팅 된 현미경 슬라이드에 스테인드 섹션을 장착하고 공기 건조시키십시오. 에탄올로 탈수하고, 자일렌으로 디아판화하고, 마운팅매체(재료 표)로마무리하고, 커버슬립과 화상으로 덮습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

자유 부동, 단기 슬라이스 배양을 생산하기위한이 프로토콜은 성인 인간 신피질 조각을 배양하기위한 대체 방법입니다. 슬라이스 배양에 대한 이러한 프로토콜은 광유전학1,44,45,전기 생리학2,3,4,5에 대한 연구에 적합할 수 있습니다. , 단기 가소성46,47,장기 가소성48,49,신경 독성 / 신경 보호<sup class="xr...

연구에서 인간 샘플의 사용은 명백하게 인간의 뇌 병리학을 연구할 수있는 좋은 옵션이며, 현대 기술은 환자 유래 조직을 사용하여 강력하고 윤리적 인 실험을위한 새로운 방법을 열었습니다. 성인 인간의 뇌에서 준비 된 organotypic / 슬라이스 문화와 같은 방법은 광유전학1,전기 생리학2,3,4,5,가소성과 같은 패러다임에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 6,7,8,9,신경 독성 / 신경 보호10,11,12,13,세포 치료14, 약물 스크리닝15,16,17,유전학 및 유전자 편집12,18,19,20,다른 사람의 사이에서, 더 나은 전략으로 성인기 동안 신경 질환을 이해.
인간의 뇌 병리의 근본적인 메커니즘의 이해는 많은 수의 과목을 필요로하는 실험 전략에 달려 있습니다. 반대로, 슬라이스 배양의 경우, 인간 샘플에 대한 접근은 여전히 어렵지만 단일 피질 샘플에서 최대 50 개의 조각을 생성 할 가능성은 부분적으로 증가하여 여러 자원 봉사자를 모집하는 요구 사항을 우회합니다. 수집된 조직당 복제 및 수행된비수치(21).
뇌 organotypic / 슬라이스 문화에 대한 몇 가지 프로토콜은 고전 oculo 초안22,23에서 롤러 튜브24, 25,26,반 투과성 멤브레인에 이르기까지 설명되었습니다. 인터페이스27,28,29,30, 자유 부동 슬라이스31,32. 실험 설계의 특수성에 따라 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 성인 인간의 뇌에서 단기, 자유 부동 슬라이스 배양은 경우에 따라 Stoppini 등27에의해 사용되는 방법에 비해 유리하다, 사실 고려하면 시험관내에서 장기 세포 생존은 일반적으로 평가 할 때 주요 관심사입니다 배양 방법은, 많은 실험에서 배양에서 짧은 기간만 이들에게12,31,32,33,34,35가필요하다. 이러한 조건하에서, 자유 부동 배양의 사용은 2-3 주 동안 배양에 보관 된 조각보다 원래의 인간 조직 상태를 보다 정확하게 닮은 더 간단하고 비용 효율적인 장점을 제시한다.
신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간의 과목에서. 이 문서는 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학 및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차는 상세히 설명되어 있다. 이 프로토콜은 성인기에 연결된 신경 병리학의 메커니즘에 대한 조사에서 생존력과 신경 기능을 분석하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.

<table><tbody><tr><td>2-프로판올</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스-아크릴아미드, 30% 용액</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3449&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>항체 anti-ERK 2 (rabbit)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-154</td><td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td></tr><tr><td>Antibody anti-pERK (mouse)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-7383</td><td>Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x 염료 시약</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>RIPA 완충액에 사용</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salts</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide (H2O2)</td><td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG, HRP linked whole Ab (anti-mouse)</td><td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>RIPA 완충액에 사용</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유(Molico)</td><td>Nestl&eacute;</td><td></td><td>멤브레인 차단에 사용</td></tr><tr><td>PBS 완충액 pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomicin</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>프라임 웨스턴 블로팅 감지 시약</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>토끼 IgG, HRP 연결 전체 Ab(토끼 방지)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td><td>RIPA 완충액에 사용됨</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>GE</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T-1378</td><td>RIPA 완충액에 사용됨</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>RIPA 완충액에 사용됨</td></tr><tr><td>초순수</td><td>Millipore</td><td></td><td>MiliQ 정수 시스템에서 파생된 멸균수</td></tr><tr><td>Equipment and Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Flat Bottom with</td></tr><tr><td>Lid Amersham Potran Premium (니트로셀룰로오스 막)&nbsp;</td><td>GE</td><td>29047575</td><td></td></tr><tr><td>탄화물 혼합물</td><td>화이트 마틴</td><td></td><td>95% O2, 5% CO2</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>뉴브런즈윅 사이언티픽</td><td>CO-24</td><td>슬라이스 5% CO2, 36&ordm의 인큐베이션; C</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>1,5mL 마이크로튜브</td></tr><tr><td>전동 유봉</td><td>킴블 체이스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 숟가락</td><td></td><td></td><td>디저트 숟가락의 크기</td></tr><tr><td>면도날</td><td>Bic</td><td></td><td>Chrome Platinum, 비브라톰</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>로 자르는 데 사용Becton Dickinson (BD)</td><td>Number 24</td><td>조직의 슬라이싱에 사용됨; 권장 같은 크기 또는 더 작은</td></tr><tr><td>Superglue (Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>구성: Etilcianoacrilato; 2-프로펜산; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; 호모폴리머</td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>라이카</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Immunohistochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody anti-NeuN (mouse)</td><td>Millipore를</td> 위한 재료/장비의 이름&nbsp;<td>MAB377</td><td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (mouse)</td><td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Antibody anti-IBA1 (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse IgG 항체 (H+L)</td><td>Vector</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>합성 00G1002.02.AE</td><td></td><td>슬라이드 코팅에 사용</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>동결 스테이지 (BFS-10MP, Physiotemp) 장착, -40&ordm으로 설정; C</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG, HRP 연계 whole Ab (anti-rabbit)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Star Frost)</td><td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Gelatin coated slides</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard)</td><td>Vector</td><td>PK-4000, 키트 표준</td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>신디사이</td>저 <td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, 또는 슬라이스 문화, 널리 생체 외에서 작동 하는 중추 신 경계의 측면을 모델링 하기 위해 사용 되었습니다. 신경 과학에 슬라이스 문화의 잠재력에도 불구 하 고, 이러한 문화를 준비 하는 성인 신경 조직을 사용 하 여 연구는 여전히 부족, 특히 인간 과목에서 그. 슬라이스 배양을 준비하기 위해 성인 인간 조직의 사용은 설치류에서 생산 된 조각 (일반적으로 신생아)에서 생산 된 성숙한 인간의 뇌의 전형적인 독특한 특성을 보유하기 때문에 인간의 신경 병리학에 대한 이해를 향상시키는 데 특히 매력적입니다. 신경 조직. 이 프로토콜은 단기, 자유 부동 슬라이스 문화를 준비하기 위해 절제 뇌 수술에 제출 살아있는 인간 기증자에서 수집 된 뇌 조직을 사용하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양을 사용하여 생화학및 세포 생물학 분석을 유지하고 수행하는 절차도 제시된다. 대표적인 결과는 전형적인 인간 피질 적층이 시험관내(DIV4)에서 4일 후에 슬라이스로 보존되고, 주요 신경 세포 유형의 예상 존재와 함께 입증된다. 더욱이, DIV4의 슬라이스는 독성자극(H2O2)에도전할 때 강력한 세포 사멸을 겪으며, 이는 세포 사멸 법제에서 플랫폼역할을 하는 이 모델의 잠재력을 나타낸다. 이 방법은, 막 삽입을 사용하여 널리 사용되는 프로토콜에 대한 간단하고 비용 효율적인 대안, 주로 연령과 관련된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명하기위한 단기 분석법을 실행하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 프로토콜은 약리성 측두엽 간질의 외과 적 치료에 제출 된 환자에서 수집 된 피질 조직을 사용하는 데 전념하지만, 다른 뇌 영역 / 조건에서 수집 된 조직도해야한다고 주장한다. 유사한 자유 부동 슬라이스 문화원을 생성하는 소스로 간주됩니다.

배양된 슬라이스의 품질 및 건강을 평가하는 중요한 양상은 예상되는 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재 및 전형적인 형태이다. 인간 피질 적층의 전형적인 구조는 DIV4에서 슬라이스에서 관찰되었고, 뉴런 면역 표지에 의해밝혀졌다(도 2D). 또한, 마이크로글리아 및 아스트로글리아의 예상존재(도 2B,C)도관찰되었다. 이러한 결과는 조직 구조가 외과 적 절차 / 샘플 처리 또는 시험관 내 단기 기간에 의해 크게 영향을받지 않는다는 것을 보여줍니다. 이전 연구 결과에 따르면, NeuN 면역 반응성은 DIV0 및 DIV432사이에서 변경되지 않은 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, 슬라이스의 감소된 두께에 연관된 자유 부동 배양 형식(멤브레인 삽입이 사용될 때 널리 사용되는 300-400 μm에 비해), 내부 ...

성인 인간의 뇌에서 자유롭게 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜이 제시된다. 상기 프로토콜은 멤브레인 인서트를 이용한 널리 사용되는 슬라이스 배양 방법의 변형이다. 그것은 간단 하 고, 비용 효율적인, 그리고 단기 측정 을 실행 하기 위한 권장 연령 관련 된 뇌 질환 뒤에 신경 변성의 메커니즘을 해명 하는 것을 목표로.

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

우리는 절제된 두뇌 수술에 제출된 살아있는 인간 기증자에게서 집합된 두뇌 조직에서 자유로운 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양은 생화학 및 세포 생물학 분석 또는 면역 히스토케를 수행 할 수 있습니다. 그것은 관련 된 뇌 질환에 신경 변성의 기본 메커니즘의 해명에 기여할 것으로 예상 된다.이 기술의 주요 장점은 멤브레인 삽입을 사용하여 고전적인 슬라이스 배양 프로토콜에 대한 보다 간단하고 비용 효율적인 대안이라는 것입니다. 전반적인 프로토콜은 복잡하지 않지만, 수막 제거, 진동편 디스크에 조직을 접착, 면역조직화학에 대한 절제 와 같은 몇 가지 단계는 시각적으로 입증될 때 가장 잘 이해된다. 이 절차를 시연하는 데 도움이 되는 것은 졸업생인 닐 멘데스와 글라우샤 알메디아, 또 다른 졸업생인 조반나 노게이라입니다.이 절차를 시작하려면 얼음 양동이에 소금을 추가합니다. 슬라이스 용액을 이 양동이로 옮기고 사용 전에 적어도 20분 동안 카보겐 혼합물버블링 아래에 놓아 둡니다. 다음으로, 2센티미터x2센티미터에 달하는 3%의 아가로즈 블록을 준비한다.수퍼 접착제아가로스 블록을 진동기시편 디스크에 접착제로 하여 슬라이스 하는 동안 조직 샘플에 추가 기계적 지원을 생성한다. 진동에서 단면 두께를 200 마이크로미터로 설정하고 진동 주파수를 100 헤르츠로 설정하고 초당 0.5 ~1.0밀리미터 사이의 슬라이스 속도를 선택합니다. 그런 다음 진동 용액과 시료를 받기 전에 및 슬라이스 절차 전반에 걸쳐 냉장 보관하기 위해 진동 완충 트레이를 진동 베이스에 잠그고 얼음을 추가합니다.먼저, 수송시 시 시냉각을 위한 수송용 용액및 얼음을 포함하는 수송용기 및 수송용기에 가스 출력을 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력을 제어하는 압력 플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물을 포함하는 휴대용 가스 실린더로 구성된 운송 장치를 설치한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본및 전송을 수집하고 전송합니다. 시편을 슬라이스 용액이 함유된 페트리 접시로 옮기습니다.미세 한 수술 도구를 사용 하 여, 신중 하 게 가능한 한 나머지 수막의 많은 제거. 실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생산하기위한 최고의 표본 방향을 선택하고 표본 디스크에 접착 될 베이스로 평평한 표면을 트리밍하는 숫자 24 메스 블레이드를 사용합니다. 폐기 플라스틱 숟가락과 섬세한 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 필터

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E18 랫 두뇌의 Organotypic 슬라이스 문화

우리는 쉽게 다른 뇌 영역 적용할 수 있습니다 organotypic hippocampal 조각을 준비하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각이 인터페이스를 형성하기 위해 허용되는 구멍이 세포막과 문화 미디어에 누워있다. 이 방법은 최대 문화에 이주하는 해마의 매출 구조를 유지합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화

이 프로토콜은 주동이의 철새 스트림에서 출생 후의 두뇌와 neuroblast 마이 그 레이션의 고해상도 시간 저속 영상에 최적화된 organotypic 슬라이스 분석을 설명합니다.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

이 비디오는 성인 인간의 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양을 준비하는 기술을 보여줍니다. 얇은 조각은 비브라톰을 사용하여 뇌 섹션에서 생성됩니다. 그런 다음 이러한 절편은 조직 생존력을 유지하기 위해 성장 인자로 보충된 배양 배지에 현탁됩니다.

성인 인간 뇌에서 자유 부유 슬라이스 배양 준비

이 비디오는 교모세포종 조직에서 유기형 절편 배양의 생성 및 유지를 보여줍니다. 분리된 조직은 아가로스 매트릭스에 내장되고 얇은 절편은 비브라톰을 사용하여 얻습니다. 그런 다음 이러한 절편을 마이크로플레이트 내의 투과성 멤브레인 삽입물에 놓고 장기 유지 관리를 위해 슬라이스 배양 유지 매체에서 배양합니다.

인간 교모세포종 조직으로부터 Slice 배양 생성 및 유지

이 논문에서는 절단에 대한 특별한 수정(예: 자당 첨가) 없이 절단 준비 전에 동물의 심내 관류 없이 기존의 생리학적 용액을 사용하여 생리학적 온도에서 급성 뇌 절편을 준비하는 방법을 보여줍니다.

슬라이스 뜨거운 것이 : 생리적 온도에서 급성 성인 뇌 슬라이스

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Organotypic hippocampal 슬라이스 문화 (OHSC) 아주 잘 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 체 외에서 모델을 나타냅니다. 여기 설명 vibratome 기반 소설 물질의 신경 가능성 또는 종양 세포의 생물학 행동 평가에 사용 하기 위해 고품질 슬라이스를 얻기 위해 프로토콜을 깔 끔 히 개선 합니다.

Organotypic Hippocampal 슬라이스 문화 연구 Neuroprotection 및 종양 세포의 침입을 모델로

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

이 프로토콜은 자발적인 날카로운 파도 잔물결 활동을 나타내는 마우스에서 수평 해마 내톨리날 피질 (HEC) 슬라이스의 준비를 설명합니다. 슬라이스는 단순화 된 인터페이스 보유 챔버에서 배양되고 기록은 조직의 산소화와 네트워크 수준의 활동의 자발적출현을 촉진하기 위해 빠르게 흐르는 인공 뇌척수액과 침수 된 조건에서 수행됩니다.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 전구체의 생체 외 피질 내 이식과 결합된 성인 인간 피질의 장기 기관형 배양을 설명하며, 이는 인간 신경퇴행성 장애에 대한 줄기 세포 기반 치료법을 추가로 테스트하기 위한 새로운 방법론을 제시합니다.

인간 줄기 세포 이식 및 검증을 위한 생체 외 모델로서의 성인 인간 피질의 기관형 배양

학습하세요 성인 인간 뇌 조직에서 자유 부동 슬라이스 배양을 준비하는 간단하고 비용 효율적인 방법을. 이 기술은 신경퇴행 메커니즘 연구와 생화학 및 면역조직화학 분석에 활용됩니다.

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

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