Name: 신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 면역형광염색 및 DNA 닷블롯을 이용해 쥐 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 방법을. 이 기법은 신경 발달 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

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XL은 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFE0196600)과 중국 국립자연과학재단(Grant Nos. 31771395, 31571518)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. Q.S.는 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2017YFC1001703)과 절강성의 주요 연구 개발 프로그램(2017C03009)의 지원을 받았습니다. W.X.는 절강성 자연과학 재단(LY18H020002)과 절강성 과학기술부(2017C37057)의 지원을 받았습니다.

모든 동물 절차는 절강 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 성인 신경 줄기 세포와 뉴런의 문화
<ol><li>성인의 전뇌로부터 성체 신경줄기세포를 분리(8-10주령) C57/BL6 수컷 마우스는 앞서31,32.</li>
	<li>배양 성인 신경 줄기 세포DMEM/F-12 배지에서 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 보충제, 1% 항생제 항마이코제, 및 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2 mML-글루타민을 함유한다. 앞서 설명한바와같이 48시간 동안 1 μM 레티노산 및 5 μM 산림을 가진 성인 신경 줄기 세포의 분화를유도한다.</li>
	<li>배아일17(E17)으로부터 뉴런을 0.25% L-글루타민, 0.125% 글루타맥 및 2% B27 보충제를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 함유하는 신경기질 배지로 마우스 및 배양물의해마를 33.</li>
</ol>2. 마우스의 트랜스카다이얼 관류
<ol><li>실험 하루 전에 10% 클로랄 수화물, 4% 파라포름알데히드(PFA) 및 인산완충 식염수(PBS)를 준비하고 4°C에서 보관합니다.</li>
	<li>성인 남성 또는 여성 C57 BL/6J 마우스를 10% 클로랄 수화물(50 mg/kg, i.p.)으로 마취시키고 신체 반응을 확인하여 동물이 깊은 마취를 하도록 합니다. 플라스틱 보드에 끈적끈적한 테이프로 각 팔다리를 고정합니다(앞면 이면에 있음).</li>
	<li>수술 가위로 피부를 잘라 다음 근육을 잘라. 외과 용 가위로 흉강을 엽니다. 심혼을 드러내고 정밀한 외과 가위로 오른쪽 심방의 작은 부분을 잘라냅니다.</li>
	<li>왼쪽 심실에서 10 mL 일회용 살균 주사기로 마우스를 차가운 PBS (성인 마우스 당 약 30 mL)로 주입하십시오.</li>
	<li>딱딱해질 때까지 4% PFA(성인 마우스 당 10분에서 약 30mL)로 마우스를 주입합니다.</li>
	<li>뼈 집게로 마우스의 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거하고 4°C에서 후 고정을 위해 15 mL 원심분리관에서 4% PFA의 5 mL에 넣습니다. 참고: 수술이 끝난 후 수술 부위를 청소하십시오.</li>
	<li>적어도 24 시간 후에, 4 °C에서 완전한 탈수에 대한 30 % 자당 용액으로 뇌 샘플을 전송합니다.</li>
</ol>3. 뇌 절제
<ol><li>뇌 샘플을 작은 용기에 최적의 절삭 온도 화합물(OCT)에 넣고 -20°C에서 적어도 1시간 동안 식힙니다.</li>
	<li>저온 유지 마이크로토메와 20-40 μm의 두께에서 뇌 샘플을 섹션.</li>
	<li>PBS에 섹션을 수집하고 4 °C에서 저장합니다.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>표적 뇌 영역과 섹션을 선택하고 PBS와 24 잘 접시에 넣어. 커버 슬립에 배양 된 세포의 경우 4.2 단계로 직접 이동하십시오.</li>
	<li>실온에서 셰이커에 PBS로 10분 동안 씻으시고 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>PBS를 제거하고, 37°C에서 30분 동안 예열된 1M HCl로 치료한다. 참고: 염산 1mL(36-38%)를 첨가하여 1M HCl을 준비합니다. 화학 후드에 10 mL의 물로 넣습니다. 37°C에서 인큐베이터에서 1M HCl을 예열합니다.</li>
	<li>샘플을 PBS로 5분 동안 세척합니다.</li>
	<li>3% 정상 염소 혈청과 0.1% 트리톤 X-100을 함유한 PBS샘플을 실온에서 셰이커에 1시간 동안 차단하였다.</li>
	<li>셰이커상에서 4°C에서 하룻밤 동안 특정 1차 항체로 섹션을 배양한다. 참고: 다음과 같은 1차 항체를 사용한다: 폴리클론 토끼 항체 항체-5-하이드록시메틸시토신(1:5,000), 마우스 단클론 항체 항체-NeuN(1:500).</li>
	<li>샘플을 꺼내, 1 시간 동안 실온에서 더 배양.</li>
	<li>샘플을 PBS로 10분 동안 세척합니다.</li>
	<li>셰이커상에서 1시간 동안 실온에서 1차 항체에 대응하는 이차 항체와 배양한다. 알루미늄으로 접시를 덮습니다. 참고: 다음이차 항체를 사용한다: 알렉사 플루어 488 염소 항토끼 IgG (1:500), 알렉사 플루어 568 염소 항 마우스 IgG (1:500). 4′-6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)와 카운터 스테인 핵.</li>
	<li>셰이커에서 10분 동안 PBS로 샘플을 씻습니다. 이 작업을 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>슬라이드에 뇌 섹션을 장착하고, 적당한 양의 안티페이드 장착 매체(약 100-150 μL)를 추가하고 프리미엄 커버 유리로 덮습니다. 매니큐어로 밀봉하십시오.</li>
	<li>일반 또는 공초점 형광 현미경으로 이미지를 찍습니다.</li>
</ol>5. 게놈 DNA 격리
<ol><li>성인 C57 BL/6J 마우스(남성 또는 여성)를 자궁 경부 탈구로 안락사시키고 뇌를 제거합니다.</li>
	<li>해마, 피질 및 소뇌 조직을 얼음 냉각 접시에 해부하십시오. DNA 분해 완충액 1 mL에서 조직 분쇄기로 조직을 갈고 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김하십시오. 용해 완충액 600 μL 당 250 μg의 단백질A제 K를 첨가하십시오. 세포 펠릿의 경우 용해 완충액, 단백질AE K를 직접 추가하고 철저히 혼합하십시오. 참고: DNA 용해 완충액을 준비: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl 에서 100 mM 트리스-HCl, pH 8.5. 실험 전에 티슈 그라인더를 세척하고 오토클레이브합니다.</li>
	<li>둘째 날에는 37°C에서 적어도 12시간 동안 시료당 약 50 μg의 RNase A를 첨가한다.</li>
	<li>페놀:클로로폼:이소아밀 알코올(25:24:1)을 넣고 완전히 섞어보세요.</li>
	<li>20,817 x g에서 15 분 동안 원심 분리를 하고, 상급체를 새로운 미세 원심분리튜브로 제거한다.</li>
	<li>600 μL의 클로로포름을 상급체에 첨가하여 DNA를 침전시키고 철저히 섞습니다.</li>
	<li>20,817 x g에서 15 분 동안 원심 분리를 하고 상급체를 다른 새로운 튜브로 제거합니다.</li>
	<li>이소프로판올 500 μL을 상급체에 넣고 완전히 섞어줍니다.</li>
	<li>원심분리기는 15분 동안 20,817 x g으로 제거하고 상급체를 완전히 제거합니다.</li>
	<li>강수량을 70% 에탄올 1mL로 세척하고 원심분리기를 20,817 x g에서 1분 동안 세척하고 상구체를 완전히 제거합니다. 한 번 반복합니다.</li>
	<li>DNA 펠릿을 완전히 건조시고 말립니다.</li>
	<li>DNA 펠릿을 트리스-HCl 완충액(pH 8.5)으로 적절한 농도로 용해시.</li>
</ol>6. DNA 도트 블롯
<ol><li>용액 을 준비하십시오 : 2 M NaOH, Tris-HCl 버퍼 (pH 8.5), 6 x 식염수 구연산염 (SSC).</li>
	<li>샘플 혼합물을 표 1로만듭니다.</li>
	<li>100 °C에서 DNA 샘플을 10분 동안 변성시키고 얼음을 식힙니다.</li>
	<li>나일론 멤브레인(예: Hybond-N+)의 적절한 크기를 자르고 6x SSC로 헹구십시오.</li>
	<li>멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓고 진공 펌프에 연결합니다. 점당 혼합물의 6 μL을 멤브레인에 두드킵니다.</li>
	<li>80°C에서 30분 동안 혼성화하고, 트리스 완충식 식염수(TBS)에서 무지방 우유로 시료 막을 1시간 동안 차단합니다.</li>
	<li>1차 항체를 밤새 4°C에서 배양한다. 참고 : 다음과 같은 기본 항체 : 폴리 클론 토끼 항 - 5-하이드록시메틸 시토신 (1:5,000).</li>
	<li>둘째 날에는 시료 막을 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 10 분 동안 TBS로 씻으하십시오.</li>
	<li>실온에서 30 분 동안 항 토끼 이차 항체 (1 :5,000)로 멤브레인을 배양하십시오.</li>
	<li>10 분 동안 TBS로 씻으하십시오.</li>
	<li>화학 발광 신호를 시각화하고 신호 강도를 정량화합니다.</li>
</ol>

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</ol>

경쟁적인 재정적 이해관계는 존재하지 않습니다.

후성 유전학 수정은 뇌 발달, 성숙 및 기능 중에 필수적인 역할을합니다. DNA 변형을 위한 안정한 마커로서, 동적 5-hmC는 행동 적응, 신경 활성에 반응하고, 유전자 발현과 긍정적으로 상관관계가 있다; 따라서, 뇌 및 신경 장애의 정상적인 기능에 관여4. 세포와 조직에서 의 기능을 탐구하려면 5-hmC의 존재를 감지하고 치료 전후의 수준을 비교해야합니다. 여기에서, 우리는 실험실에 있는 일반적인 장비로 수행될 수 있던 세포 와 조직에서 5-hmC를 검출하는 2개의 편리한 방법을 설명했습니다.
면역형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 통해 5-hmC 검출의 주요 시약은 5-hmC 항체이다. 이 방법에 사용된 5-hmC 항체는 높은 감도를 가지며 매우 특이하다는 것이 입증되었다. 5-hmC 염색을 위해, 그것은 HCl를 가진 DNA 변성 필요. HCl을 가진 조직 그리고 세포의 적당한 처리는 완전한 DNA 변성을 위해 중요하고 결과에 영향...

DNA 변형, 히스톤 변형 및 RNA 변형을 포함한 후생 유전학적 변형은 다양한 생물학적 과정과 질병1,2,3에서필수적인 기능을 하는 것으로 나타났습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7.오랜 시간 동안, DNA 메틸화(즉, 5-메틸시토신(5-mC))는 매우 안정적인 후성유전학 적 마커로서 간주되어 왔으며 게놈에서 더 이상 변형될 수 없다. 최근, 5-mC는 TET1, TET2 및 TET38,9를포함하는 TET(11-11전좌) 패밀리 단백질에 의해 5-하이드록시메틸시토신(5-hmC)으로 산화될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 추가 연구는 5-hmC가 안정한 마커로 작용할 수 있고 유전자 발현조절을통해 생물학적 역할을 할 수 있음을 보여준다4,10,11,12.
본 증거는 5-hmC가 포유동물의 다른 유형의 조직에 비해 신경 조직/세포에서 고도로 농축되고, 신경 발달13,14동안 동적 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경 시스템에서, 5-hmC 중재 후생 유전학 수정 신경 줄기 세포를 조절에 중요 한 역할을, 신경 활동, 학습 및 메모리, Rett 증후군을 포함 하 여 여러 신경 질환에 관여, 자폐증, 알 츠 하이 머 병 질병, 헌팅턴병 등2,13,15,16,17,18,19,20.
세포 및 조직14,21,22,23,24에서5-hmC를 검출하기위한 몇 가지 접근법이 있습니다. 여기에서, 우리는 5-hmC의 존재를 검출하고 5-hmC의 글로벌 수준을 정량화하는 2개의 방법을 기술합니다: 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩. 이 두 가지 방법은 편리하고 민감하며 이전 연구25,26,27,28,29,30에서성공적으로 사용되었습니다. 이 두 방법의 주요 단계는 DNA 변성입니다. 5-hmC의 면역 형광 염색을 위해 1 M HCl로 시료를 전처리해야합니다. 5-hmC 도트 블롯의 경우 NAOH 용액으로 DNA 변이가 수행됩니다. 이 두 가지 방법은 차세대 시퀀싱과 함께 5-hmC의 기능을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>4'-6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>어도비 포토샵 소프트웨어</td><td>어도비 Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>안티-5-하이드록시메틸시토신</td><td>활성 모티프</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>안티 NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 매체</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane (Hybond&trade;-N+)</td> <td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>10월</td><td>라이카</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>펜 스트렙</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 (25: 24:1</td>) <td>시그마-알드리치</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신</td><td>시그마</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마-알드리치</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>솔라바이오</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

포유류 게놈에서 여러 DNA 변형이 확인되었다. 그 중, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신 매개 후생유전학 적 메커니즘이 집중적으로 연구되었습니다. 5-하이드록시메틸시토신은 뇌의 배아 및 산후 발달 시 동적 특징을 표시하고 유전자 발현에서 조절 기능을 하며 여러 신경 장애에 관여합니다. 여기서, 우리는 마우스의 배양 된 세포 및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸 사이토신을 검출하기 위해 면역 형광 염색 및 DNA 도트 블롯을 포함한 상세한 방법을 설명합니다.

성인 마우스의 해마에서 5-hmC의 분포를 밝히기 위해, 우리는 신경 세포 (NeuN) 및 5-hmC에 대한 항체로 면역 형광을 수행했습니다. 해마에서, 5-hmC는 뉴런 세포 마커 NeuN(그림1A-H)과잘 국소화되어 뉴런에서 5-hmC의 농축을 시사한다.
신경 발달 도중 5-hmC의 역학을 결정하기 위하여는, 점 얼룩은 증식하고 분화한 성인 신경 줄기 세포 (NSC)에서 분리된 DNA 견본으로 처음으로 수행되었습니다. 도트-블롯 결과는 NSC의 분화 동안 5-hmC의 글로벌 수준이 유의히 증가하였다(도2A-B). 또한, 도트-블롯 결과는 뉴런에서 5-hmC의 수준이 신경 세포 발달 동안 동적 5-hmC 변형을 시사하는 NSC(도2C-D)보다유의한 것으로 나타났다.<strong cl...

여기에서, 우리는 면역 형광 염색 및 DNA 점 얼룩 방법을 활용하여 세포와 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다.

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

여기서, 우리는 면역 형광, 새로운 방법 및 DNA 점 얼룩을 사용하여 세포및 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 5-하이드록시메틸시토신, 즉 5hmC, 완화된 후성유전학적 변형, 유전자 발현 조절에 중요한 기능을 담당하고 여러 신경 장애에 관여하는 것으로 보인다.실제로, 우리의 방법은 다중 세포및 조직에서 5hmC를 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그것은 편리하고 실험실에서 일반적인 장비와 함께 수행 할 수 있습니다. 먼저 마우스를 플라스틱 보드에 올려 놓고 각 팔다리를 끈적거리는 테이프로 고정하는 것으로 시작합니다.외과 가위를 사용하여 피부와 근육을 잘라 내고 흉부 구멍을 엽니다. 심장을 노출하고 미세 수술 가위로 오른쪽 아트리움의 작은 부분을 잘라. 10 밀리리터 일회용 살균 주사기를 사용하여 왼쪽 심실에서 마우스를 차가운 PBS로 견딜 수 있습니다.그런 다음 마우스가 뻣뻣해질 때까지 4 %의 PFA로 마우스를 견딜 수 있습니다. 그런 다음 뼈 집게로 두개골을 열고 뇌를 제거합니다. 뇌를 4%PFA의 5밀리리터로 채워진 15밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고 섭씨 4도에 보관하십시오.24 시간 후에, 30% 자당 용액으로 두뇌를 전송하고 완전한 탈수에 대한 섭씨 4도에서 둡니다. 절개하기 전에 최적의 절삭 온도 화합물에 뇌를 침지하고 적어도 한 시간 동안 영하 20도까지 식힙니다. 저온 저온 마이크로토메를 사용하여 20~40마이크로미터두께의 뇌 샘플을 절개한다.PBS로 섹션을 수집하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 관심의 뇌 섹션을 선택하고 PBS와 24 잘 접시에 넣어. PBS로 섹션을 셰이커에 10분간 세척합니다.PBS를 제거하고 예열된 1-어금다 염산으로 30분 동안 섭씨 37도에서 치료하십시오. 염산은 부식성이며 화학 적 보류로 준비하십시오. 그런 다음 PBS로 샘플을 5분 동안 세 번 세척하고 3%의 일반 염소 세럼과 0.1%트리톤 X-100을 함유한 PBS로 차단합니다.샘플을 실온에서 1시간 동안 셰이커에 두십시오. 섹션에 특정 1 차 적인 항체를 추가 하 고 셰이커에 섭씨 4도에서 하룻밤 배양. 다음 날, 샘플을 꺼내 1 시간 동안 실온에서 둡니다.PBS로 샘플을 세 번 세척하고 이차 항체를 추가합니다. 알루미늄으로 접시를 덮고 흔들면서 실온에서 1 시간 동안 둡니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 세 번 세척하고 슬라이드에 장착합니다.페이드 방지 마운팅 매체100~150마이크로리터를 추가하고 프리미엄 커버 글래스로 커버하고 매니큐어로 밀봉합니다. 규칙적 또는 공초점 현미경으로 뇌 섹션을 이미지합니다. 게놈 DNA를 격리하려면 해마, 피질 및 소뇌 조직을 얼음 냉각 접시에 해부하는 것으로 시작합니다.DNA 리시스 버퍼 1밀리리터를 추가하고 조직을 갈아. 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 리스 버퍼의 600 마이크로 리터당 250 마이크로 그램의 단백질아제-K를 추가합니다. 그런 다음 샘플 당 약 50 마이크로 그램의 RNase A를 추가하고 섭씨 37도에서 적어도 12 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션 후 페놀 클로로폼 이소아밀 알코올의 동일한 볼륨을 추가하고 철저하게 혼합합니다. 원고 방향에 따라 혼합물을 원심 분리하고 상체를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 600 마이크로리터의 클로로폼을 상체에 넣고, 원고 의 지시에 따라 철저히 섞고 원심분리기를 섞습니다.상체를 새로운 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 이소프로판올을 추가합니다. DNA를 침전시키기 위해 철저하게 혼합하고 원심분리기를 다시 섞습니다. 원심분리 후, 상체를 버리고, 원고 의 방향에 따라 DNA 펠릿을 70%에탄올로 씻는다.공기는 DNA 펠릿을 완전히 건조한 다음 Tris-HCl 버퍼에 녹입니다. 시작하기 전에 원고 방향에 따라 필요한 솔루션 및 샘플 혼합물을 준비하십시오. DNA 샘플을 섭씨 100도까지 10분 간 가열한 다음 얼음 위에 놓습니다.나일론 멤브레인의 적절한 크기를 잘라 6X SSC로 헹신다. 멤브레인을 도트 블롯 장치에 놓고 진공 펌프를 연결합니다. 멤브레인에 6 마이크로 리터 점을 발견하고 섭씨 80도에서 30 분 동안 혼성화하십시오.그런 다음 무지방 우유와 트리스 완충식식염수 또는 TBS로 샘플 멤브레인을 1시간 동안 차단합니다. 다클론 토끼 항-5-하이드록시메틸시토신 항체를 막에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양한다. 다음 날, 1 시간 동안 실온에서 샘플 멤브레인을 두고 다음 TBS로 멤브레인을 세 번 세척하십시오.항토끼 이차 항체로 멤브레인을 30분 동안 배양한 다음 TBS로 세 번 세척합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 해마에서 5-하이드록시메틸시토신 또는 5hmC를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.신경 세포에 대한 항체를 가진 면역 형광, 5hmC는 뉴런에 있는 5hmC의 농축이 있다는 것을 밝힙니다. 신경 발달 도중 5hmC의 역학은 증식및 분화한 성인 신경 줄기 세포에서 격리된 DNA 견본의 점 얼룩 분석으로 결정될 수 있습니다. 5hmC의 글로벌 수준은 분화 도중 현저하게 증가하고 뉴런에 있는 5hmC의 수준은 신경 줄기 세포에서 보다는 더 높습니다.이 방법의 핵심 단계는 DNA 샘플의 완전한 거부를 확인하는 것입니다.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

여기에서는 과산화효소 접합 2차 항체 및 티라미드 신호 증폭의 사용을 기반으로 5mC 산화 유도체의 공간 분포를 매핑하기 위한 민감한 면역화학적 방법을 설명합니다.

민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

메틸화 RNA 면역 침전 분석법은 메틸화 RNA 단편을 농축하는 데 사용되는 항체 기반 방법입니다. 깊은 시퀀싱과 결합하여 m5C수정을 운반하는 성적 증명서를 식별합니다.

메틸화 RNA 면역 침전 분석연구 m5C 변형에 대한 애비독증

유도성 트랜스제닉 계보 추적 마우스 라인을 사용하여 줄기 세포 및 그의 자손을 형광단으로 영구적으로 표시하는 능력은 생체내에서 활성화, 증식, 이동 및/또는 분화의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 한다. 계보 추적은 혈통 헌신, 개입에 대한 반응 및 다능성에 대한 새로운 정보를 나타낼 수 있습니다.

성인 마우스 뇌에서 유도성 형광 표지 줄기 세포의 계보 추적

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

배우세요 면역형광염색 및 DNA 닷블롯을 이용해 쥐 뇌 조직에서 5-하이드록시메틸시토신을 검출하는 방법을. 이 기법은 신경 발달 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

신경 줄기 세포와 쥐의 뇌에서 5-하이드록시메틸시토신의 검출

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