프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비
2020년 2월 19일
이 문서에서는 주변 질량 분석법을 기반으로 하는 고유한 실시간 분석 방법에 대한 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 방법을 사용하면 특별한 전처리 없이 생체 내 생물학적 분자를 실시간으로 분석할 수 있습니다.
따라서, 이것은 생체 외및 생체 내 둘 다 생물학 견본을 분석하기 위해 특히 적당한 유일한 주변 질량 분광법입니다. 이것은 세포 분류, 분별 및 농도와 같은 견본의 특별한 전처리를 정기적으로 요구하지 않기 때문에, 생물학 분대의 최소 손실, 특히 아주 작은 양으로 존재하는 견본을 분석할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 질량 분석법에 의해 1 분 안에 직접 원료를 분석 할 수 있습니다.
급속성은 시스템의 견고성에 방해가되지 않습니다, 이 기술에 내재된 주요 장점. 실리카, 10밀리그램의 조직 표본, 10마이크로리터의 증식을 준비하는 것만으로도 됩니다. 그리고 일회용 카트리지에 넣어.
PESI-MS 컴퓨터로 설정되며 몇 분 안에 결과를 얻을 수 있습니다. 적절한 질량 분광계를 선택함으로써 분자 정체성에 대해 고의할 수 있습니다. 시작하려면 냉동고에서 간 또는 신장 조직을 검색하십시오.
코르크 접시에, 메스 또는 칼을 사용하여 약 2 x 2 밀리미터에 조직 표본을 잘라. 또는 Trepan으로 샘플을 펀치하고 컬럼의 길이를 2밀리미터로 다듬습니다. 조직이 혈액으로 오염되면 얼음차가운 인산염 완충식식염으로 잠시 씻으실 수 있습니다.
약 10밀리그램의 절단 또는 펀치 아웃 샘플을 플라스틱 마이크로튜브에 넣고 50% 에탄올의 마이크로리터 100개추가 추가합니다. 미세 페젤을 사용하여 샘플을 균질화하십시오. 그런 다음 파이펫맨과 함께 질량 분광계의 카트리지 의 우물에 균주 10 마이크로 리터를 배치합니다.
직접 프로브 이온화 질량 분광계의 이온화 챔버에 카트리지를 배치하고 샘플 이온화에 사용되는 스테인레스 드 도루 바늘 프로브를 설치합니다. 챔버 뚜껑을 단단히 닫아 안전 장치를 자동으로 활성화합니다. 화면 패널을 사용하여 분석하기 위해 시작 아이콘을 클릭하여 온보드 컴퓨터를 시작하여 전자 스프레이를 생성하고 바늘의 주파수가 3 헤르츠인지 확인하기 위해 바늘에 2.3 킬로볼트의 전압을 적용합니다.
측정이 완료될 때까지 30초 동안 기다립니다. 각 샘플을 측정한 후, 생체 위험 처리기에서 카트리지와 바늘을 폐기하십시오. 질량 분광을 분석하려면 질량 분광계와 연결된 소프트웨어를 엽니다.
소프트웨어의 데이터 파일 브라우저 창에서 L-C-D 파일을 클릭합니다. 질량 스펙트럼 창의 단일 피크를 클릭하고 자동으로 E-I-C를 묘사합니다. T-I-C 및 E-I-C를 확인하고 평균 스펙트럼 아이콘을 클릭하여 질량 스펙트럼을 생성하는 시간 창 범위를 선택합니다.
질량 스펙트럼 텍스트 데이터를 내보냅니다. 체액을 분석하려면 혈청 샘플의 최대 10 마이크로리터를 끌어서 1.5 밀리리터 마이크로튜브로 분배합니다. 튜브에 50%에탄올190 마이크로리터를 추가한 다음 실온에서 2분간 소용돌이를 냅니다.
모든 적혈구를 제거하려면 액체를 섭씨 4도에서 1~5분 동안 15, 000회 G에서 원심분리합니다. 상체의 10 마이크로리터를 카트리지의 우물로 옮기고 이전과 같이 질량 분광계에 측정합니다. 이 프로토콜은 고체 샘플, 액체 샘플 및 살아있는 동물에 PESI-MS에 대한 샘플 준비를 보여줍니다.
인간 신장 세포 암은 중성 지질의 특징적인 봉우리를 보여줍니다. 주변 비암 조직에서 확인되지 않은 인간 신장 세포 암 조직에서 900의 질량 대 전하 비율에서 스펙트럼에 상대적으로 강한 피크가 있었다. 이 봉우리들은 주로 트리아실 글리세롤을 나타냅니다.
정상적인 간 조직에서 습득 한 데이터의 예는 만성 간염 및 간경변증환자로부터 신부균 병변을 묘사했습니다. 3명의 개별에게서 인간 혈청은 PESI-MS를 사용하여 분석되었다, 개별 중 스펙트럼 패턴에 있는 명확한 다름이 있었습니다. 5-FdU의 대사 변화를 위해 마우스의 꼬리 용기에 정맥주사를 주입하여, 나트륨 교덕을 가진 5-FdU의 매우 신속하고 민감한 검출이 그 안에 있는 간에서 달성되었다.
조직의 사이트에서 바늘 팁의 깊이로, 성공적인 데이터 수집을 읽는 이온화에서 가장 중요한 역할을, 지침을 따라야합니다. 상용 데이터베이스를 조사하여 분자 종을 식별할 수 있습니다. 이것은 질병의 분자 메커니즘을 자격을 갖추는 방법입니다.
많은 연구자들은 질병의 번영을 예측하기위한이 기술의 적용에 관심이있으며 예후입니다. 특히 Ricket 생검을 사용 하 여. 그냥 프로브 바늘에 의해 찌를 수 있는지 확인하십시오.
이것은 단순히 기계에서 바늘을 제거하기위한 특정 악기로 피할 수 있습니다.
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개요
본 논문은 생체 내(in vivo) 생물학적 시료의 실시간 분석을 위한 독특한 상온 질량 분석법을 소개합니다. 이 기술을 통해 특별한 전처리 없이도 가공되지 않은 조직 재료를 분석할 수 있으며, 생물학적 성분의 손실을 최소화할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 질량 분석법
- 생물학적 분석
- 분석 화학
배경
- 앰비언트 질량 분석법은 in vitro 및 in vivo 분석 모두에 적합합니다.
- 이 방법은 광범위한 시료 전처리가 필요하지 않습니다.
- 생물학적 성분의 손실을 최소화하며 시료를 분석할 수 있습니다.
- 신속한 분석은 이 기술의 핵심적인 장점입니다.
연구 목적
- 생체 분자의 실시간 분석 방법을 제시한다.
- 가공되지 않은 조직 시료 분석의 효율성을 입증한다.
- 상압 질량 분석법(ambient mass spectrometry) 사용의 장점을 강조한다.
사용된 방법
- 실리카 및 조직 시료의 준비.
- 시료 분석을 위한 일회용 카트리지 사용.
- 질량 분석법을 이용한 생물학적 시료의 직접 분석.
- 1분 이내의 신속한 시료 처리.
주요 결과
- 이 방법은 성분의 큰 손실 없이 신속한 분석을 가능하게 합니다.
- 매우 적은 양의 생물학적 물질이 포함된 샘플을 분석하는 데 효과적입니다.
- 실시간 분석에서 견고함과 신뢰성을 입증합니다.
- 생물학적 분자를 천연 상태에서 연구하는 것을 용이하게 합니다.
결론
- 주변 질량 분석법은 생물학적 분석을 위한 가치 있는 도구입니다.
- 이 기술은 생물학적 과정에 대한 이해를 증진시킵니다.
- 이 방법은 실시간 분석을 위한 신속하고 효율적인 방법을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
프로브 전기분무 이온화 질량분석법(PESI-MS)은 최소한의 전처리를 통해 생물학적 시료의 실시간 분자 분석을 가능하게 하여, 초기 발굴 단계에서 신속한 타겟 검증 및 메커니즘의 리스크 제거를 지원합니다. 이 기술은 조직 10 mg 또는 혈청 10 µL만으로도 분석이 가능하여, 소량의 전임상 시료에 적합하며 생물학적 성분의 손실을 줄여줍니다. 이러한 능력은 살아있는 시스템으로부터 대사체 및 약물 역학 데이터를 직접적으로, 그리고 in situ로 제공함으로써 리드 물질 식별의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 신세포암과 같은 고체 조직에서 중성 지질 및 대사물을 직접 검출함으로써 치료 가설의 분석을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 50% 에탄올에서의 조직 균질화만으로 가능한 최소한의 시료 준비가 필요하여, 워크플로우의 복잡성과 변동성을 줄여줍니다.
- 예측적 가치: 상용 데이터베이스 매칭을 통한 분자 기전 검증을 지원하여 타겟 신뢰도 평가에 도움을 줍니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 간단한 에탄올 침전 및 원심분리 후 인간 혈청을 직접 분석할 수 있어 액체 기반 바이오마커 스크리닝이 가능합니다.
- 운용적 가치: 일회용 카트리지와 스테인리스 스틸 프로브를 사용하여 표준화를 보장하고 교차 오염 위험을 줄입니다.
- 확장성: 몇 분 내에 결과가 도출되어 신속한 샘플 처리가 가능하며, 고처리량 스크리닝 준비를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 마우스 간에서의 5-FdU 검출과 같이, 살아있는 동물의 특정 장기 내 대사물질 또는 약물의 실시간 동역학 추적을 가능하게 합니다.
- 기전적 리스크 감소: 조직 파괴 없이 in situ 분자 데이터를 제공하여 생리학적 맥락을 보존함으로써, 전임상에서 임상으로의 중개 효율을 높입니다.
- 리스크 조정 기반의 진행: 질환 관련 스펙트럼 패턴(예: 간경변 간의 신생물성 병변)을 검출하여 진행 또는 중단(go/no-go) 결정을 내리는 근거를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
PESI-MS는 초기 생물학 연구부터 리드 화합물 발굴까지의 탐색 연속체에 부합하며, 가설 검증 및 분석 준비를 지원하는 신속하고 정량적인 분자 판독 값을 제공합니다.
- 발견 생물학: 분획 과정 없이 조직 특이적 분자 시그니처(예: 암종 내 triacyl glycerol)를 검출하여 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 표준화된 카트리지 기반 시료 도입을 통해 분석 준비가 된 액체 및 조직 분석을 가능하게 합니다.
- 분석학: 조건 및 개체 간의 정량적 비교를 위한 질량 분석 데이터(m/z 피크, EIC, TIC)를 생성합니다.
- 중개 연구: 마우스 꼬리 정맥에 정맥 주사한 5-FdU와 같은 약물 대사체를 in vivo에서 모니터링함으로써 전임상 검증과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 일회용 소모품과 함께 재사용 가능한 하드웨어(프로브, 챔버)를 사용하여 프로젝트 간 표준화를 가능하게 합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 온전한 생물학적 시스템으로부터 직접적인 분자 데이터를 제공함으로써 메커니즘적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 표준화된 시료 준비(조직 10 mg, 혈청 10 µL, 50% 에탄올)와 고정된 전압/주파수 설정(2.3 kV, 3 Hz)을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 질환 모델에서 대사물질/약물을 신속하게 검출함으로써 go/no-go 의사결정을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 대조군에는 없는 질환 특이적 피크(예: 암에서의 m/z 900) 검출을 통해 리스크 조정 우선순위 지정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 용매 준비(50% ethanol) 및 혈청 처리를 위한 원심분리기 사용을 포함하여 질량 분석기 작동에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 호환 가능한 카트리지 시스템과 스테인리스 스틸 바늘 프로브가 장착된 직접 프로브 이온화 질량 분석기가 필요합니다.
- 데이터 일관성을 보장하기 위해 조직 절단, 균질화 및 상층액 전이와 같은 시료 취급에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- in vivo 응용 시 이온화 효율과 데이터 품질에 영향을 미치는 중요한 변수인 바늘 팁의 깊이를 고려해야 합니다.
- 상압 이온화와 호환되는 시료로 제한되며, 복잡한 생체 유체의 경우 매트릭스 효과에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
