Name: 멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 배우세요 정량적 다중 면역 침전(QMI)을 이용한 단백질 상호작용 네트워크 분석 방법을. 이 기술은 최소한의 생물학적 샘플로 신호전달 경로 역학을 고효율로 연구할 수 있습니다.

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저자는 QMI 분석 개발에 중요한 기여에 대한 테사 데이비스를 인정하고 자합니다, 기술 지도 및 지적 입력스미스와 슈럼 연구소의 현재와 전 회원. 이 작품은 NIMH 보조금 R01 MH113545 및 R00 MH 102244에 의해 지원되었다.

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<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+protein+complexes+isolated+from+primary+human+skin-resident+T+cells+can+be+analysed+by+Multiplex+IP-FCM%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM.</a> Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).</li>
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<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+immunoprecipitation+detected+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Expiriments%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).</li>
<li>Smith, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM+measures+physiologic+protein-protein+interactions+modulated+by+signal+transduction+and+small-molecule+drug+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition.</a> PLoS One. 7 (9), 45722(2012).</li>
<li>Lautz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+changes+in+synaptic+protein+complex+composition+are+consistent+in+different+detergents+despite+differential+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22BioRXiv%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility.</a> BioRXiv. , (2019).</li>
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</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

QMI 분석법은 항체 패널 개발, 장비 및 시약에 상당한 투자가 필요하지만, 일단 분석이 확립되면 실험적으로 제어되는 단백질 상호 작용 네트워크를 관찰하는 고차원 데이터를 수집할 수 있습니다. 자극. 기술적으로 QMI는 시료 및 항체 유정 위치의 신중한 파이펫팅 및 추적이 필요합니다. 분석 판에 신중하게 라벨을 붙이는 것은 종이에 우물 위치의 상세한 템플릿을 만드는 것과 같이 유용하며, 이는 데이터 분석을 위해 저장됩니다. 유세포계 마이크로플레이트 캐리어(사용자 지정 냉장 지침의 경우 그림 S1 참조)를 포함하여 구슬과 용해액을 항상 차갑게 유지하는 것의 중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다. 단백질 상호 작용은 실온에서 빠르게 해리되며, 수정되지 않은 실온 유동 세포계를 사용하는 초기 시도는 많은 온도-불안정한 상호 작용의 식별로 끝났지만 의도된 대로 변경되지는 않습니다. 자극.
QMI는 항체 기반 분석기이므로 항체의 초기 선택이 중요합니다....

동적 단백질-단백질 상호 작용은 대부분의 세포 생리학1의 기능적 기초인 분자신호 캐스케이드 및 운동성 구조를 구성한다. 이러한 프로세스는 종종 단일 입력을 기반으로 정상 상태 사이를 전환하는 선형 신호 경로로 묘사되지만 실험 및 모델링 데이터는 통합 네트워크 2,3 . 4.G 단백질의 경우, 다른 수용체는 종종 동일한 G 단백질을 활성화할 수 있으며, 단일 수용체는또한 G 단백질 5,6의한 가지 유형 이상을 활성화시킬 수 있다. 상대적으로 적은 수의 G 단백질 클래스가 시냅스 전송, 호르몬 조절 및 세포 이동과 같은 광범위한 세포 기능을 구체적으로 조절하기 위해서는 세포가 이러한 신호를 통합하고 분화해야 합니다4 , 5. 증거는 이 신호 특이성이 G 단백질뿐만 아니라 다른 사람에 대해, 주로 미세 조정 된 단백질 - 단백질 상호 작용 및 시간 역학 1,3에기초하여 파생된다는 것을 보여주었습니다. 4개 , 5개 , 6개 , 7. 시그널링 네트워크는 여러 입력, 출력 및 피드백 루프가있는 동적 단백질 복합체로 구성되기 때문에 단일 섭동은 세포의 생리학4의 전반적인 적시 성 균형을 변경할 수있는 기회를 가합니다. ,7. 이제 여러 입력의 통합이 건강과 질병7,8에서개별 세포 기능을 제어하는 방법을 더 잘 이해하기 위해 네트워크 관점에서 신호를 검사해야한다는 것이 널리 동의됩니다. 9,10,11,12,13. 이에 비추어, 정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 동적 단백질 상호작용 네트워크의 배 변화에 대한 중간 처리량, 정량적 데이터를 수집하기 위해 개발되었다.
QMI는 세포 용해가 형광 염료의 뚜렷한 비율을 포함하는 자기 구슬에 공유결합되는 면역 침전 항체의 패널로 배양되는 항체 기지를 둔 분석입니다. 뚜렷한 자기 비드 클래스에 결합된 특정 항체를 갖는 것은 동일한 용해물로부터 다중 표적 단백질의 동시 동시 동시 면역 침전을 허용한다. 면역 침전 (IP)에 이어, 자기 비드는 두 번째, 형광 공형 프로브 항체 (또는 플루오로포폴화 된 스트렙타비딘과 함께 생체 면역 항체)로 배양됩니다. 각 IP 항체 프로브 항체 쌍또는 PiSCES (노출된 표면 에피토프에 의해 검출된 공유 복합체의 단백질)에 의해 인식된 단백질 간의 공동 연결은 유세포 측정에 의해 검출되고 서로 다른 사이에서 정량적으로 비교될 수 있습니다. 샘플 조건14. 도 1의 그림은 형광공응접체 프로브 항체에 의해 표지된 면역침전성 단백질 복합체를 가진 자기 비드의 다이어그램을 포함하여 QMI 분석을 실행하는 데 관여하는 단계를 보여 준다(도1C).
QMI의 감도는 면역 침전에 사용되는 자기 비드의 수에 비해 용해물의 단백질 농도에 따라 달라지며, 10% 배 변화를 검출하는 분해능을 달성하는 것은 다른 것에 비해 소량의 시작 물질만필요로 한다. 공동 IP 방법14,15. 예를 들어, QMI에 사용되는 시작 물질의 양은 샌드위치 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)에 필요한 것과 유사하지만, 단일 QMI 분석에서 여러 상호작용이 검출된다. 20개의 IP 및 20개의 프로브 표적을 사용하여 QMI 표적은 4 mm 피부 생검으로부터 분리된 1-5 x 10 5차 T 세포를 사용하여 수행되었으며, P2 시냅소탈 제제는 마우스 전두엽 피질의 3 mm 관상 동맥 부편에서, 또는 3 x 106 배양 마우스 프라이머리를 사용하여 수행되었다. 피질 뉴런14,16,17. 이 감도는 임상 견본과 같은 제한된 가용성을 가진 세포 또는 조직의 분석을 위해 QMI를 유용하게 합니다.
QMI는 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크(항체가 사용 가능)에 대해 적응할 수 있으며, 현재까지 뉴런의 글루타마테르지시냅스에서 T 세포 항원 수용체(TCR) 신호체 및 단백질의 서브세트를 분석하기 위해 개발되었습니다. 17세 , 18.T 세포 수용체 신호의 연구에서, QMI는 먼저 PiSCES에서 자극 유발 변화를 식별하기 위해 사용되었다, 다음 대조군에서 자가 면역 환자를 구별하기 위해, 내인성 자가 면역 신호를 감지하고, 마지막으로 생성하는 상호 작용의 불균형 질병 관련 하위 네트워크와 관련된 가설14. 보다 최근에는 동일한 QMI 패널이 TCR 관련 단백질 신호(19)의 질적 차이보다는 정량적차이에 의해 결정되는 흉선 선택이 결정되는 것을 결정하는데 사용되었다. 뉴런에서, QMI는 시냅스 가소성17의새롭게 떠오르는 모델을 지원하는 방식으로 뚜렷한 유형의 입력 신호에 대한 단백질 상호작용 네트워크의 입력 특이적 재배열을 설명하는 데 사용되었다. 또한, 이 시냅스 QMI 패널은 자폐증의 7개의 마우스 모델에서 차이를 식별하고, PiSCES 생체 서명을 기반으로 모델을 하위 그룹으로 클러스터화하고, 이전에는 인식되지 않았던 공유 분자 적자를 정확하게 가설하는 데 사용되었습니다. 모델 16중 하나에서 . 유사한 접근은 다른 약 처리에 반응할 수 있는 그밖 소집단을 위해 가리기 위하여 이용될 수 있었습니다, 또는 특정 반응하는 하위 단에 약을 할당하. QMI는 기초 과학 이외에 진단, 환자 서브 타이핑 및 약물 개발에 잠재적인 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
QMI 항체 패널을 조립하기 위해, 초기 항체 스크리닝 및 선택 프로토콜은 아래 섹션 1에 기재되어 있다. 항체 패널이 확인되면, IP를 위한 자기 비드에 선택된 항체의 컨쥬게이션을 위한 프로토콜, 그리고 선택된 프로브 항체의 생체 측질화를 위한, 섹션 2에서 기술된다. 세포 또는 조직 용해에 대한 QMI 분석을 실행하기 위한 프로토콜은 섹션 3에 기재되어 있다. 마지막으로 단일 실험에서는 ~5 x105개의 개별 데이터 포인트를 생성할 수 있기 때문에 데이터 처리, 분석 및 시각화를 지원하는 지침과 컴퓨터 코드가 섹션 4에 제공됩니다. 2-4절에 설명된 워크플로의 개요는 그림1에 나와 있습니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 평평한 바닥 플레이트</td><td>Bio Rad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>96웰 PCR 플레이트</td><td>VWR</td><td>82006-704</td><td></td></tr><tr><td>Bioplex 200 시스템(HTF</td><td>포함) Bio Rad</td><td>171000205</td><td>부분적으로 냉장 보관하도록 수정됨, 자세한 내용은 그림 S1 참조</td></tr><tr><td>Bio-Plex Pro Wash Station</td><td>Bio Rad</td><td>30034376</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML 비드</td><td>Invitrogen</td><td>C37481</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39256</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex 마이크로스피어 Luminex</td><td></td><td>MC12xxx-01</td> xxx는 항체 정제 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td> 에 사용되는 3자리 비드 영역인 Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206</tr>입니다.<tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 필름, 비멸균</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0000</td><td></td></tr><tr><td>포스포타제 억제제 칵테일 #2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>샌드위치 준비 냉장고</td><td>Norlake</td><td>SMP 36 15</td><td>Bioplex 200 Sodium의 맞춤형 냉장용</td></tr><tr><td> 불소</td><td>시그마</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>오르토바나데이트 나트륨</td><td>시그마</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BioLegend</td><td>405204</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39269</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr></tbody></table>

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

동적 단백질-단백질 상호 작용 제어 세포 행동, 운동성에서 DNA 복제 신호 변환에. 그러나, 단백질 상호 작용 네트워크에서 여러 단백질 간의 동적 상호 작용을 모니터링하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서, 우리는 노출에 의해 검출된 공유 복합체에 있는 단백질의 상대적인 형광 측정에 근거를 둔 단백질 상호 작용에 있는 배 변경의 정량적인 평가를 허용하는 정량적 멀티플렉스 면역 침전 (QMI)를 위한 프로토콜을 제시합니다 표면 에피토프 (PiSCES). QMI에서, 세포 용해물에서 단백질 복합체는 PiSCES의 풍부를 정량화하기 위하여 다른 단백질을 위한 표지된 항체로 그 때 마이크로스피어로 면역 침전되고, 그 때 조사됩니다. 면역 침전 항체는 다른 MagBead 스펙트럼 지구에 공액화되어 유동 세포계가 다중 병렬 면역 침전을 분화하고 동시에 각각과 관련된 프로브 항체의 양을 정량화할 수 있습니다. QMI는 유전 적 태깅을 필요로하지 않으며 다른 면역 침전 방법에 비해 최소한의 생체 재료를 사용하여 수행 할 수 있습니다. QMI는 상호 작용하는 단백질의 임의의 정의된 단에 적응될 수 있고, 지금까지 T 세포 및 신경 글루타메이트 시냅스에서 신호 네트워크를 특성화하는 데 사용되어 왔다. 결과는 잠재적인 진단 및 치료 응용을 가진 새로운 가설 생성으로 이끌어 냈습니다. 이 프로토콜에는 초기 항체 패널 선택부터 실행 분석 및 데이터 분석에 이르기까지 QMI를 수행하는 지침이 포함되어 있습니다. QMI 분석법의 초기 조립은 패널을 생성하는 스크리닝 항체를 포함하고, 경험적으로 적절한 라시스 완충액을 결정한다. 후속 시약 제제는 MagBeads에 면역 침전 항체를 공유결합하고, 생물항제 프로브 항체를 포함하므로 스트렙타비딘-컨쥬게이트 형광에 의해 표지될 수 있다. 분석기를 실행하기 위해, 매사염은 하룻밤 동안 MagBeads와 혼합된 다음, 구슬을 다른 프로브 항체로 분할 및 배양한 다음, 불소 라벨을, 및 유세포 분석으로 읽습니다. 두 가지 통계 테스트가 수행되어 실험 조건간에 크게 다른 PiSCES를 식별하며, 히트맵 또는 노드 에지 다이어그램을 사용하여 결과를 시각화합니다.

항체 스크리닝 그림 2 B는 코넥신36 단백질에 대한 스크린의 결과를 나타낸다. 대부분의 IP_probe 조합은 IgG 컨트롤에 대한 신호를 생성하지 않습니다. 단일클론 항체 1E5 및 1E5 또는 폴리클로날 항체(6200)를 가진 프로브를 가진 IP는 IgG 대조군과 비교하여 비드 분포에서 우회적인 변화를 일으킨다. 여기서, IP 1E5 및 프로브 6200poly는 IP 및 프로브와 동일한 항체를 사용하지 않기 위해 선택되었으며, 둘 다 2개의 독립적인 항체에 의해 인식되는 비특이적 단백질의 확률을 감소시키고, 이를 사용하여 공동 연관성을 검출할 확률을 증가시키기 위해 선택되었다. 다른 에피토프. IgG 컨트롤에 비해 최소 1-2로그 가 더 높은 MFI를 사용하는 IP_probe 조합을 선택하는 것이 가장 좋지만, 대안이 없는 경우 컨트롤과 일관되게 구별되는 약한 MFI를 생성하는 쌍이 사용될 수 있습니다. ...

정량적 멀티플렉스 면역침전(QMI)은 두 샘플 간의 표적 단백질-단백질 상호 작용의 풍부성에 대한 민감한 검출을 위해 유세포분석기를 사용합니다. QMI는 소량의 생체 물질을 사용하여 수행될 수 있고, 유전자 조작 태그를 필요로 하지 않으며, 이전에 정의된 단백질 상호작용 네트워크에 적응될 수 있다.

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

정량적 멀티플렉스 공동 면역 침전물 또는 QMI를 사용하면 미리 정의된 단백질 상호 작용 네트워크에서 수백 개의 이진 상호 작용을 동시에 측정할 수 있습니다. 동일한 lysate에서 동시에 여러 공동 IP를 수행함으로써 생물 정보학 기술은 공동 연관 그룹이 조정 된 방식으로 어떻게 변화하는지 검사 할 수 있습니다. 분석은 개발하는 데 시간이 많이 걸리지만 QMI 패널이 네트워크 스케일에 들어가면 비교적 간단하게 하룻밤 사이에 신호 전달 시스템에 대해 수집할 수 있습니다.QMI는 96 웰 플레이트에 다른 샘플 및 시약의 정확한 파이펫팅이 필요합니다. 오류를 방지하기 위해 각 분석기를 설정하고 실행할 때주의 깊게 주의해야 합니다. 시료 제제 및 면역 침전을 위해, 얼음에 15 분 동안 프로테아제 와 인산 억제제와 적합한 세제에서 샘플을 lysing하여 시작합니다.인큐베이션의 끝에서, 멤브레인과 파편을 제거하고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 결정하기 위해 상체에 BCA 분석기를 수행하기 위해 샘플을 아래로 회전. 단백질 농도를 정상화한 후 각 클래스당 약 250개의 마그네틱 비드가 포함된 마그네틱 비드 마스터 믹스를 준비합니다. 자기 분리를 사용하여 플라이 P 버퍼에서 두 번 마그네틱 비드 믹스를 세척한 후 샘플당 플라이 P 버퍼 20 마이크로리터에서 구슬을 다시 분리합니다.철저한 파이펫팅 후, 시료당 20마이크로리터의 비드를 하나의 얼음 냉간 미세센심분리기 튜브에 넣고 면역 침전을 위해 각 튜브에 정규화된 단백질 농도와 동일한 양의 리세이트를 추가합니다. 그런 다음 각 lysate 샘플을 실행하는 각 플레이트에 대해 하나의 튜브로 나누고 빛으로부터 밤새 보호되는 섭씨 4도에서 회전기의 샘플을 면역 침전시합니다. 다음 날 아침, 마그네틱 비드 랙을 사용하여 첫 번째 튜브 세트에서 용액을 제거하고 세척당 얼음 차가운 플라이 P 버퍼 500 마이크로리터에서 구슬을 두 번 세척합니다.재서스펜션 부피를 계산한 후, 얼음 냉기 P 버퍼의 계산된 부피에서 면역침전염을 회수한다. 부드러운 파이펫팅으로 마그네틱 구슬을 철저히 재연하고 얼음 위에 평평한 바닥 96 웰 플레이트를 가로질러 우물당 25마이크로리터의 구슬을 분배합니다. 다른 96 웰 플레이트에서, 2회 작동 농도로 아티네이트 프로브 항체에 의해 희석한다.멀티채널 파이펫을 사용하여 각 프로브 항체 희석제 25마이크로리터를 분석 플레이트를 함유한 마그네틱 비드의 적절한 우물에 분배하고 수평 플레이트 셰이커에서 고속으로 흔들어 자기 비드를 혼합하고 재보펜한다. 혼합 후 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양 속도를 줄입니다. 인큐베이션이 끝나면 4°C의 마그네틱 플레이트 와셔에 세척당 신선한 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 씻습니다.마지막 세척 후, 플라이 P 버퍼에서 1~200을 희석한 스트렙타비딘 PE의 50 마이크로리터에서 구슬을 재연한다. 혼합물을 흔들고 빛으로부터 보호 30 분 동안 섭씨 4도에서 접시를 배양하기 전에 구슬을 다시 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면, 4°C에서 마그네틱 플레이트 와셔에 플라이 P 버퍼로 플레이트를 세 번 세척하고 플라이 P 버퍼의 125 마이크로리터에서 구슬을 재놓습니다.900 회전에서 1 분 동안 접시를 흔들어 구슬을 철저히 재일시 중단하고 플레이트를 냉장고된 흐름 사이토미터에 로드합니다. 유량 사이토미터 소프트웨어에서 고RP1 대상 설정, 지역당 1, 000개의 비드의 정지 조건 및 80마이크로리터의 샘플 부피를 선택합니다. 중간쯤 에 실행을 일시 중지하고 침전을 방지하기 위해 구슬을 다시 일시 중지합니다.실행이 끝나면 데이터 파일을 XML 형식으로 내보냅니다. ANC 분석을 수행하려면 ANC 입력 파일을 작성하여 실험 설계의 세부 정보를 반영하고 프로그램을 실행하여 활성 디렉터리에 CSV 파일을 작성합니다. 파일이 조회수로 끝납니다.csv는 4개의 실험 복제 중 적어도 3개에서 대조군과 실험 조건 사이의 0.05의 거짓 양성 수준에서 현저하게 다른 단백질 공동 협회를 보고합니다. 가중 상관 관계 네트워크 분석을 위해 Mfi로 끝나는 Matlab에 의해 데이터 파일 출력의 열 제목을 붙여 넣습니다. csv는 새로운 스프레드시트의 첫 번째 열에 넣고 실험 적 치료 및 분석할 다른 변수를 위한 실험 횟수 및 치료를 위한 컬럼 실험을 추가합니다.이 파일을 특성으로 저장합니다. csv 및 오픈 R 스튜디오. 작업 디렉터리를 mfi가 포함된 폴더로 설정합니다.csv 와 특성. csv 파일, 코드의 섹션을 강조 표시하고 명령 입력을 누르고 주석 명령 파일에 표시된 대로 R 명령을 실행합니다. 각 실험 특성과 크게 상관관계가 있는 가중 상관 관계 네트워크 분석 모듈은 그래픽 파일로 출력되며 각 모듈과의 상호 상관 관계는 CSV 파일로 출력됩니다.ANC 출력 파일의 각 상호 작용에 대해 CNA에서 해당 상호 작용이 중요한지 확인하고 각 ANC 히트가 CNA 히트인지를 나타내는 새 열을 만듭니다. 값을 변환하여 두 배 변경으로 기록하고 모든 ANC 유니온 CNA 조회의 평균 값을 계산합니다. 마지막으로, 각 ANC 유니온 CNA 히트한 각 ANC 조합 CNA히트를 한 열의 면역 침전 목표, 두 번째 열의 프로브 대상 및 세 번째 열의 접이식 변경 값으로 만듭니다.이 파일을 네트워크로 Cytoscape로 가져와 노드 에지 다이어그램을 만듭니다. 두 개의 독립적인 통계 적 접근법에 의해 확인된 고신뢰도 단백질 상호 작용은 오픈 소스 소프트웨어, Cytoscape를 사용하여 노드 엣지 다이어그램또는 보충 자료에 포함된 R 코드 및 분석 지침을 사용하여 히트맵으로 시각화됩니다. 프로토콜 전반에 걸쳐 사용자는 파이펫을 정확하게 주의하고, 세심한 기록을 보관하고, 샘플을 항상 차갑게 유지해야 합니다.우리는 신호 변환 경로가 다른 입력 유형을 구별하고 다중 수용체에서 정보를 통합하는 방법을 이해하기 위해 QMI를 사용했다.

quantification-protein-interaction-network-dynamics-using-multiplexed

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 TRUE와 FALSE 단백질 단백질 상호 작용을 구별하기 이전에 도입 된 QUICK (최저과 결합하여 정량 Immunoprecipitation) 접근 방식의 변화를 제시한다. 우리 접근 방식은...

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

우리는 데이터 전처리, 공동 발현 클러스터링, 경로 농축 및 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크 분석을 포함한 상세한 프로토콜과 함께 정량적 단백체학 데이터에 대한 네트워크 분석을 수행하고 시각화하는 시스템 생물학 도구 JUMPn을 제시합니다.

JUMPn: 프로테오믹스의 단백질 공동 발현 클러스터링 및 네트워크 분석을 위한 간소화된 응용 프로그램

여기에서는 일련의 호환 가능한 벡터를 사용하여 차등적으로 태그된 단백질의 박테리아 공동 발현 방법을 설명한 다음 시험관 내에서 조립할 수 없는 단백질 복합체를 연구하기 위한 기존의 풀다운 기술을 설명합니다.

까다로운 단백질-단백질 상호작용을 테스트하기 위한 시간 효율적인 도구로서 박테리아 세포의 공동 발현과 결합된 풀다운 분석

이 프로토콜은 질량 측광법과 새로운 미세유체역학 시스템을 결합하여 저친화성 단백질-단백질 상호 작용을 조사합니다. 이 접근법은 용액에서 고도로 농축된 복합체의 빠른 희석을 기반으로 하며, 이를 통해 저친화성 측정이 가능하고 질량 측광법의 적용 가능성이 넓어집니다.

Microfluidics와 질량 광도계를 결합하여 Micromolar 농도에서 단백질 복합체 형성 분석

단백질-단백질 상호작용은 표적 단백질의 기능을 규명하는 데 중요하며, co-IP(co-immunoprecipitation)를 통해 PPI를 쉽게 확인할 수 있습니다. 에피토프 태그 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 HEK-293 세포에 임시로 transfection하고 두 타겟 단백질의 결합을 쉽게 확인할 수 있는 면역침전 방법을 개발했습니다.

단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 Anti-Epitope Tag Affinity Gel을 사용한 면역침전

여기에서는 화학 프로브 및 질량 분석법을 사용하여 천연 세포 및 조직에서 질병 특이적 단백질-단백질 상호 작용을 포착하고 식별할 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 결과 상호 작용 데이터 세트는 전용 웹 기반 플랫폼을 통해 분석되어 질병과 관련된 동적 네트워크 기능 장애 및 경로 변경을 밝힙니다.

질병에서 기능 장애 단백질-단백질 상호 작용 매핑

배우세요 정량적 다중 면역 침전(QMI)을 이용한 단백질 상호작용 네트워크 분석 방법을. 이 기술은 최소한의 생물학적 샘플로 신호전달 경로 역학을 고효율로 연구할 수 있습니다.

멀티플렉스 동시 면역 침전을 이용한 단백질 상호 작용 네트워크 역학의 정량화

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