제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화
January 28th, 2020
유전자 편집 기술은 연구원이 상대적으로 쉽게 유전자 기능을 조사하기 위해 제브라피시 돌연변이를 생성할 수 있게 했습니다. 여기서, 우리는 제브라피시에서 의 회동 배아 하노티핑 및 정량화 신호를 수행하는 가이드를 제공한다. 이러한 편견없는 접근 방식은 situ 하이브리드화를 기반으로 한 현상별 분석에서 더 높은 정확도를 제공합니다.
유전자 발현에 돌연변이의 결과는 수시로 현장에서 혼성화에 의해 질적으로 평가되고 일반적으로 연구원의 기대에 의해 주관적이고 편향되는 시각적으로 득점됩니다. 이 방법은 이미지 강도를 정량화하여 시투 실험에서 비교할 수 있는 보다 일관된 방법을 제공하고 해당 바이어스를 제거합니다. 이것은 또한 유전자 발현의 판독기로 시상 혼성화에서 사용하는 다른 모델 시스템에 쉽게 적응될 수 있다.
시상 혼성화 또는 ISH 염색 배아를 이미징하여 시작합니다. 글리세롤 용액을 준비하고 혼합하여 균질화합니다. 3 밀리리터 파스퇴르 파이펫으로 글리세롤 용액으로 배아를 옮기고 적어도 5분 동안 정착하게 한다.
이미징 후 ISH 스테인드 배아를 전송하기에 충분한 PCR 튜브를 준비하고 라벨을 붙인 다음 3밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유리 우울증 슬라이드의 우물 바닥에 100% 글리세롤을 추가합니다. 단일 ISH 스테인드 배아를 유리 슬라이드로 옮기고 디지털 카메라와 바닥 및 상단 조명이 장착된 스테레오 현미경으로 방향을 지정합니다. 첫 번째 배아를 사용하여 원하는 배율에서 조명 및 노출 시간을 조정합니다.
필요에 따라 많은 배아를 이미지화하고 각 이미지에 고유한 번호로 레이블을 지정합니다. 이미징 후 각 배아를 동일한 번호로 표시된 PCR 튜브로 옮기고 필요한 경우 PCR 튜브에서 과도한 글리세롤을 흡인시합니다. DNA를 추출하려면 각 튜브에 HoTSHOT과 같은 알칼리성 리시스 버퍼의 40~75마이크로리터를 추가합니다.
약 30분 동안 95도의 튜브를 배양한 다음 섭씨 4도로 식힙니다. 동일한 양의 중화 버퍼를 추가하고 관심 있는 돌연변이를 위한 유전화를 진행합니다. 이미지 분석을 수행하려면 피지에서 이미지를 선택하고 열고 편집을 클릭한 다음 반전한 다음 이미지 탭을 클릭하고 Type을 선택하고 8비트를 선택하여 이미지 유형을 8비트로 변환합니다.
다각형 도구를 선택하고 측정할 ISH 신호를 포함하는 영역 주위의 이미지에 관심 영역 또는 ROI영역을 수동으로 그립니다. T를 눌러 ROI 관리자를 열고 관심 영역을 선택한 다음 측정값을 클릭합니다. 결과 창에서 스프레드시트에 평균 값을 복사합니다.
배경 강도를 측정하려면 ROI를 염색하지 않고 배아의 영역으로 이동하고 ROI 관리자에 추가를 클릭합니다. 백그라운드 영역을 선택하고 측정값을 클릭한 다음 스프레드시트에서 평균 강도 값을 기록합니다. 스테인드 영역의 배경의 평균 강도를 빼서 NC2 혼성화 신호의 평균 픽셀 강도를 가져옵니다.
모든 샘플의 평균 픽셀 강도를 결정한 후 각 샘플에 유전자형을 할당합니다. 유전자형을 확인할 수 없는 경우 후속 분석에서 샘플을 제외합니다. 유전자형에 따라 평균 표본 강도 값을 정렬하고 통계 테스트를 진행합니다.
이 기술의 유용성은 dnmt3bb에 대한 ISH에서 입증되었습니다. runx1 이종구우스 크로스에서 배아에서 1. dnmt3bb의 감소.
1 발현은 runx1 homozygous 돌연변이체에서 검출되었으며 이종화 구균 배아는 dnmt3bb에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 식 1개. lmo4 돌연변이가 runx1 발현에 미치는 영향을 확인하려고 시도할 때, 이 분석은 야생 유형과 호모니구스 lmo4 돌연변이체 사이의 표정에 상당한 차이를 나타내지 않았다.
그러나, runx1 발현의 작은 감소는 단일 배아 qPCR에 의해 검출되었다. runx1 프로브 배아의 약 0.4%에서 ISH는 신호에서 빼졌을 때 음수의 결과로 높은 배경을 가지고 있었습니다. 이러한 경우, 배아는 분석에서 제외되었다.
배아의 4개의 다른 지구는 배경 보정을 낙낙하기 위하여 시험되었습니다. 배경 영역에서 ROI의 강도가 상대적으로 안정적인 차이가 있었지만 R3는 항상 ROI보다 높은 강도를 보였으며 배경 보정에 사용해서는 안됩니다. R1 과 R4는 배경 보정에 가장 적합한 영역으로 입증되었습니다.
이미징을 위한 최상의 조건을 찾고 실험 전반에 걸쳐 변경되지 않는 유지하는 것이 중요합니다. 또한 각 샘플에 유전자형을 할당하기 전에 픽셀 강도를 정량화하는 것이 좋습니다.
개요
이 기사는 제브라피쉬의 병행 배아 유전자형 분석 및 현장 하이브리드 신호의 정량화 방법을 제시합니다. 이 편향 없는 접근법을 활용함으로써 연구자들은 현상학적 분석에서 더 큰 정확성을 달성할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 발달 생물학
배경
- 유전자 편집 기술은 제브라피쉬 돌연변이의 생성을 용이하게 합니다.
- 현장 하이브리드는 유전자 발현을 평가하는 일반적인 방법입니다.
- 전통적인 점수 매기기 방법은 편향과 주관성을 도입할 수 있습니다.
- 이 연구는 보다 일관성 있고 정량적인 접근법을 제공하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 제브라피쉬의 현상학적 분석 정확성을 향상시키기 위해.
- 배아 유전자형 분석을 위한 표준화된 방법을 제공하기 위해.
- 현장 하이브리드 신호를 객관적으로 정량화하기 위해.
사용된 방법
- 입체 현미경을 사용하여 ISH 염색된 배아를 이미지화합니다.
- 배아 이동을 위한 글리세롤 용액을 준비합니다.
- DNA 추출을 위해 알칼리성 용해 버퍼를 사용합니다.
- 이미지 분석 및 정량화를 위해 Fiji 소프트웨어를 사용합니다.
주요 결과
- runx1 동형접합 돌연변이체에서 dnmt3bb.1 발현의 감소를 입증했습니다.
- 이미지 분석을 위한 적절한 배경 보정 영역을 식별했습니다.
- 야생형과 lmo4 동형접합 돌연변이체 사이에 발현에 유의미한 차이가 없음을 보였습니다.
- 픽셀 강도를 기반으로 유전자형을 지정하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공했습니다.
결론
- 이 방법은 유전자 발현 분석의 신뢰성을 향상시킵니다.
- 다른 모델 시스템에서 사용할 수 있습니다.
- 정확한 결과를 위해 일관된 이미징 조건을 유지하는 것이 중요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
