Name: 소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 NADH 결합 ATPase 분석법을 이용한 반 높은 처리량 소분자 억제제 스크리닝 방법입니다. 이 기술은 비근육 미오신 II 억제제 개발 및 메스암페타민 사용 장애 치료 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 약물 남용 NS096833 (CAM)에 대한 신경 장애 및 뇌졸중및 국립 연구소의 보조금에 의해 지원되었다.

1. 재고 솔루션 및 시약 준비
<ol><li>증류수에서 결정성 DTT를 1000 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 디티오트레이톨(DTT) 스톡 용액을 준비한다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>증류수에서 결정성 ATP를 100 mM의 최종 농도로 용해시켜 ATP 스톡 솔루션을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>70 mM 3-(N-morpholino)를 함유하는 10x NADH 완충제를 준비하여 프로판설포닉산(MOPS), 10 mM MgCl 2, 0.9 mM 에틸렌 글리콜-비스(β-aminoethyl ether)-N,N,N,N,N′, N′, N′,테트라아세트산(EGTA) 및 3 mMNaN을준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	<li>10 mM MOPS 및 0.1 mM EGTA를 포함하는 1x 미오신 완충액을 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 DTT를 0.1 %의 최종 농도에 추가 (w / v %) 사용하기 전에 각각 1 mM.</li>
	<li>4 mM MOPS, 0.1 mM EGTA, 2 mM MgCl2및 3 mM NaN3를포함하는 1x 액틴 버퍼를 준비합니다. 1 M NaOH 용액으로 pH를 7.0으로 조정합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 최종 농도0.1%(w/v%)에 BSA 및 DTT 추가 사용하기 전에 각각 1 mM.</li>
	<li>결정성 NADH를 10x NADH 완충액에서 5.5 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 NADH 스톡 용액을 준비한다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>10x NADH 버퍼에서 결정성 PEP를 50 mM의 최종 농도로 용해시킴으로써 PEP 스톡 용액을 준비한다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>글리세롤과 10x NADH 버퍼(50%:50%)의 혼합물에 호우필화된 LDH 분말을 용해시켜 LDH 스톡 용액을 준비합니다. 2000 U/mL의 최종 농도로 결정됩니다. 용액을 존재하지 않은 단백질(7,197 x g, 20°C, 10분)을 제거한다. 상급체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김으로 옮김을 조심스럽게 옮김을 넣습니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>글리세롤과 10x NADH 버퍼(50%:50%)를 혼합하여 호우필화된 PK 분말을 용해시켜 PK 스톡 용액을 준비합니다. 10000 U/mL의 최종 농도로 결정됩니다. 용액을 존재하지 않은 단백질(7,197 x g, 20°C, 10분)을 제거한다. 상급체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김으로 옮김을 조심스럽게 옮김을 넣습니다. 알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	<li>100 μL 증류수를 첨가하여 동구성 심장 및 골격 근미오신 II 샘플을 재구성하여 각각 ~37.9 μM 및 ~40.8 μm myosin 농도 (단모름)에 해당하는 10 mg/mL 스톡 솔루션을 얻습니다. 자세한 내용은 제조업체의 지침을 참조하십시오.</li>
	<li>파르디와 스푸디치25에의해 설명 된 대로 토끼 근육 아세톤 분말에서 F-액틴을 준비합니다.</li>
</ol>2. 작은 분자 억제제의 ATPase 활동 및 억제 효과 측정
<ol><li>컴파운드 플레이트를 준비합니다.<ol>
<li>고품질 디메틸설산화물(DMSO)에 관심 있는 화합물을 용해시다.</li>
		<li>DMSO에서 10 mM 화합물 농도에서 시작하여 15 단계 직렬 1:2 희석을 생성합니다.</li>
		<li>다중 채널 파이펫을 사용하여 샘플을 384 웰 폴리프로필렌 플레이트에 삼중항(각각 12.5 μL)으로 옮김을 전달합니다. 에지 효과의 영향을 받을 수 있는 웰 수를 최소화하려면 하나의 컴파운드(3개의 열 대신)에 대해 컴파운드 플레이트에 두 행을 사용합니다. 각 화합물에 대한 두 번째 행의 마지막 세 웰을 음수 제어(DMSO만)로 사용합니다. 화합물 희석을 위해 플레이트의 첫 번째 행과 마지막 행을 사용하지 마십시오.</li>
		<li>순수 한 DMSO를 첫 번째 행의 우물로 전송합니다 (NADH 교정용으로 예약됨).</li>
		<li>양수 제어를 위해 마지막 행을 사용합니다. 참고: DMSO에서 4 mM 농도에서 파라-아미노블레비스타틴을 여기에서 사용하였습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>액틴 스톡 용액을 액틴 완충액으로 희석하여 각 분석판(384웰 블랙월 폴리스티렌 마이크로플레이트)에 대해 20 μM 희석액의 4500 μL을 준비한다. 5mL 파이펫을 사용하여 30x 위아래로 파이펫팅하여 액틴 필라멘트를 파괴하여 점도와 이질성을 줄임으로써 솔루션을 철저히 혼합합니다. 존재하는 임의의 침전된 단백질을 제거하는 용액을 원심분리기(7,197 x g,20°C, 10분). 조심스럽게 깨끗한 원심 분리튜브에 상급을 옮김을 옮김을 옮김.</li>
	<li>LDH와 PK 효소("효소 믹스")를 함유한 마스터 믹스를 준비합니다. 각 분석판에 대해, 171.4 μL의 LDH 용액, 171.4 μL의 PK 용액 및 3189.3 μL 또는 3252.9 μl의 미오신 완충액을 각각 15 mL 간선 원심 분리튜브에 결합합니다. 집계 및 강수량을 피하기 위해이 시점에서 myosin을 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>모든 기판("기판 혼합")을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 각 플레이트마다 ATP 162.1 μL, PEP 162.1 μL, NADH 용액 324.1 μL을 15 mL 원소 원심분리튜브에 결합합니다. 집계 및 강수량을 피하기 위해 이 시점에서 액틴을 추가하지 마십시오.</li>
	<li>250 μM부터 교정을 위해 NADH의 7단계 직렬 1:2 희석을 생성합니다.<ol>
<li>1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 257.7 μL의 미오신 완충액과 NADH 스톡 용액 12.3 μL을 혼합합니다.</li>
		<li>7 개의 1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 미오신 완충액의 Aliquot 135 μL.</li>
		<li>제1 튜브에서 제2 튜브로 용액 135 μL을 전달하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 7번째 튜브에 도달할 때까지 반복합니다.</li>
		<li>마지막 튜브를 NADH 없음 제어(버퍼만 사용)로 사용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>8채널 파이펫을 사용하여 NADH 교정 솔루션의 20 μL을 삼중 분석 판의 첫 번째 행으로 이송합니다.</li>
	<li>효소 믹스에 68 μL의 심장 또는 4.2 μL의 골격 근 미오신 II를 추가합니다. 소용돌이 짧게.</li>
	<li>첫 번째 행을 제외하고, 자동 디스펜서를 사용하여 제조된 미오신 효소 혼합물의 8.4 μL을 분석 판의 각 웰내로 분배한다.</li>
	<li>100 nL 핀 툴 헤드가 장착된 자동 액체 처리 시스템을 사용하여 화합물 플레이트에서 효소 혼합을 함유하는 분석 판으로 100 nL의 용액을 전달합니다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 셰이커를 사용하여 실온에서 1200 rpm에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어줍니다.</li>
	<li>기판 혼합물에 원심 분리 된 액틴 용액의 4,052 μL을 추가하십시오. 소용돌이 짧게.</li>
	<li>11.6 μL의 액틴 기판 혼합물을 분석판의 각 웰(제1열 제외)에 분배하여 자동 디스펜서를 사용하여 효소 반응을 개시한다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 셰이커를 사용하여 실온에서 1200 rpm에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어줍니다.</li>
	<li>30s에 대한 101 x g에서 분석 판을 원심 분리기.</li>
	<li>플레이트 리더의 내부 온도가 25°C에서 안정화되었는지 확인합니다. 접시를로드하고 다른 30 s를 위해 흔들어. 이 흔들림 단계는 각 우물에서 액체 표면의 모양을 유사하게 하고 플레이트가 측정 온도에 도달할 수 있는 시간을 허용하기 위해 필요합니다.</li>
	<li>NADH 형광을 45초 간격으로 플레이트를 스캐닝하는 30분 동안 기록합니다. 425 nm 컷오프 이색 미러와 함께 380 nm, 10nm 대역폭 여기 필터 및 470 nm, 24 nm 대역폭 방출 필터를 사용합니다. 고농도 모드에서 측정을 실행합니다. 검정을 실행하기 전에 플래시, 검출기 게인, 플레이트 치수 및 측정 높이를 최적화합니다. 참고: 최종 분석 조건은 300 nM 심장/20 nM 골격 근 myosin II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 μM NADH, 1 mM PEP, 1mM ATP를 포함하는 완충제에서 10 mM MPS (pH = 7.0), m2M2M , 0.15 mM EGTA, 0.1 mg/mL BSA, 0.5% (v/v) DMSO 및 1 mM DTT. 총 부피는 20 μL / 웰입니다. 가장 높은 최종 화합물 농도는 50 μM. 20 μM파라-아미노블비스타틴에서 0.5% DMSO로 양성 대조군역할을 하며, 0.5% DMSO만이 음성 대조군이다. 모든 측정은 삼중 항으로 수행됩니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>각 웰에 대한 시간에 대해 관찰된 형광 강도를 플로팅합니다.</li>
	<li>간단한 선형 회귀를 수행하여 각 웰에 대한 형광 반응의 기울기 및 절편을 결정합니다. 경사는 ATP(NADH) 소비율에 비례하며, 절편은 측정 시작 시 NADH 농도에 비례합니다(t= 0s).</li>
	<li>NADH의 농도에 대하여 플레이트의 첫 번째 행에 대해 얻어진 절편을 플로팅하여 NADH에 대한 교정 곡선을 구성한다. 요격이 NADH 농도에 선형으로 종속되는지 확인합니다. 참고: 인터셉트는 t°C에서 읽는 원시 형광 강도의 평균보다 훨씬 더 자신감을 가지고 t=0s에서 실제 형광 강도를 추정합니다.</li>
	<li>간단한 선형 회귀를 수행하여 NADH 교정 선의 경사 및 절편을 가져옵니다. 참고: 절편은 형광 배경 신호(NADH 존재 없음)를 설명하고 경사는 특정 실험에서 1M NADH 용액의 추정/이론적 형광 강도에 해당합니다.</li>
	<li>NADH 교정 라인의 기울기에 의해 웰의 나머지 부분에 대해 얻어진 형광 반응의 경사를 나누어 형광 변화를 ATP 소비율로 변환합니다.</li>
	<li>억제제의 농도에 대해 ATP 소비율을 플로팅합니다.</li>
	<li>억제 상수를 결정하려면 간단한 일대일 바인딩 평형 모델에 해당하는 다음 이차 방정식에 용량 응답 데이터를 맞추기 위해 적절한 통계 소프트웨어를 사용합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60017/60017eq01.jpg" style="opacity: 0.9;"> 여기서 Y는 ATP 소비율이, Y민은 ATP 소비율이 억제제의 부재를 int, Ymax는 이론적 ATP 소비율이 100% 억제, KI는 저해상수 , [E]t 및 [I]t는 각각 효소(myosin) 및 억제제의 총 농도이다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

프로토콜의 중요한 단계
음의 제어만 있는 여러 플레이트(억제제 없는 ATPase 반응)를 실행하여 플레이트 레이아웃을 최적화합니다. 반응 속도의 패턴을 신중하게 검사합니다. 예를 들어, 이들은 "비 바인딩"플레이트의 친수성 표면 코팅의 가장자리 효과 및 / 또는 결함에서 발생할 수 있습니다. 패턴이 관찰되면 아티팩트를 최소화하기 위해 플레이트 유형 및/또는 플레이트 레이아웃을 변경합니다. 예를 들어, 일반적인 투여량-응답 곡선(삼중분액이 있는 16농도, 총 48점)은 3개의 컬럼 또는 384웰 플레이트에 2열로 배열될 수 있다. 이러한 배열은 각각 6데이터와 4개의 데이터 포인트를 생성하며, 이는 에지 효과의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 행 배열은 항상 바람직합니다.
수정 및 문제 해결
관찰된 형광 반응은 반응의 풀...

묘신은 진핵생물1,2에서액틴 세포골격의 필라멘트를 따라 방향운동을 생성하기 위해 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 가수분해하는 메카노케미컬 에너지 트랜스듀서이다. 그(것)들은 세포기관의 수송, 근육 수축 또는 세포골격 긴장의 생성과 같은 그들의 각종 세포내 기능에 구조적으로 그리고 운동적으로 적응한1,2. 상기 미오신 수퍼패밀리는 인간 게놈3,4에서~12개의 뚜렷한 묘신 클래스에 속하는 ~40개의 미오신 유전자로 나타난다. 미오신 클래스의 구성원은 여러 암, 신경 장애, 골격 근병증 및 비대성 심근병증5,6과같은 매우 다양한 장애 세트에서 다양한 역할을 한다. 이러한 분자 모터의 많은 생리적 및 병리학적 기능을 감안할 때, 다양한 조건에 대한 약물 표적으로 점점인식되고 있는 것은 놀라운 일이 아니다 7. 최근 새로운 미오신 억제제8,9,10 및 활성제11의발견에 상당한 진전이 이루어졌으며, 기존 12의 특성을개선하고, 13세 , 14세 , 15.
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 ATPase 분석기는 오랫동안 사르코플라스 망상 Ca2+ 펌프 ATPase16,DNA 수리 ATPase Rad5417,AAA+와 같은 다양한 효소의 ATPase 활성을 측정하는 데 사용되어 왔습니다. ATPase p9718 또는 미세소관 모터 키네신19. 이 분석은 ATP 재생 주기를 사용합니다. ATPase에 의해 생성된 아데노신 디포스페이트(ADP)는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생되며, 이는 인산피루바트(PEP)의 한 분자를 병렬로 피루베이트로 변형시킵니다. 그 후, 피루브산염은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소됩니다. 즉, 차례로, NAD에 NADH의 한 분자를 산화. 따라서, 시간의 함수로서 NADH 농도의 감소는 ATP 가수분해 속도와 같다. ATP 재생 주기는 PEP를 사용할 수 있는 한 ATP 농도를 거의 일정하게 유지하고 ADP 농도를 낮게 유지합니다. 이것은 선형 시간 과정을 초래, 쉽게 초기 반응 속도를 결정하고 ADP19에의해 제품 억제를 방지하는 데 도움이. NADH 결합 ATPase 분석은 이미 96 웰 포맷20에적응되었지만, 높은 반응 량 (~150 μL)은 시약의 높은 수요로 인해 상대적으로 비싸므로 많은 수의 빠른 스크리닝이 덜 가능합니다. 화합물. ATPase 효소에 의해 생성된 인산염의 검출에 의존하는 말라카이트 녹색 분석법19,21과같은 대체 방법은 소형화 및 고처리량 스크리닝(22)에 더 적합한 것으로 입증되었습니다. , 23세 , 24. 그러나 끝점 분석기는 풀 타임 과정이 없는 상태에서 발견되지 않은 상태로 남아있을 수있는 여러 유물 (아래에 설명됨)의 영향을받을 가능성이 높습니다.
여기서, NADH-결합 된 ATPase 분석기는 소분자 억제제의 반 높은 처리량 스크리닝에 최적화되었습니다. 골격 및 심장 근육 myosin II와 myosin 억제제 blebbistatin8, 파라-aminoblebbistatin13 및 파라-nitroblebbistatin12 는 NADH에 의존하는 분석의 힘을 입증하기 위하여 이용됩니다 판독으로 형광. 이 프로토콜은 모든 ADP 생산 효소에 초점을 맞춘 스크리닝 프로젝트에 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>384웰 로우 플랜지 블랙 플랫 바텀 폴리스티렌 NBS 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>ATP(아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Aurora FRD-IB 디스펜서</td><td>Aurora Discovery, Inc.</td><td></td><td></td>00017425</tr><tr><td>Biomek NXP 다채널 실험실 자동화 워크스테이션</td><td>Beckman Coulter</td><td>A31841</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>BSA (소 혈청 알부민, 프로테아제 무료)</td><td>Akron Biotech</td><td>AK1391&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430 R, 냉장, Rotor FA-35-6-30</td><td>Eppendorf</td><td>022620663</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430, 비냉장, Rotor A-2-MTP</td><td>Eppendorf</td><td>022620568</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td> 포함<td>&nbsp; 시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-디티오트레이톨)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip 멀티채널 피펫; 384-형식; 8-채널</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672010</td><td></td></tr><tr><td>E1 ClipTip 멀티채널 피펫; 96-형식; 8-채널</td><td>Thermo Scientific</td><td>4672080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&prime;-테트라아세트산)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 2104 멀티라벨 플레이트 리더</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0010</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>LDH (토끼 근육에서 추출한 L-젖산 탈수소효소)</td><td>Sigma</td><td>L1254</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (염화마그네슘 육수화물)</td><td>&nbsp; 시그마</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 셰이커</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 12620-926&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트, 384 웰, PP, 소량, 딥 웰, 천연</td><td>Greiner Bio-One</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-Morpholino)프로판설폰산)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Motor Protein (full length) (소 심장 근육)</td><td>Cytoskeleton&nbsp;</td><td>MY03</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle)</td><td>Cytoskeleton&nbsp;</td><td>MY02</td><td></td></tr><tr><td>NADH (&beta;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐염 수화물)</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (아지드화나트륨)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (수산화나트륨)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>광학 필터 CFP 470/24nm (방출)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5850</td><td>바코드 240</td></tr><tr><td>광학 필터 Fura2 380/10nm (여기)</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-5390</td><td>바코드 112</td></tr><tr><td>광학 모듈: 베타 락타마제</td><td>PerkinElmer</td><td>2100-4270</td><td>바코드 418</td></tr><tr><td>OriginPro 2017 소프트웨어</td><td>OriginLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>para-Aminoblebbistatin</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>para-니트로블레비스타틴</td><td>AMRI</td><td>N/A</td><td>맞춤형 합성</td></tr><tr><td>PEP(포스포(에놀)피루브산 모노칼륨염)</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>PK(토끼 근육에서 추출한 피루브산 키나아제)</td><td>Sigma</td><td>P9136</td><td></td></tr><tr><td>토끼 근육 아세톤 파우더</td><td>펠 프리즈 바이오로직스</td><td>41995-2</td><td></td></tr></tbody></table>

소분자 억제제 스크리닝을 위한 nadh 결합 atpase 분석의 반 높은 처리량 적응

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase 효소는 아데노신 삼인산에 저장된 자유 에너지를 활용하여 자발적으로 발생하지 않는 생체 내 다양한 엔더고닉 생화학 적 과정을 촉매합니다. 이 단백질은 물질 대사, 세포 분열, 환경 변화 및 운동에 대한 반응을 포함하여 세포 생활의 본질적으로 모든 측면에 중요합니다. 여기서 제시된 프로토콜은 소분자 ATPase 억제제의 반높은 처리량 스크리닝에 적응된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합된 ATPase 분석법을 기술한다. 이 분석법은 심장 및 골격 근 myosin II의, 원리의 증거로, 2개의 액틴 기지를 둔 분자 모터 ATPases에 적용되었습니다. ATP의 가수분해는 분석에서 효소 반응에 의해 NADH의 산화에 결합된다. 먼저, ATPase에 의해 생성된 ADP는 피루바테 키나아제(PK)에 의해 ATP로 재생성된다. PK는 포스포네놀피루바트(PEP)의 전이를 병렬로 피루브화로 촉매한다. 그 후, 피루브산은 젖산 탈수소 효소 (LDH)에 의해 젖산으로 감소되어 NADH의 산화를 병렬로 촉매합니다. 따라서, ATP 농도의 감소는 NADH 농도의 감소와 직접적으로 상관되며, 이는 NADH의 본질적인 형광에 대한 변화에 뒤따른다. PEP가 반응 시스템에서 사용할 수 있는 한, ADP 농도는 매우 낮게 유지되어 자체 제품에 의한 ATPase 효소의 억제를 피합니다. 또한 ATP 농도는 거의 일정하게 유지되어 선형 시간 코스를 생성합니다. 형광은 지속적으로 모니터링되어 데이터 품질을 쉽게 추정할 수 있으며 잠재적인 아티팩트(예: 복합 침전 또는 열 변화로 인한)를 필터링하는 데 도움이 됩니다.

선별 실험에 사용되는 일반적인 플레이트 레이아웃 맵은 그림1에 나와 있습니다. 첫 번째 행과 마지막 행은 NADH 교정 및 양성 제어(각각 20 μM para-aminoblebbistatin, 0.5% DMSO)를 위해 예약되어 있습니다. 나머지 행(B~O)은 화합물의 억제 활성을 테스트하는 데 사용된다. 여기서, 15단계 직렬 1:2 희석은 DMSO에서 10 mM 화합물 농도로부터 시작하여 화합물 플레이트로부터 분석판으로 제조 및 이송되고, 따라서 가장 높은 최종 화합물 농도가 50 μM(0.5% DMSO)이 되도록 분석판상에 있다. 두 행은 하나의 화합물(48개의 데이터 포인트/복합)에 대한 용량 응답 곡선을 가져오는 데 사용됩니다. 플레이트 레이아웃 맵은 지정된 프로젝트의 특정 목표를 지원하도록 다시 설계할 수 있습니다. 예를 들어, 많은 수의 화합물에 대한 단일 포인트 스크리닝 데이터를 얻는 것...

니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)-결합 된 ATPase 분석제는 소분자 미오신 억제제의 반고 처리량 스크리닝에 적응되었다. 이 운동 분석은 384웰 마이크로플레이트 형식으로 실행되며 총 반응량은 웰당 20 μL에 불과합니다. 이 플랫폼은 거의 모든 ADP 생산 효소에 적용되어야 합니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

이 프로토콜은 기본 연구를 위한 프로브 또는 잠재적인 임상 화합물을 위한 조사로 ATPase 억제제 개발을 목표로 하는 광범위한 선별 프로젝트에 적용됩니다. 이 방법은 반 고처리량 스크리닝 애플리케이션에 최적화되어 있습니다. 또한 여러 가지 일반적인 유물을 피하도록 설계되었으며 유해 물질 취급이 필요하지 않습니다.우리의 실험실에서 우리는 메담페타민 사용 장애의 치료를위한 새롭고 특정 비 근육 myosin II 억제제를 개발하기 위해이 분석체를 사용하고있다. 이론적으로, 이 방법은 ATP를 생성하는 모든 효소에 쉽게 적용될 수 있다. 시각적 데모는 모든 중요한 기술적 세부 사항을 명확히 하는 데 도움이 됩니다.먼저 액틴 버퍼에 농축액틴 스톡 용액을 희석시킴으로써 각각 384웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트에 대해 20마이크로몰라 희석 액틴 액틴 용액4, 500 마이크로리터를 준비한다. 점도와 이질성을 줄이기 위한 액틴 필라멘트를 깨기 위해 30회 위아래로 파이프를 사용하여 솔루션을 철저히 섞습니다. 그런 다음 면소한 단백질을 제거하기 위한 용액을 원심분리합니다.상체를 깨끗한 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 골격 근 근 근 II, 171.4 마이크로리터 및 PK 용액의 171.4 마이크로리터를 포함하는 분석법에 대한 미산 완충제의 3, 252.9 마이크로리터를 결합하여 각 분석 플레이트에 대한 15밀리리터 원추형 원심분리기 튜브에 마스터 효소 믹스를 준비한다. ATP 162.1 마이크로리터, PEP 162.1 마이크로리터, NADH 용액324.1 마이크로리터를 결합하여 각 플레이트에 대해 15밀리리터 원심분리기 튜브에 마스터 기판 믹스를 준비한다.집계 및 침전을 피하기 위해 이 시점에서 액틴을 추가하지 마십시오. 교정을 위해 NADH의 7단계 직렬 1대2 희석제를 만들려면 8개의 1.5밀리리터 미세원심분리관을 준비하십시오. NADH 스톡 용액 12.3 마이크로리터를 첫 번째 튜브에 미오신 버퍼 257.7 마이크로리터와 혼합하여 250 마이크로몰라 용액을 만듭니다.그런 다음 미오신 버퍼135마이크로리터를 나머지 7개의 튜브에 각각 넣습니다. 제1 튜브에서 두 번째로 용액의 135 마이크로리터를 옮기고 파이펫팅하여 혼합합니다. 일곱 번째 튜브에 도달할 때까지 반복합니다.마지막 튜브를 버퍼만 사용하여 NADH 컨트롤이 없는 경우 를 사용합니다. 항상 화합물 플레이트에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 포함하고, 분석 플레이트에 교정을 위한 NADH 희석제. 이러한 컨트롤은 데이터 분석 중에 아티팩트를 식별하는 데 매우 중요합니다.8채널 파이펫을 사용하여 NADH 교정 솔루션의 20마이크로리터를 분석 플레이트의 첫 번째 행으로 옮킨다. 이제 효소 믹스에 골격 근 미오신 II의 4.2 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이가 짧게.분배 하기 직전에 효소 믹스에 myosin를 추가 합니다. 희석된 myosin 솔루션의 긴 잠복은 침수로 인한 활동 손실, 플라스틱 표면에 대한 비특이적 결합을 초래할 수 있습니다. 준비된 미오신 효소 믹스를 자동 디스펜서의 샘플 용기 중 하나에 적재합니다.플레이트에서, 첫 번째 행을 제외하고, 미오신 효소의 8.4 마이크로리터를 분석 플레이트의 각 웰에 분배한다. 그런 다음 분석 플레이트와 복합 플레이트를 100 나노리터 핀 공구 헤드가 장착된 자동화된 액체 처리 시스템의 실험실웨어 포지셔너에 놓습니다. 그런 다음 소프트웨어에서 100 나노리터의 용액을 제조된 화합물 플레이트에서 분석 플레이트로 전송하는 적절한 방법을 실행한다.다음으로, 마이크로 플레이트 셰이커에 분석 판을 놓고 실온에서 1 분 동안 흔들어 1, 200 rpm. 기판 혼합 및 소용돌이에 원심 분리 액틴 용액의 4, 052 마이크로리터를 간략하게 추가합니다. 효소 반응을 시작하려면, 첫 번째 행을 제외하고, 자동 디스펜서를 사용하여 분석 플레이트의 각 웰에 액틴 기판 믹스의 11.6 마이크로리터를 분배한다.마이크로 플레이트 셰이커에서 1, 200 rpm에서 실온에서 1 분 동안 분석 판을 흔들어보십시오. 분석 플레이트를 101배 g에서 30초 동안 원심분리합니다. 380나노미터, 10나노미터 대역 폭 발산 필터, 470나노미터 대역 폭 방출 필터, 24나노미터 대역 폭 방출 필터를 425나노미터 컷오프 이차성 거울과 함께 사용한다.에세이를 실행하기 전에 깜박임, 검출기 게인, 플레이트 치수 및 측정 높이수를 최적화합니다. 고농도 모드에서 측정을 실행합니다. 플레이트 판독기의 내온이 섭씨 25도에서 안정되었는지 확인하십시오.플레이트 판독기에 플레이트를 적재하고 30초 동안 흔들어 액체 표면의 모양을 각 우물에서 유사하게 만들고 플레이트가 측정 온도에 도달할 수 있도록 합니다. 45초 간격으로 플레이트를 스캔하고 NADH 형광을 30분 동안 기록합니다. 내보낸 데이터를 사용하여 각 웰에 대해 시간에 대해 관찰된 형광 강도를 플롯합니다.간단한 선형 회귀를 수행하여 각 웰에 대한 형광 반응의 경사 및 가로채기를 결정합니다. 경사는 ATP 소비속도의 근사치로 사용될 수 있는 NADH 소비속도에 비례한다. 요격은 측정 의 시작 부분에 NADH 농도에 비례한다.이어서, NADH의 농도에 대하여 플레이트의 첫 번째 행에 대해 얻어진 요격을 플로팅하여 NADH에 대한 교정 곡선을 구성한다. 요격은 처음에 읽는 원시 형광 강도의 평균보다 훨씬 더 자신감으로 처음에 실제 형광 강도를 추정합니다. 간단한 선형 회귀를 수행하여 NADH 교정 선의 경사 및 가로채기를 가져옵니다.여기서, 차단은 NADH가 없는 형광 배경 신호를 설명하고, 경사는 하나의 어금음 NADH 용액의 추정된 이론형 형광 강도에 해당한다. 형광 변화를 ATP 소비속도로 변환하기 위해 NADH 교정 라인의 경사에 의해 나머지 우물에 대해 얻어진 형광 반응의 경사를 나눕니다. 다음으로, 억제제의 농도에 대해 ATP 소비속도를 플롯한다.억제 상수를 확인하려면 Origin 2017과 같이 비선형 곡선 피팅이 가능한 적절한 통계 소프트웨어를 사용하십시오. 간단한 일대일 결합 평형 모델에 대응하는 이차 방정식에 용량 반응 데이터에 맞게 비선형 곡선 을 선택합니다. Y는 ATP 소비율입니다.Y-최소는 억제제가 없는 경우 ATP 소비율이다. Y-최대는 이론ATP 소비율 100%억제이다. t 와 t는 각각 미신 효소 및 억제제의 총 농도이다.KI는 억제 상수입니다. 이 연구에서는, 골격 및 심장 근육 myosin II ATPase 반응은 사용된 미오신 또는 억제제의 존재에 관계없이 선형 형광 강도 의 흔적을 보였다. 기저 및 액틴 활성화 ATPase 속도는 골격 또는 심장 근육 myosin II.A 스크리닝 윈도우 계수 또는 0.78의 Z 계수의 농도에 선형 의존성을 보였다 매우 잘 분리 된 긍정적이고 부정적인 제어와 신뢰할 수있는 분석법을 나타냈다.Blebbistatin, 파라 아미노블비스타틴, 그리고 파라 니트로블비스타틴은 보고된 용해도 값 이하의 정기적인 투여량 반응 곡선을 보였습니다. 심장 및 골격 근 근 근 모두에 대한 억제 상수는 데이터에 간단한 평형 결합 모델을 나타내는 이차 방정식을 피팅하여 결정되었다. 골격 근 근 근 II를 사용 하 여 ATPase 분석에서 얻은 blebbistatin에 대 한 형광 강도 추적 존재 억제제의 양에 따라 정상적인 선형 감소 신호를 보였다.그러나, 블리스타틴의 용해도 이상으로 신호의 예기치 않은 증가가 밝은 플로레스센트 블비스타틴 결정의 형성으로 인해 가장 가능성이 높은 것으로 관찰되었다. 정상적인 생 형광 강도 추적을 가진 파라-니트로블비스타틴의 경우, 강수량으로 인해 결정된 투여량 반응 곡선으로부터 용해도 이상으로 얻어진 반응 속도가 발산된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기본 연구에서 과학 도구로 또는 미래에 직접 후보로 사용될 수있는 새로운, 강력하고 선택적 myosin 억제제를 개발했다.그것은 항상 다른 ATPase 또는 실제와 거짓 긍정적인 안타를 구별 하는 관심의 효소에 특정 다른 기능 적인 분석 사용 하는 것이 좋습니다. 모든 단백질은 플라스틱 표면을 결합합니다. 이 문제는 특히 단백질이 낮은 농도에서 존재하는 경우에 결과에 크게 영향을 미칠 수 있습니다.항상 불필요한 액체 처리를 피하고 구속력이 없는 튜브를 사용하십시오. 대체 ATPase 어약은 일반적으로 황산, 독성 물질 또는 방사성 물질의 취급이 필요합니다. 대조적으로, NADH 연결 ATPase 분석법은 독성이 없거나 매우 낮은 시약을 필요로합니다.

a-semi-high-throughput-adaptation-nadh-coupled-atpase-assay-for

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연구

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Biochemistry

생화학

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

HCN 채널과 보조 서브 유닛 사이의 상호 작용은 주요 우울 장애의 치료 대상으로 확인되었습니다. 여기서,이 단백질 - 단백질 상호 작용의 소분자 억제제를 식별하기위한 형광 편광 - 기반 방법이 제공된다.

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

SAMHD1은 인체 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 디옥시뉴클레오시드 삼인산삼인산삼인산가수분해효소입니다. 여기에서는 SAMHD1 기질, 활성제 및 억제제로서 소분자 및 뉴클레오티드 유사체를 평가할 수 있는 384웰 마이크로플레이트 형식으로 배포된 다목적 효소 결합 SAMHD1 활성 분석을 제시합니다.

dNTPase SAMHD1과의 저분자 상호작용을 프로브하기 위한 고처리량 효소 결합 활성 분석

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 프로토콜은 FEN1(Flap Endonuclease 1) 활성 및 억제제 개발을 측정하기 위한 겔 시프트 생화학적 분석을 설명합니다.

FEN1 nuclease 활성의 형광 기반 검출 및 소분자 억제제의 스크리닝

배우세요 NADH 결합 ATPase 분석법을 이용한 반 높은 처리량 소분자 억제제 스크리닝 방법입니다. 이 기술은 비근육 미오신 II 억제제 개발 및 메스암페타민 사용 장애 치료 연구에 활용됩니다.

소분자 억제제 스크리닝을 위한 NADH 결합 ATPase 분석의 반 높은 처리량 적응

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