Name: 1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 학습하세요 EGFP 공동형질도입을 활용한 1차 대뇌피질 뉴런의 신경돌기 성장 분석 프로토콜입니다. 이 방법은 형질도입 효율을 높여 정확한 세포 식별과 신경재생 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, 건강 및 의료 연구 기금 (홍콩), CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 기부 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금에 의해 지원되었습니다.

이후 모든 절차는 홍콩 중문대학의 동물 실험 윤리 위원회의 윤리 기준에 따라 진행되었습니다.
1. 커버스립준비
<ol><li>멸균 된 18mm 원형 커버 슬립을 12 웰 조직 배양 판의 각 우물에 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립을 가습된 37°C 인큐베이터에 5 μg/mL 폴리-D-리신 용액으로 코팅하여 1시간 이상 코팅합니다.</li>
	<li>조직 배양 플레이트로부터 폴리-D-리신 용액을 흡인하고 코팅된 커버슬립을 멸균수로 한 번 헹구는다.</li>
</ol>2. 쥐 배아 신경 해부
<ol><li>자궁 경부 탈구 또는CO2 질식에 의해 18 일 (E18)의 임신 나이에 시간 임신 Sprague-Dawley 쥐를 희생. 참고: 임산부 쥐의 희생에 대해서는 현지 규정을 확인하십시오.</li>
	<li>해부 가위로 임신 한 쥐의 복강을 열고 자궁을 10cm 페트리 접시로 옮김하십시오.</li>
	<li>작은 해부 가위로 자궁과 양수 낭을 조심스럽게 열고 작은 해부 가위를 사용하여 쥐 배아에서 태반을 제거하십시오. 포도당 (PBS-포도당, 10 mM 나트륨 인산염, 2.68 mM 염화 칼륨, 140 mM 염화 나트륨 및 3 g /L 포도당)으로 보충 된 미리 냉각 된 인산완충 식염수로 10cm 페트리 접시에 전체 배아를 옮기세요.</li>
	<li>두개골의 시상 봉합사를 따라 잘라 작은 해부 가위 한 쌍으로 조심스럽게 엽니 다. 작은 평평한 주걱으로 배아 뇌를 얼음 차가운 PBS-포도당으로 10cm 페트리 접시로 옮김을 옮김.</li>
	<li>해부 현미경의 밑에 2개의 #5 핀셋을 사용하여 소뇌와 두뇌 줄기에서 2개의 대뇌 반구를 분리하십시오. 참고: 쥐 뇌의 구조는 참조12를 참조하십시오.</li>
	<li>#5 핀셋을 사용하여 수막을 제거합니다.</li>
	<li>두 개의 직선 #5 핀셋으로 대뇌 반구에서 피질을 분리합니다.</li>
	<li>15 mL 원심 분리기 튜브에서 얼음 차가운 PBS-포도당에 고립 된 피질을 옮김.</li>
</ol>3. 1 차적인 피질 신경 문화
참고: 3단계와 4단계의 모든 절차는 Class II 생물안전성 캐비닛 내에서 수행됩니다.
<ol><li>5 분 동안 4 °C에서 중력에 의해 분리 된 피질을 정착하고 PBS - 포도당을 흡인.</li>
	<li>분리된 피질에 0.05% 트립신-EDTA 1 mL을 추가하고 효소 소화를 허용하기 위해 37°C 수조에서 조직을 10분 동안 두드리고 배양하여 부드럽게 섞습니다. 튜브를 부드럽게 눌러 2분마다 혼합합니다.</li>
	<li>조직/트립신 혼합물에 4 mL의 유지 관리 배지(예: 신경기분저 배지)를 추가합니다. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 유지 보수 매체는 페니실린 - 스트렙 토마이신과 B-27 보충13으로보충된다.</li>
	<li>1 mL 파이펫을 사용하여 삼조하여 조직을 부드럽게 해리하십시오.</li>
	<li>200 x g에서 원심분리에 의해 해리된 세포를 5분 동안 펠렛.</li>
	<li>3.5단계에서 3.7단계는 두 번 반복합니다.</li>
	<li>유지 보수 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
	<li>혈세포계에 의한 생존 가능한 세포의 계수를 위해 10 μL의 0.4% Trypan Blue 용액을 10 μL의 세포 현탁액에 추가하십시오.</li>
	<li>12웰 플레이트에서 1mL의 유지 관리 배지에서 65,000/cm2(생존 세포)의 밀도로 뉴런을 플레이트한다.</li>
</ol>4. 세포 감염 및 고정
<ol><li>2일 체외(DIV2)에서, EGFP 구제의 트랜스펙트 0.5 μg(pEGFP-C1)을 1 μL의 트랜스펙션 시약(예를 들어, Lipofectamine 2000)을 사용하여 POI의 0.5 μg의 유무에 관계없이 뉴런에 대해 함께 한다. 제조업체의 지침을 사용하십시오. 참고: 포유류 발현 구슬은 내독소 프리 플라스미드 제제 키트를 사용하여 제조하였다. 화학 물질 /분자 (이 원고 시토 샬라신 D (Cyto D) 및 신경 성장 인자 (NGF)가 사용된 경우) 형질전환 후 6 시간에서 수행 될 수 있습니다.</li>
	<li>배양배지 24시간 후 형질감염세포를 37°C PBS(10 mM 인산나트륨, 염화칼륨, 염화나트륨 140m)로 1회 세척한다.</li>
	<li>PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안 고정하십시오.</li>
	<li>고정 된 세포를 PBS로 세 번 씻으하십시오.</li>
	<li>현미경 유리 슬라이드에 최소한의 형광 장착 매체를 추가합니다. 12웰 플레이트에서 시료가 유리 슬라이드를 향하게 하여 장착 매체로 조심스럽게 커버슬립을 옮김을 옮김. 참고: 수성 마운팅 매체를 사용하는 경우 커버슬립 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다.</li>
</ol>5. 노이라이트 자성장 측정
<ol><li>에피형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하는 데 40x 목표를 사용합니다.</li>
	<li>적어도 40 개의 손상되지 않은 뉴런에서 형상 변환 당 EGFP 신호로 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>NeuronJ 플러그인11을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 캡처된 이미지를 열어 각 이미지 뉴런의 세포체에서 성장 원뿔의 끝까지 가장 긴 신경질의 길이를 측정합니다.</li>
	<li>소프트웨어로 얻은 데이터를 분석하여 뉴라이트 의 외성장에 표적 화된 단백질의 효과를 결정한다.</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+axon+repair+in+the+injured+central+nervous+system%3A+Lessons+from+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development.</a> Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).</li>
<li>Harrill, J. A., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+neurite+outgrowth+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).</li>
<li>Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+inexpensive+high+throughput+screen+method+for+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Chemical+Genomics%22%5BJournal%5D)">A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth.</a> Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).</li>
<li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li>
<li>Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+expression+of+NMDA+receptors+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells.</a> Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).</li>
<li>LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+neuro-2a+neuroblastoma+cells+versus+intact+neurons+in+primary+culture+for+neurotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies.</a> Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheung, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FE65+interacts+with+ADP-ribosylation+factor+6+to+promote+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth.</a> The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+the+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Swanson, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+maps+4.0-Structure+of+the+rat+brain%3A+An+open+access+atlas+with+global+nervous+system+nomenclature+ontology+and+flatmaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps.</a> The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+B27%2Fneurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum%2C+substantia+nigra%2C+septum%2C+cerebral+cortex%2C+cerebellum%2C+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).</li>
<li>Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth%3A+roles+of+microfilaments+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon growth: roles of microfilaments and microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).</li>
<li>Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+inhibits+actin+polymerization+and+induces+depolymerization+of+actin+filaments+formed+during+platelet+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change.</a> Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).</li>
<li>Calabrese, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+regulating+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Enhancing and regulating neurite outgrowth.</a> Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).</li>
<li>Lau, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexras1+Interacts+with+FE65+to+Regulate+FE65-Amyloid+Precursor+Protein-dependent+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).</li>
<li>Cui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niacin+treatment+of+stroke+increases+synaptic+plasticity+and+axon+growth+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats.</a> Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).</li>
<li>Khodosevich, K., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+involved+in+neurite+outgrowth+of+postnatally+born+subventricular+zone+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro.</a> BMC Neuroscience. 11, 18(2010).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+Enhances+Neurite+Outgrowth+and+Synaptogenesis+Via+Sonic+Hedgehog+Signaling+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation%2FReoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+International+Journal+of+Experimental+Cellular+Physiology%2C+Biochemistry%2C+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).</li>
<li>He, W., Liu, Y., Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosuvastatin+Improves+Neurite+Outgrowth+of+Cortical+Neurons+against+Oxygen-Glucose+Deprivation+via+Notch1-mediated+Mitochondrial+Biogenesis+and+Functional+Improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).</li>
<li>Tesarova, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+for+advanced+glycation+end+products+%28RAGE%29--soluble+form+%28sRAGE%29+and+gene+polymorphisms+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Investigation%22%5BJournal%5D)">Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer.</a> Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocalcin+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Inhibits+Astrocytic+Differentiation+in+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).</li>
<li>Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRadbruch%2C+A+%22Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting%22">Flow Cytometry and Cell Sorting</a>. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).</li>
<li>Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Commonly+Used+Commercial+Transfection+Reagents+towards+Efficient+Transfection+of+Single-Stranded+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), (2018).</li>
<li>Sariyer, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection of neuronal cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).</li>
<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+observations+on+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).</li>
<li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures%3A+a+methodological+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8 (12), e83899(2013).</li>
<li>Hiragi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+%28hiPSC%29-Derived+Neurons+in+Mouse+Hippocampal+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li>
<li>Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+myostatin+deficiency+on+motor+and+sensory+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons.</a> Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).</li>
</ol>

저자는 이 문서의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.

앞서 언급한 바와 같이, PC12 및 그 서브클론은 형질전환 효율이 우수하기 때문에 뉴라이트 확장을 연구하기 위해 널리 사용된다2,3. 대조적으로, 1 차적인 뉴런은 형질전환7에의하여 neurite 파생 조정자를 공부하기 위한 중요한 장애물인 낮은 형질감염 비율을 가시합니다. 여기서, 우리는 1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 정량화하기 위한 편리한 프로토콜을 기술합니다. 낮은 전반적인 형질 감염 효율에도 불구하고, 형질감염된 뉴런의 80% 이상이 FE65 및 EGFP(그림 2A)의두 단백질과 성공적으로 공동 형질감염되었다. 따라서, EGFP 표지된 뉴런을 분석함으로써, NEUrite 자성장에 대한 FE65의 효과를 정확하게 결정할 수있었다(도 2</st...

축색과 모수석을 모두 포함한 노이라이트는 신경망 의 확립에 관여하는 뉴런의 돌출부입니다. 신경 신경 발달에 필수적입니다 신경 구이염의 역동적 인 성장. 그러나, 아래 기본 규제 메커니즘 불분명 남아. 특히, 신경성 손상은 다양한 신경 퇴행성 질환과 뇌 손상 후1. 따라서, 다양한 neurite 파생 규제 경로에서 putative 분자의 역할에 대한 조사는 프로세스의 우리의 이해를 향상시킬 것입니다. 더욱이, 다양한 신경 장애에 대한 새로운 치료 표적을 밝혀낼 수 있다. 신경 세포주는 신경세포가 조작하기 쉽고 트랜스펙트2,3으로neurite 의 성장을 포함한 신경 학적 과정을 연구하기위한 귀중한 모델입니다. 그러나, 유전 드리프트는 그들의 생리적인 반응에 있는 변이로 이끌어 낼 수 있던 몇몇 일반적으로 이용되는 세포주에서 생기기 위하여 보고되었습니다4. 더욱이, 차동 단백질 발현은 신경 세포주와 1차 뉴런 사이에 나타났다. 예를 들어, PC12는, 쥐 부신에서 유래된 뉴런 세포주는 뉴라이트자생을연구하는 데 널리 사용되는2, 3,NMDA 수용체5를발현하지 않는다. 더욱이, 1차 뉴런에 비해 신경독소에 대한 마우스 신경아세포종 라인 신경-2a의 반응성이 감소된 것은 특정 막 수용체 및 이온채널(6)의발현 부족으로 인한 것으로 제안되었다. 따라서, 1차 뉴런은 신경외식 의 자생의 조사를 위한 보다 바람직하고 대표적인 모델이다. 그러나, 1 차적인 뉴런의 사용은 그들의 낮은 형질 감염 효율성7에의해 방해된다.
여기서, 우리는 관심 있는 단백질(POI) 및 EGFP를 1차 쥐 피질 뉴런에 대한 공동 형질감염과 수반하는 방법을 기술한다. EGFP는 성공적으로 형질 감염된 뉴런의 식별을 위한 형태학적 마커로서 작용하고 신경염의 측정을 허용한다. 우리는 neurite 의 성장을 조절하기 위해 보고 된 화합물 / 분자를 사용하여이 방법을 검증했습니다. 더욱이, FE65, 신경조절 단백질은 신경질성 자성장을 자극하는 것으로 나타났으며, 이러한접근법을설명하기 위해8,9를사용하였다. 이 프로토콜은 (1) 배아 18일(E18) 래트 배아로부터 1차 피질 뉴런의 분리, (2) EGFP및 POI(본 연구에서 FE65)를 이용한 뉴런의 공동 형질감염 및 (3) 이미지 처리를 이용하여 뉴런의 이미징 및 분석을 포함한다. 소프트웨어 이미지J 와 뉴런J 플러그인10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 핀셋</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18mm 원형 커버 슬립</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>사용 전 살균</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide에 용해</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 10cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위, 12.5cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Native Mouse Protein</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent 유틸리티 겸자, 10mm, 스트레이트 팁</td><td>World Precision Instruments</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>클론텍</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>참고 문헌 참조 8 및 15</td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol 레드</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

1 차적인 뉴런에 있는 neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite 의 성장은 신경계 발달 중에 신경 회로형성에 근본적인 사건입니다. 가혹한 신경염성 손상 및 시냅스 역기능은 각종 신경 퇴행성 질병 및 나이 관련 변성에서 생깁니다. neurite 파생을 조절 하는 메커니즘의 조사 뿐만 아니라 뇌 발달 과정뿐만 아니라 이러한 신경 장애에 귀중 한 빛을 발산 것 이다. 낮은 형질 감염 효율로 인해, 현재 1 차 포유류 뉴런에서 신경 구이 성 성장에 특정 단백질의 효과 연구 하는 도전. 여기서, 우리는 EGFP및 관심 단백질(POI)을 이용한 1차 쥐 피질 뉴런의 공동 형질전환에 의한 뉴라이트 자생의 조사를 위한 간단한 방법을 설명한다. 이 방법은 EGFP 신호를 통해 POI 형질감염된 뉴런의 식별을 허용하고, 따라서 NEUrite 자성장에 대한 POI의 효과를 정확하게 결정할 수 있다. 이 EGFP 기반 분석법은 신경과성 자성장을 조절하는 경로의 조사를 위한 편리한 접근법을 제공한다.

이 방법론을 시험하기 위하여는, 우리는 각각14,15,16의신경 성 자성장을 억제하고 자극하기 위하여 보인 Cyto D 및 신경 성장 인자NGF를이용했습니다. EGFP로 형질감염된 뉴런의 뉴라이트 길이는 Cyto D 또는 NGF로 치료한 후 측정되었다. 뉴런에 대한 EGFP의 형질감염 효율은 2.7%(1,068개의 뉴런 카운트)였다. 도 1A에도시된 바와 같이, Cyto D는 용량 의존적 방식으로 뉴라이트 연장을 억제하였다. 반대로, 뉴라이트 의 자성장은 NGF로 처리된 뉴런에서 강력하였다(도1B).
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이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

낮은 경질 효율은 단백질이 1 차적인 뉴런에서 neurite 성장을 재활성화하는 방법을 결정하는 주요 장애물입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 감염된 세포를 확인하기 위해 EGFP의 공동 변환에 의해이 문제를 극복. EGFP의 높은 배분률과 관심 있는 단백질은 분석의 정확성을 보장합니다.그리고 결과적으로 면역 형광 얼룩이 필요합니다. 신경 재생 중에 중성염 자가 성장이 발생하면, 이 방법은 뇌 외상 또는 신경 퇴행성 질환에서 손상된 신경 망을 복원하기위한 새로운 표적의 식별에 적용 될 수있다. 시술을 시작하기 전에 멸균 18mm 원형 커버슬립을 12개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물에 넣고 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 폴리-D-Lysine 용액의 밀리미터당 5마이크로그램으로 각 커버슬립을 코팅합니다.인큐베이션이 끝나면 폴리-D-Lysine 용액을 흡인하고 커버립을 멸균물로 헹구세요. 배아 의 날에 18, 10 센티미터 페트리 접시에 시간 임신 Sprague Dawley 쥐에서 수확 자궁을 배치하고 자궁과 양수 낭을 열기 위해 작은 해부 가위를 사용합니다. 가위를 사용하여 태반을 제거하고 집게를 사용하여 전체 배아를 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10센티미터 페트리 접시로 옮춥니다.가위를 사용하여 두개골의 처진 봉합사를 따라 자르고 작은 평평한 주걱을 사용하여 배아 뇌를 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 새로운 10 센티미터 페트리 접시로 옮춥니까. 2번 5번 핀셋과 해부 현미경을 사용하여 두 대뇌 반구를 소뇌와 뇌줄기에서 분리하고 수막을 제거합니다. 그런 다음 대뇌 반구에서 피질을 분리하고 신선한 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 15 밀리리터 튜브에 피질을 놓습니다.1 차적인 피질 신경 문화의 경우, 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서, 피질은 0.05 %의 트립신 EDTA로 PBS 포도당을 대체하기 전에 섭씨 4도에서 5 분 동안 중력에 의해 정착 할 수 있습니다. 부드러운 태핑과 섞어서 37도의 수조에 10분간 배양하고 2분마다 부드러운 도청을 추가로 해보시면 됩니다. 인큐베이션의 끝에서, 유지 보수 매체의 네 밀리리터와 소화를 중지하고 부드러운 트리튜레이션으로 조직을 해리1 밀리리터 파이펫을 사용합니다.원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 두 번째 원심분리를 위해 유지 보수 배지의 1밀리리터로 펠릿을 재중단한다. 12웰 플레이트에서 웰당 유지 보수 배지의 1 밀리리터에서 6.5

an-enhanced-green-fluorescence-protein-based-assay-for-studying

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

FRAP는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 교양 세포에있는 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 우리는 photobleaching 후 형광 복구 비율을 분석하여 GFP의 모바일 / 고정되어 분수를 조사. 본 연구에서는, FRAP는 hippocampal 뉴런의 쪽이에서 수행되었다.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

이 비디오에서는 hNPC 유래 뉴런의 생존 가능성에 대한 신경돌기 성장 촉진 소분자 화합물의 신경독성을 평가하는 발광 기반 방법에 대해 설명합니다. 이 분석은 세포 생존율의 지표인 세포 내 ATP 수준을 측정하여 테스트 화합물 처리 후 신경 독성을 평가합니다.

뉴런에 대한 테스트 화합물의 신경독성을 평가하기 위한 발광 기반 분석

이 비디오에서는 1차 피질 뉴런의 신경돌기 파양에 대한 표적 단백질의 효능을 확인하기 위한 EGFP 기반 면역형광 분석을 시연합니다. 일차 뉴런에 형광 단백질인 EGFP 및 표적 단백질을 transfection한 다음 면역 분석을 수행하여 표적 단백질이 신경돌기 성장에 미치는 영향을 조사합니다.

신경관 발육에 대한 표적 단백질의 효과를 평가하기 위한 면역형광 분석

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

우리는 교양된 뉴런에 재활용 시 냅 스 소포 (SV)에 대 한 광학 분석 결과 설명 합니다. 더블 transfection는 연 접 마커 관심사의 단백질을 표현 하는이 프로토콜을 결합 연 접 사이트를 그들의 시 냅 스 소포 용량, 재활용 찾아서 관심사의 단백질의 역할을 결정할 수 있습니다.

시 냅 스 소포 교양된 신경 연 접 단백질 Overexpressing에 있는 재활용에 대 한 광학 분석 결과

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

학습하세요 EGFP 공동형질도입을 활용한 1차 대뇌피질 뉴런의 신경돌기 성장 분석 프로토콜입니다. 이 방법은 형질도입 효율을 높여 정확한 세포 식별과 신경재생 연구에 활용됩니다.

1 차적인 뉴런에 있는 Neurite 파생을 공부를 위한 향상된 녹색 형광 단백질 기지를 둔 분석

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