Name: 크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: 배우세요 PRC2 매개 크로마틴 도메인의 동적 형성을 CRISPR/Cas9 기술과 유도형 구조를 활용하여 실시간으로 추적하는 방법입니다. 이 시스템은 다양한 세포 과정 연구에 적용 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

엘 발레스 박사, 디 오자타 박사, 에이치 무 박사님에게 원고 개정에 감사드립니다. D.R. 연구소는 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 보건원 (R01CA199652 및 R01NS100897)에 의해 지원됩니다.

유도성 EED 구조 MES 생성
1. 세포 배양
<ol><li>피더 프리 C57BL/6 마우스 배아 줄기 세포(mESCs)를 사용하여 안정적으로 통합된 CreERT2 이식유전자를 보유하며, 이는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)의 투여 시 핵으로 전이할 수 있다 13.</li>
	<li>기존의 ESC 배지14,15에서mESCs를 성장시키고, 1000 U/mL LIF, 1 μM ERK 억제제 PD0325901 및 3 μM GSK3 억제제 CHIR99021로 보충하였다. 기존의 ESC 배지의 경우, 15% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 1X 페니실린/스트렙토마이신 및 0.1 mM 2-메르카포에탄올을 함유한 녹아웃 DMEM을 사용하십시오.</li>
	<li>미CS 배양에 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅된 플레이트를 사용하십시오.</li>
</ol>2. 클론 EED 녹아웃 (KO) mES의 생성
<ol><li>설계 가이드 RNA(gRNAs)는 벤치클링 16의 CRISPR 설계 도구를 사용하여 MES에서 EED의 내인성 사본의 엑슨10및 엑슨 11을 삭제합니다. EED-KO-gRNA-1은 엑손 10의 바로 상류인트론을 표적으로 하고 EED-KO-gRNA-2는 엑손 11의 바로 하류인트론을 표적으로 한다. 이러한 gRNAs의 동시 응용 프로그램은 비 동종 끝 접합 (NHEJ)에 의해 엑슨 10과 엑슨 11 을 모두 삭제합니다.</li>
	<li>pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458)에 gRNAs를 복제 하는 Ran 외의 지침을 사용 하 여, 201317.</li>
	<li>6웰 플레이트 포맷으로, 각 EED-KO-gRNA-1 및 EED-KO-gRNA-2(재료 표참조)의 1 mg을 가진 2 x 105 mESCs를 제조사의 지시에 따라 트랜스펙션 시약을 사용한다. 변환 후 24시간 동안 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>형질전환 2일 후, 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 사용하여 GFP 양성 세포를 분리한다. 형질감염 효율은 약 10-30%까지 다양할 것으로 예상됩니다. 도금을 위한 충분한 GFP 양성 세포를 포착하기 위하여 약 5 x 105 셀을 분류합니다.</li>
	<li>분리된 GFP 양성 mESCs를 콜로니 피킹을 위해 0.1% 젤라틴(플레이트당 10-20 x10 3세포)으로 미리 코팅한 15cm 플레이트에 플레이트.</li>
	<li>단일 식민지가 보일 때까지 약 1 주일 동안 ESC 배지에서 세포를 성장시다. 2일마다 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>20 μL 마이크로파이펫 팁을 사용하여 최소 48개의 콜로니를 선택하십시오. 마이크로파이펫 팁을 흡족히 취하면서 식민지를 긁어냅니다. 식민지를 단일 세포로 분해하지 마십시오. 콜로니를 아쿠타아제 함유(20 mL) 96 웰 플레이트로 옮니다.</li>
	<li>모든 세포가 해리 될 때까지 37 °C에서 10 분 동안 식민지를 배양.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 200mL의 ESC 용지를 추가합니다.</li>
	<li>잘 혼합하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 두 개의 별도의 96 웰 플레이트로 세포를 플레이트.</li>
	<li>96개의 웰 플레이트 중 하나를 사용하여 지질형 시핑을 하고 다른 플레이트는 헤비노티핑이 끝날 때까지 계속 자라고 있습니다. DNA 추출 솔루션을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 96 웰 플레이트에서 DNA를 추출합니다.</li>
	<li>삭제된 부위에 걸쳐 제조업체의 지시에 따라 타크 DNA 폴리머라제와 함께 GE노태핑 PCR을 수행하는 Gnt_EED-KO-up 및 Gnt_EED-KO_down을사용하여 야노피 핑 프라이머를 사용하십시오. 참고 : DNA 폴리머라제의 다른 유형은 유전 형질 티핑에도 사용할 수 있지만, Taq DNA 폴리머 라제는 PCR 반응이 색 반응 버퍼를 사용할 때 겔에 직접로드 될 수 있기 때문에 편리함을 제공합니다.<ol>
<li>야생형(WT) 케이스에 비해 동형 체증을 가진 세포에서 분자량이 낮은 DNA 생성물 관찰. 참고 : PRC2 null 세포를 생성하려면 핵심 PRC2 13의 필수 하위 단위인 EED를 불안정하게하고 저하시키기 위해 엑소10 및 11의 동형접합 체 삭제가 필요합니다. CRISPR 타겟팅 효율은 약 10%입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EED 엑손 10 및 11의 결실과 Sanger 시퀀싱 및 웨스턴 블로팅에 의한 EED 단백질의 손실을 각각 검증합니다.</li>
	<li>H3K27me2/me3 및 EED에 대한 항체를 사용하여 ChIP-seq에 의한 EED KO 세포의 크로마틴에서 EED 및 H3K27me2/me3의 고갈을 확인합니다. ChIP-seq 실험에 대해 Oksuz et al., 201715에 제공된 프로토콜을 사용하십시오.</li>
</ol>3. EED 녹아웃 mES를 엔지니어링하여 Cre-ERT2 기반 유도성 EED 발현을 수용
<ol><li>벤치링16의 CRISPR 설계 툴을 사용하여 EED의 엑손 9에 이어 인트론 내 컷을 도입하는 gRNA(EED-gRNA-유도성)를 설계한다(재료표 참조). </li>
	<li>pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458)에 gRNAs를 복제 하는 Ran 외의 지침을 사용 하 여, 201317.</li>
	<li>AED cDNA 서열을 포함하는 공여자 템플릿 DNA를 설계한 후 9 및 C-말단 플래그-HA 태그 상류T2A-GFP 서열, 모두 내인성 유전자 서열에 대하여 역방향이다.<ol>
<li>이종 역 loxP 사이트(lox66 및 lox71)18사이에 중첩된 스플라이스 수용자 및 폴리아데닐레이션 서열로 카세트를 측면.</li>
		<li>각 끝에서 적어도 500 bp의 상동성 무기를 포함합니다. gBlock 유전자 조각의 2 세그먼트로 기증자 템플릿을 분할 (참조 gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" 및 gBlock-2-케이지 돌연변이 "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") PCR 블런트 벡터는 제조업체의 지시에 따라 깁슨 복제를 사용하여. 참고 : gblock-2는 H3K27me312와의상호 작용에 중요한 EED의 케이지 내에 방향족 잔류물 (Y365)을 포함합니다. gBlock-2-Wt는 야생 형 잔류물을 포함하고 있는 반면, gblock-2-케이지 돌연변이체는 H3K27me3에 결합할 수 없는 EED(Y365A)의 케이지 돌연변이를 함유하고 있습니다. 유도성 WT EED 구조는 i-WT-r 및 유도가능한 케이지 돌연변이 EED 구조가 편의를 위해 i-MT-r로 표시됨에 따라 표기된다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6웰 플레이트 포맷에서, 트랜스펙트 2 x 105 mESCs와 gRNA(EED-gRNA-유도성) 및 기증기 템플릿 1 mg(i-WT-r 또는 i-MT-r)은 파CS를 사용하여 트랜스펙션 시약을 사용하고 GFP 양성 세포를 분리한다.</li>
	<li>2.3-2.11 단계를 수행하여 성공적인 타겟팅을 위해 지질 형질 이윤을 내포할 준비가 된 개별 식민지를 분리합니다.</li>
	<li>삽입 된 카세트에 걸쳐 Taq DNA 폴리머를 사용하여 유전자 형이 나는 PCR을 수행 유도-유전자형 FW-1 및 인덕티블_유전자형-REV-1을사용하여 유전자 형이 나는 프라이머를 사용합니다. 참고: CRISPR의 타겟팅 효율은 약 10%입니다.<ol>
<li>Inducible_Genotype-FW-2 및 Inducible_Genotype-REV-2 프라이머를 사용하여 PCR에 의한 카세트의 올바른 통합을 확인합니다. 참고 : 카세트의 동면 구체 통합은 EED의 효율적인 구조를 달성하는 데 필요합니다. 동형 결합을 가진 세포는 짧은 제품을 생성할 WT EED에 비해 단 하나 큰 DNA 생성을 생성할 것이라는 점에 유의하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sanger 시퀀싱으로 카세트의 통합을 확인합니다.</li>
	<li>4-OHT 투여 시, 카세트의 뒤집기 및 EED 및 기타 PRC2 핵심 구성 요소(예: EZH2 및 SUZ12)의 발현을 서양 블로팅에 의해 확인한다.</li>
	<li>유세포분석으로 T2A-GFP의 발현과 플립 비율을 확인합니다. GFP의 표현은 카세트의 뒤집기와 EED의 표현을 나타냅니다.</li>
</ol>4. 염색질에 대한 PRC2 활성의 핵 형성 및 확산에 따른
<ol><li>i-WT-r 및 i-MT-r mESC가 유세포 측정에 의한 GFP의 누설 발현이 없는지 확인한다. GFP의 누설 발현의 경우, 실험을 시작하기 전에 FACS에 의해 GFP 음성 세포를 분리한다.</li>
	<li>i-WT-r 및 i-MT-r mESCs를 5개의 15cm 플레이트(플레이트당 5x 10 6셀)로 확장합니다.</li>
	<li>0.5 mM 4-OHT를 0h, 12 h, 24 h, 36 h 및 8일(조건당 15 cm 플레이트)에 투여하여 WT 또는 케이지 돌연변이체 EED의 발현을 유도한다. 12시간 이상 치료에 대해 12시간 후에 미디어를 변경합니다. GFP를 사용하여 FACS에 의해 성공적으로 재결합된 세포를 분리하였다. 모든 조건이 한 번에 수집되도록 치료 시간을 조정하십시오.</li>
	<li>H3K27me2, H3K27me3에 대한 ChIP-seq를 수행하여 WT 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발현에 반응하여 염색질에 대한 측두엽 증착을 조사한다. 2017년15월15일 옥수즈 외에 상세히 설명된 라이브러리 준비를 포함한 ChIP-seq 프로토콜을 사용한다.</li>
	<li>각 샘플에서 스파이크 인 컨트롤을 사용하여 서로 다른 시간 점19간의 정량적 비교를 허용합니다.<ol>
<li>스파이크 인 제어를 위해, 드로소필라 멜라노가스터 (mESC 유래 크로마틴에 대한 1:50 비율)뿐만 아니라 드로우필라 특이적 H2Av 항체 (드로소필라 크로마틴 4 μg 당 H2Av 항체의 1 μL)를 사용하십시오. 각 샘플에 대한 제조업체의 지침)을 참조하십시오.</li>
		<li>2017년15월15일 옥수즈 외에 상세히 기재된 프로토콜을 이용하여 미CS에서 와 유사한 방식으로 드로소필라로부터 염색질을 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기본 매개변수20을사용하여 Bowtie 2를 사용하여 ChIP-seq에서 mm10 게놈에 대한 시퀀스를 매핑합니다.</li>
	<li>마우스 ChIP-seq 읽기를 표준화하여 초파리 읽기 카운트21. 다음 공식을 사용하여 스파이크 인 정규화 계수를 계산합니다: 1 x 106/고유 Drosophila 읽기 개수. 실험당 약 1 x 106Drosophila 읽기 횟수와 20 x 106 마우스 읽기 횟수를 예상합니다.<ol>
<li>입력 샘플을 시퀀싱할 때 드로소필라 크로마틴을 포함하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>bedtools에서 게놈 콥 도구를 사용하여 bam 파일을 침대 그래프22로변환합니다. 다음으로, USCS23,24에서 bedGraphToBig 도구를 사용하여 침대 그래프를 bigwig 파일로 변환합니다. 다음 스크립트를 참조하십시오. gen="mm10 게놈에 대한 경로" chr="mm10 염색체 크기에 대한 경로" inp_bam="입력 밤 파일에 대한 경로 " 곱하기="스파이크 인 정규화 계수 계산" 베드툴 게놈콥 -bg-스케일 $multiply -ibam $inp_bam-g $gen > output.bedGraph 정렬 -k1,1 -k2,2n 출력.bedGraph > output_sorted.bedGraph 베드그래프토빅위그 출력_정렬.베드그래프 $chr output.bw
</li>
	<li>USCS 게놈브라우저(24)에bigwig 파일을 업로드하여 ChIP-seq 읽기 밀도를 시각화합니다.</li>
</ol>5. MESC 핵에서 H3K27me3 초점의 출현 및 성장을 모니터링
<ol><li>플레이트 1x 104 mESCs를 0.1% 젤라틴으로 미리 코팅된 8웰 챔버 슬라이드로 넣습니다.</li>
	<li>다음날, 표시된 시간 포인트(0h, 12h, 24 h 및 36h)에 대해 EED를 발현하는 세포를 수집하기 위해 연속적인 4-OHT(0.5 mM) 유도를 수행시작한다. 12시간 이상 치료를 위해 12시간 후에 미디어를 변경합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 인산염 완충식식염수(PBS)에 4% 파라포름알데히드로 mES를 10분 동안 고정합니다.</li>
	<li>30 분 동안 RT에서 PBS / 0.25 % 트리톤 X-100으로 세포를 투과시.</li>
	<li>30 분 동안 RT에서 PBS / 5 % 당나귀 혈청 / 0.1 % 트리톤 X-100 (차단 버퍼)로 세포를 차단하십시오.</li>
	<li>H3K27me3 1차 항체를 차단 완충액에서 1:500으로 희석하고 세포에 첨가한다.</li>
	<li>4 °C에서 하룻밤 기본 항체로 세포를 배양.</li>
	<li>다음날, PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 3번의 세차서를 수행합니다.</li>
	<li>차단 완충액에서 이차 항체(Alexa fluor 595)를 1:1000 희석하고 세포상에 첨가한다.<ol>
<li>알렉사 플루어와 공액된 이차 항체가 빛에 민감하기 때문에 다음 단계에서 어두운 곳에서 모든 배양을 수행한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT에서 2 시간 동안 이차 항체를 배양합니다.</li>
	<li>PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 3번의 세안을 수행합니다.</li>
	<li>DAPI(1 mg/mL)를 PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 1:4000으로 희석하고 세포에 첨가합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 DAPI로 세포를 배양하십시오.</li>
	<li>아쿠아 마운트로 셀을 장착합니다.</li>
	<li>63배 배율로 공초점 현미경으로 세포를 이미지화합니다.</li>
	<li>ImageJ, 피지25의분포를 사용하여 이미지를 처리하고 의사 색을 칠합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Domains%3A+An+Important+Facet+of+Genome+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation.</a> Bioessays. 39 (12), (2017).</li>
<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li>
<li>Holoch, D., Margueron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Regulating+PRC2+Recruitment+and+Enzymatic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+polycomb-group+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).</li>
<li>Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+associated+with+a+human+multiprotein+complex+containing+the+enhancer+of+zeste+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein.</a> Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).</li>
<li>Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+enhancer+of+Zeste%2FESC+complexes+have+a+histone+H3+methyltransferase+activity+that+marks+chromosomal+Polycomb+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites.</a> Cell. 111 (2), 185-196 (2002).</li>
<li>Müller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+of+a+Drosophila+Polycomb+group+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex.</a> Cell. 111 (2), 197-208 (2002).</li>
<li>Ferrari, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb-Dependent+H3K27me1+and+H3K27me2+Regulate+Active+Transcription+and+Enhancer+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity.</a> Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).</li>
<li>Margueron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+polycomb+protein+EED+in+the+propagation+of+repressive+histone+marks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks.</a> Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).</li>
<li>Oksuz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Onset+of+PRC2-Mediated+Repressive+Domain+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation.</a> Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).</li>
<li>Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk1%2F2+activity+promotes+chromatin+features+and+RNAPII+phosphorylation+at+developmental+promoters+in+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs.</a> Cell. 156 (4), 678-690 (2014).</li>
<li>Oksuz, O., Tee, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+chromatin+modifications+in+response+to+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing chromatin modifications in response to ERK signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).</li>
<li>Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2018).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase-mediated+inversion+using+lox66+and+lox71%3A+method+to+introduce+conditional+point+mutations+into+the+CREB-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein.</a> Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ChIP-Seq+normalization+reveals+global+modulation+of+the+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome.</a> Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDescostes%2C+N+%22R+package+version+1.2.1%22">R package version 1.2.1</a>. , (2019).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>UCSC Genome Browser Home. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu">https://genome.ucsc.edu</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid%2C+Reversible%2C+and+Tunable+Method+to+Regulate+Protein+Function+in+Living+Cells+Using+Synthetic+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R.은 별자리 제약 및 풀크럼 치료제의 공동 창립자입니다. 저자는 경쟁적인 이해관계가 없다고 선언합니다.

주어진 염색질 도메인의 형성 도중 기계론적인 세부사항을 이해하는 쪽으로 강력한 접근은, 먼저 도메인을 중단하고 세포 내의 진행 중인 그것의 재건을 추적하는 것입니다. 이 프로세스는 재구성 중에 언제든지 일시 중지되어 진행 중인 이벤트를 자세히 분석할 수 있습니다. 염색질 도메인에 대한 이전 연구는 정상 상태 조건(예: 야생형 및 유전자 녹아웃 비교)에서 수행되었기 때문에 이러한 이벤트를 해결할 수 없었습니다. 여기에서는, 우리는 세포에 있는 PRC2 중재한 억압도메인의 모집 그리고 퍼짐에 의해 강조된 것과 같이 염색질 도메인의 동적 형성을 평가하는 체계를 개략적으로 설명합니다.
이 유도 가능한 시스템에 대한 가장 중요한 단계는 세포에서 각각의 삭제 후 원하는 단백질 (또는 RNA)을 다시 발현하기 위해 DNA 구성물의 정확한 설계입니다. 다운스트림 응용 에 따라 다양한 돌연변이, 태그 및 형광 마커가 이러한 구문 내에서 도입될 수 있습니다. 예를 들어, GFP 직전에 자가 절개 ...

진핵 게놈은 고도로 조직되고 염색질 접근성에 있는 변경은유전자 전사 1을 직접 통제합니다. 게놈은 전사 활동 및 복제 타이밍2,3와상관 관계가 있는 염색질 도메인의 명백한 모형을 포함합니다. 이러한 염색질 도메인은 몇 킬로베이스(kb)에서 100kb 이상까지 의 크기 범위이며 뚜렷한 히스톤변형 4의 농축을 특징으로 한다. 핵심 질문은 이러한 도메인이 어떻게 형성되고 어떻게 전파되는가하는 것입니다.
가장 잘 특징지어진 염색질 도메인 중 하나는 폴리콤 억압 복합체 2(PRC2)의 활성을 통해 육성된다. PRC2는단백질5,6의폴리콤 그룹(PcG)의 서브세트로 구성된 다중 소단위 복합체로, 히스톤 H3(H3K27me1/me2/me3)의 리신 27의 모노, 디-및트리메틸화를 촉매한다. 9,10. H3K27me2/me3는 억압적인 염색질 상태와 관련이 있지만 H3K27me1의 기능은불분명합니다 6,11. 중화민의 핵심 구성 요소 중 하나인 배아 외배엽 발달(EED)은, 그 방향족 케이지를 통해 PRC2 촉매, H3K27me3의 최종 생성물인 PrC212,13의알로스테릭 자극을 초래한다. PRC2 효소 활동은 특정 혈통에 대한 금기 특정 발달 유전자의 부적절한 발현으로 개발 중 세포 정체성을 보존하는데 매우 중요하며, 5, 6에 해가 될 것입니다. . 따라서, PRC2가 포유류에서 억압적인 염색질 도메인의 형성을 촉진하는 메커니즘을 해명하는 것은 세포 정체성을 이해하는 데 근본적으로 중요합니다.
PRC2 매개 염색질 도메인을 포함하여 염색질 도메인 형성을 조사하기 위해 고안된 모든 과거 실험 시스템은 염색질 도메인 형성의 전개 이벤트를 추적할 수 없는 정상 상태 조건하에서 수행되었습니다. 셀. 여기에서는 염색질 도메인의 초기 모집 및 전파를 모니터링하는 유도성 셀룰러 시스템을 생성하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 특히, 우리는 H3K27me2/3를 구성하는 PRC2 매개 억압성 염색질 도메인의 형성을 추적하는 데 중점을 둡니다. 염색질 도메인 형성의 기계적 세부 사항을 캡처할 수 있는 이 시스템은 H2AK119ub 또는 H3K9me을 포함하는 널리 연구된 도메인과 같은 다른 염색질 도메인을 통합하도록 적응될 수 있습니다. 유전체학 및 이미징 기술과 결합하여, 이 접근법은 염색질 생물학에 있는 각종, 중요한 질문을 성공적으로 해결하는 잠재력을 가지고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-하이드록시타목시펜(5 mg)</td><td>시그마</td><td>H7904-5MG</td><td>EED 발현 유도용</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드 수용액(10x10 ml)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>면역형광용</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>mESC 배양용</td></tr><tr><td>2% 젤라틴 용액</td><td>시그마</td><td>G1393-100ml</td><td>mESC용 culture</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>mESC용</td></tr><tr><td>culture Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>면역형광용</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Mounting Medium</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>면역형광용</td></tr><tr><td>CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>면역형</td></tr>광 <tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드) - 10mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>면역형광</td></tr><tr><td>ERK 억제제, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>mESC 배양용</td></tr><tr><td>ESGRO 재조합 마우스 LIF 단백질</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>mESC 배양용</td></tr><tr><td>FBS 줄기세포 인증</td><td>애틀랜타</td><td>S10250</td><td>mESC 배양의</td></tr><tr><td>경우 Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>공여체 템플릿 클로닝</td></tr><tr><td>GSK3 억제제, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>mESC 배양의</td></tr><tr><td>경우 H3K27me2 (D18C8) 토끼 mAB</td><td>세포 신호</td><td>9728S</td><td>ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>세포 신호</td><td>9733S</td><td>ChIP-seq</td></tr><tr><td>히스톤 H2Av에 대한 항체 항체 (pAb)</td><td>Active motif</td><td>39715</td><td>Spike-in control for ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>mESCs 배양용</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>mESCs 배양용</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>For Genotyping PCR</td></tr><tr><td>Normal donkey serum (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>면역형광용</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>mESC 배양용</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNA 클로닝용</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 추출 솔루션</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>유전형 분석용 PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>제로 블런트 PCR 클로닝 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>Donor template cloning</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>염기서열: ctctggctactgtcaactag. gRNA는 i-WT-r 및 i-MT-r 시스템용 C57BL/6 ESC에서 EED를 녹아웃합니다.</td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>염기서열: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA는 i-WT-r 및 i-MT-r 시스템용 C57BL/6 ESC에서 EED를 녹아웃하기 위해 쌍을 이룹니다.</td></tr><tr><td>EED-gRNA 유도 서</td><td></td><td></td><td>열: atggcaccccgaaattagaa. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다.</td></tr><tr><td>i-WT-r Donor</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다.</td></tr><tr><td>EED-gRNA 유도 서</td><td></td><td></td><td>열: atggcaccccgaaattagaa. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-WT-r 시스템을 생성합니다.</td></tr><tr><td>i-MT-r Donor</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA 및 Donor를 사용하여 EED-KO 백그라운드에서 i-MT-r 시스템을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Genotyping Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>서열: ctgtaggctgccatctgtga. 야생형 대립유전자는 1.9kb의 산물을 생성합니다. 녹아웃 대립유전자는 200bp의 산물을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>서열: agccagggctacacagagaa. 야생형 대립유전자는 1.9kb의 산물을 생성합니다. 녹아웃 대립유전자는 200bp의 산물을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>시퀀스: tgcagtgaaacaaatttggaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 1863bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 ~200bp의 산물을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>시퀀스: gagaggggtggcactgtaaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 1863bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 ~200bp의 산물을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>시퀀스: ccccctctttct. 카세트가 삽입되면 프라이머는 3200bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 1560bp의 생성물을 생성합니다.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>서열: atgcctgggtgaatgaaaaaaaa. 카세트가 삽입되면 프라이머는 3200bp를 생성합니다. 야생형 대립유전자는 1560bp의 생성물을 생성합니다.</td></tr></tbody></table>

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

염색질 도메인의 조직 과 구조는 개별 세포 계에 고유합니다. 그들의 잘못된 조절은 세포 정체성 및 / 또는 질병에 있는 손실로 이끌어 낼 수 있습니다. 엄청난 노력에도 불구하고 염색질 도메인의 형성과 전파에 대한 우리의 이해는 여전히 제한적입니다. 크로마틴 도메인은 안정된 상태 조건 하에서 연구되어 왔으며, 이는 설립 기간 동안 초기 사건을 따르는 데 도움이되지 않습니다. 여기에서는 염색질 도메인을 유도적으로 재구성하고 시간의 함수로 재형성을 따르는 방법을 제시합니다. 비록, 먼저 PRC2 매개 억압 크로마틴 도메인 형성의 경우에 적용, 그것은 쉽게 다른 염색질 도메인에 적응 될 수 있었다. 유전체학 및 이미징 기술과 이 방법의 수정 및/또는 조합은 크로마틴 도메인의 설립을 매우 자세하게 연구하는 귀중한 도구를 제공할 것입니다. 우리는 이 방법이 염색질 도메인이 어떻게 형성되고 상호 작용하는지에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으킬 것이라고 믿습니다.

조건부 구조 시스템의 일반적인 계획 도 1은 내인성 EED 궤적으로부터 발현되는 WT 또는 케이지 돌연변이체(Y365A) EED를 사용하여 EED KO 세포를 조건부로 구출하는 표적화 방식을 나타낸다. 안정성과 효소 활성에 필수적인 PRC2의 핵심 하위 단위인 EED를 노크한 후, EED의 엑손 9에 이어인트론 내의 카세트가 도입된다(그림 1). 카세트는 내인성 유전자 서열에 대하여 역방향에서 EED의 나머지 3' cDNA 서열로 구성된다.  카세트는 이종역 loxP 사이트(lox66 및 lox71)18에의해 측면에 있다. 세포는 H3K27me2/3의 완전한 손실이 관찰될 때까지 전파됩니다. 4-OHT를 첨가하여 Cre 재조합 발현이 활성화되면, 카세트는 스플라이스 수락서 서열을 사용하여 카세트 내로 접합되도록<strong class="xfig"...

이 방법은 세포주에서 PRC2 매개 염색질 도메인의 형성을 따르도록 설계되었으며, 이 방법은 다른 많은 시스템에 적응될 수 있다.

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

크로마틴 도메인의 동적 형성을 평가하는 시스템을 간략하게 설명합니다. 우리는 이 시스템을 활용하여 세포내 중화크로마틴 도메인의 모집과 확산을 따릅니다. 프로세스는 언제든지 일시 중지하여 진행 중인 이벤트를 분석할 수 있습니다.이 시스템은 주어진 셀룰러 프로세스의 동적 변화를 모니터링하도록 준비될 수 있으므로 크로마틴 도메인 형성을 추적하는 데 국한되지 않습니다. 먼저 CRISPR 디자인 도구를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 배아 자궁 발달 또는 EED의 내인성 사본의 엑슨 10 및 11을 삭제하도록 가이드 RNA를 설계하여 시작합니다. 원고 의 지시에 따라 가이드 RNA를 CRISPR / Cas9 플라스미드로 복제합니다.6웰 플레이트 포맷에서, transfect 200, 000 마우스 배아 줄기 세포, 또는 mESC, 제조 업체의 지침에 따라 트랜스 페이션 시약을 사용하여 각 가이드 RNA의 하나의 마이크로 그램. 변환 후 24시간 후에 미디어를 변경합니다. 전환 후 이틀 후 FACS를 사용하여 GFP 양성 세포를 분리합니다.경질 효율은 약 10~30%까지 다양하므로 약 500, 000개의 세포를 정렬하여 도금에 충분한 GFP 양성 세포를 포획합니다. 격리된 GFP 양성 세포를 콜로니 따기용 0.1%젤라틴으로 미리 코팅된 15센티미터 플레이트로 플레이트합니다. 단일 식민지가 보일 때까지 ESC 배지에서 세포를 약 1주일 동안 성장시켜 2일마다 미디어를 변경합니다.20 마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 최소 48개의 콜로니를 선택하여 식민지를 긁어내고 심기동안 긁어냅니다. 식민지를 단일 세포로 분해하지 않고, 아쿠타아제 함유 96웰 플레이트로 옮긴다. 식민지를 섭씨 37도에서 10분간 배양하여 세포를 분리합니다.그런 다음 멀티 채널 파이펫으로 각 웰에 200 마이크로 리터의 ESC 미디어를 추가합니다. 잘 섞어서 세포를 두 개의 분리된 96웰 플레이트로 플레이트합니다. 지노티핑을 위해 플레이트 중 하나를 사용하고, 지피가 끝날 때까지 다른 플레이트를 계속 성장시다.상용 시약을 사용하고 제조업체의 지시를 따르는 플레이트에서 DNA를 추출합니다. 삭제된 부위에 걸쳐 있는 지노티핑 프라이머를 사용하여 Taq DNA 폴리머라제로 지평PCR을 수행합니다. 야생 형 세포에 비해 균질 제거를 가진 세포에서 낮은 분자량의 DNA 생성물을 관찰하십시오.디자인 가이드 RNA는 CRISPR 디자인 도구를 사용하여 EED의 엑손 9다음 인트론 내에서 컷을 도입하고 원고 의 방향에 따라 CRISPR / Cas9 플라스미드로 복제합니다. 내인성 유전자 서열에 대하여 모두 역방향으로, 엑슨 9 후 EED cDNA 서열을 포함하는 기증자 템플릿 DNA를 설계하고, T2A-GFP 서열의 C-말단 플래그-HA 태그 상류로, 모두 역방향으로 설계한다. 스플라이스 수용체와 이종 반전 된 loxP 사이트 사이에 중첩 된 폴리 아데닐레이션 서열로 카세트를 측면으로 하고 각 끝에서 적어도 500 개의 기본 쌍을 포함합니다.기증자 템플릿을 gBlocks 유전자 조각의 두 세그먼트로 분할하고 제조업체의 지시에 따라 깁슨 복제를 사용하여 PCR Blunt 벡터로 조립합니다. 6웰 플레이트 포맷으로, 가이드 RNA의 마이크로그램 1개와 기증자 템플릿의 1마이크로그램을 가진 transfect 200, 000 mESC. 그런 다음 FACS를 사용하여 GFP 양성 세포를 격리합니다.원고 의 지시에 따라 지평을 위해 개별 식민지를 분리합니다. 혈류 세포측정을 사용하여 mESC가 GFP의 새는 발현이 없는지 확인하고, 그렇게 하는 경우 실험을 시작하기 전에 FACS에 의한 GFP-음수 세포를 분리한다. 세포를 5개의 15센티미터 플레이트로 확장하고, 0시간에서 8일까지 5개의 다른 시간 동안 5-마이크로몰러 4-하이드록시타목시펜을 투여하여 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 발현을 유도한다.그 보다 더 오래 지속 하는 치료에 대 한 12 시간 후 미디어를 변경 합니다. GFP를 사용하여 FACS에 의해 성공적으로 재결합된 세포를 분리하고, H3K27me2 및 H3K27me3에 대한 ChIP-seq를 수행하여 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발현에 대응하여 크로마틴에 대한 현세적 증착을 조사한다. 유도할 수 없는 야생식 구조 및 유도 돌연변이 구조 시스템의 유효성을 검사하기 위해, 웨스턴 블롯은 4-하이드록시타목시펜 처리로 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED를 유도한 후 전체 추출물에 수행되었다.유동 세포측정 분석은 4-하이드록시타목시펜 처리 전후i-WT-r 세포에서 T2A-GFP 발현의 효율을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는 반전된 카세트의 성공적인 플립을 보여 준다. H3K27me3의 ChIP-seq는 야생형 또는 케이지 돌연변이 EED의 재발식 후에 수행되었다. H3K27me3의 출현은 이산 핵형성 부위에서 야생형 EED 발현 후 12시간 후에 관찰된 다음 초기 핵형성 부위로부터 먼 지역에서 24시간 후에 관찰된다.ChIP-seq는 또한 H3K27me3 증착앞에 나타나는 H3K27me2의 시간적 증착을 추적하는 데 사용되었다. H3K27me3 포시와 그 성장은 또한 형광 현미경검사법으로 시각화되었습니다. 야생형 EED 발현의 12시간 후에, H3K27me3 포시 형성의 증거가 있다.이러한 foci수와 크기가 24시간 증가하고 결국 36시간 동안 핵의 큰 영역으로 확산됩니다. DNA 구조의 정확한 설계는 원하는 유도 구조 시스템을 생성하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 마우스에 있는 단백질의 돌연변이의 시간 적이고 특별한 통제를 제공할 수 있습니다.이런 식으로, 하나는 특정 조직 또는 개발의 특정 단계에서 돌연변이의 효력을 결정할 수 있었습니다. 우리는 현재 다른 크로마틴 도메인, 폴리 콤 억압 복합 체형 의 동적 설립을 모니터링하기 위해이 시스템을 사용하고 있습니다.

a-method-to-study-de-novo-formation-of-chromatin-domains

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 미세구균 뉴클레아제 효소 분해를 사용한 염색질 전단 프로토콜에 대해 설명합니다. 염색질 전단은 인간 만성 골수성 백혈병 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 조사하는 데 도움이 되는 염색질 면역침전 또는 ChIp 워크플로우의 필수 단계입니다. 기능 프로토콜에서 염색질 전단은 초음파 처리를 사용하여 수행됩니다.

염색질 전단(Chromatin Shearing): 효소 분해를 사용하여 염색질 단편을 생성하는 방법

방법 염색질 규제 및 염색질 상태의 문제는 생체 내에서 유전자가 세포 운명 결정이 배아에서 어떻게 만들어 지는지 초기에 대한 우리의 이해의 열쇠입니다 영향을 미칩니다. 칩 서열 번호 - 글로벌 수준입니다 Xenopus의 배아 여기 설명에서 크로 마틴의 기능을 조사하기 가장 인기있는 방법.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

선물이 nucleosome 밀도 칩 seq 분석 프레임 워크를 통합 하는 micrococcal nuclease (MNase) 접근에 대 한 적합 한 시퀀스 데이터 집합의 세대에 대 한 (칩 seq) 방법론을 시퀀싱 수정된 네이티브 chromatin immunoprecipitation 히스톤 수정 측량와.

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

핵 건축의 소성 비 코딩 RNAs, DNA 메 틸 화, nucleosome 위치 뿐만 아니라 히스톤 구성 및 수정 등 동적 후 성적인 기계 장치에 의해 제어 됩니다. 여기는 재현할 싸고 간단 방식 chromatin 접근성의 결정을 허용 하는 Formaldehyde-Assisted 절연의 규제 요소 (시 키) 프로토콜에 설명 합니다.

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.

Capture Hi-C를 통한 고분해능 3D 염색질 조직 해독

여기에서는 학부 참여 및 학습에 중점을 두고 염색체 형태 캡처(3C) 기술의 적응을 자세히 제시합니다.

3C로 A 받기: 학부생을 위한 염색체 형태 캡처

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

배우세요 PRC2 매개 크로마틴 도메인의 동적 형성을 CRISPR/Cas9 기술과 유도형 구조를 활용하여 실시간으로 추적하는 방법입니다. 이 시스템은 다양한 세포 과정 연구에 적용 가능합니다.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

더 많은 동영상 탐색