Name: 만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 배우세요 만성 살모넬라 감염을 이용한 마우스 장 섬유증 모델 구축 방법을. 스트렙토마이신 전처리와 경구 감염으로 크론병 유사 섬유증을 유도하여 치료 표적 연구에 활용할 수 있습니다.

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모든 동물 프로토콜은 브리티시 컬럼비아 대학의 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 생쥐의 구강 관념을 위한 살모넬라 티피무리움 ΔAroA 배양준비
<ol><li>S의 냉동 글리세롤 주식에서. 티피무리움 ΔAroA, 멸균 접종 루프와 100 μg / mL 연쇄상 구균을 포함하는 LB 한천을 사용하여 줄무늬 플레이트를 준비합니다. 37 °C에서 하룻밤 배양. 줄무늬 플레이트는 4°C에서 최대 1주일까지 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>감염 하루 전에 2.5 mL의 물에 연쇄상 구균 0.5 g을 용해시켜 항생제를 준비하십시오. 필터 살균 연쇄상 구균 균증 용액 후, 구두로 전구 팁 22G gavage 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여 마우스를 게이지 100 스트렙 토 마이신 용액의 100 μL (20 mg 스트렙토 마이신 / 복용량). 접종 루프를 사용하여 단일 콜로니가있는 배양 튜브에서 LB 국물 (50 μg / mL 연쇄상 구균)의 3 mL을 접종합니다. 37°C에서 밤새 200 RPM에서 흔들어 서 살모넬라 배양물을 에어로비액으로 배양하였다.</li>
	<li>감염 당일, 멸균 PBS에서 하룻밤 살모넬라 배양물의 2회 연속 1/10 희석을 수행하여 최종 감염 용량을 준비합니다. 이것은 대략 3 x 106 CFU를 포함하는 100 μL 접종을 초래할 것이다.</li>
	<li>전구 팁 22G 게이지 바늘과 1 mL 주사기를 사용하여, 제조 된 살모넬라의 100 μL로 각 마우스를 위배. 참고 : 무균 기술을 사용하여 살모넬라 문화를 준비하십시오. 살모넬라균의 최종 접종 농도는 스트렙토마이신을 함유한 LB 한천에서 직렬 희석제를 도금함으로써 확인할 수 있다. S. 티피무리움 ΔAroA 균주는 교수 맥나그니 (kelly@brc.ubc.ca)에 연락하여 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>2. 조직의 살모넬라 부담 평가
<ol><li>멸균 PBS 1mL와 오토클레이브 스테인리스 스틸 비드로 2 mL 안전 잠금, 둥근 바닥 마이크로튜브를 준비합니다. 조직 수집 전에 튜브를 미리 계량합니다.</li>
	<li>이산화탄소 노출에 의해 안락사된 마우스로부터 세칼 및 비장 조직을 절제합니다. 별도의 튜브에 개별 동물에서 조직을 수집합니다. 튜브를 계량하여 조직 분동을 결정합니다.</li>
	<li>30 Hz에서 15 분 동안 믹서 밀 장치를 사용하여 균질화. 96 웰 2 mL 메가 블록에서 웰 당 PBS의 900 μL을 전송합니다. 피펫 100 μL의 조직균질은 제1 웰내로 균질화되고, 잘 혼합되고, 100 μL을 후속 웰에 첨가하여 100 μL을 첨가하여10-6 희석이 얻어질 때까지 직렬 희석을 수행한다. 플레이트 10 μL 100 μg/mL 스트렙톰신을 함유하는 LB 한천상에 삼중 희석의 각 희석.</li>
	<li>1000 μL 샘플의 10 μL이 도금되고, 적절한 희석 인자를 가하고, 그 이후 평균 CFU를 100의 인자를 곱하고 곱하였다. 조직 무게 총 CFU를 조직 중량별로 나누어 조직의 그램당 CFU를 결정합니다. 참고: 모든 시료를 얼음 이나 조직 처리 중 4 °C에 보관하십시오. 조직 균질성으로 직렬 희석을 수행할 때 넓은 오리피스 파이펫 팁을 사용하십시오. PBS를 포함하는 96웰 메가블록을 미리 준비한다.</li>
</ol>3. 피크로시리우스 레드 염색 및 콜라겐 정량화.
<ol><li>10% 버퍼링된 포르말린에서 하룻밤 동안 세칼 조직을 고치고 파라핀 을 삽입할 준비를 하십시오. 앞서 설명한 대로 피크로시리우스 레드 염색에 대한 5-μm 섹션을 잘라25.</li>
	<li>밝은 시야 현미경으로 전체 세칼 단면의 합성 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>피지(ImageJ)를 열고 .tif 이미지 파일을 도구 모음에 끌어 놓습니다.</li>
	<li>메뉴 모음에서 이미지 > Type > RGB 스택을 선택하여 이미지를 빨간색, 녹색 및 파란색 채널로 분할합니다. 패널 하단의 가로 막대를 밀어 채널을 녹색으로 설정합니다.</li>
	<li>이미지 > 조정 > 임계값 도구를 엽니다. 최소 및 최대 제한을 조정하여 배경 신호를 제거합니다. 원하는 임계값이 설정되면 임계값 도구를 닫고 분석 > 측정 설정으로 이동합니다. 영역, 영역 분수, 임계값으로 제한및 레이블 표시를 선택합니다. 
</li>
	<li>프리핸드 선택 또는 다각형 선택 도구를 사용하여 조직 섹션을 게이트하고 분석 > 측정을클릭하여 콜라겐에 대한 %영역 을 측정합니다.</li>
	<li>조직 부위에 콜라겐 염색에 대해 양수 절대 영역을 정상화합니다. 참고 : 피지 (ImageJ)는 https://fiji.sc 다운로드 할 수있는 오픈 소스 프로그램입니다. 동일한 캡처 조건(예: 밝기 및 초점)을 가진 이미지는 정확한 정량화를 위해 동일한 임계값 제한을 가져야 합니다. 선택한 조직 내에 배경 얼룩이있는 경우 절대 영역을 측정하고 전체 조직에서 콜라겐에 대한 양성 영역에서 빼내.</li>
</ol>

<ol><li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis%3A+linking+host+genetics+and+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li>
<li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
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<li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li>
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<li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li>
<li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li>
<li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li>
<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li>
<li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864(2016).</li>
<li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrogenesis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li>
<li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system%3A+complexity%2C+plasticity%2C+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li>
<li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li>
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<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li>
<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2%2C4%2C6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li>
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</ol>

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IBD의 병인에 대한 우리의 이해는 장 염증의 마우스 모델에 의해 크게 향상되었습니다. 이러한 개별 모델이 복잡하고 다인성 인간 질병의 모든 특징을 되풀이하지는 않지만 질병 진행의 주요 특징을 식별하는 데 유용했습니다. IBD와 관련 되 었던 섬유 성 협착 현재 치료는 질병 개발을 반전에 효과가 있기 때문에 주요 충족 되지 않은 임상 필요 남아. 더욱이, 장 섬유증은 현재 동물 모형에 있는 제한 때문에 실험실 조정에서 공부하기 어렵습니다. BALB/c 마우스에서 TNBS에 대한 만성 노출은 IL-13 및 TGF-B1 신호화27,28에의해 구동되는 결장에서 강력한 콜라겐 침착을 유도하는 것으로 나타났다. 그러나, 장 섬유증은 DSS 처리, IL-10 결핍, 또는 입양 T 세포 전송 모형과 같은 대장염의 그밖 일상적으로 이용되는 실험실 모형에서 일반적으로 관찰되지 않습니다. Grassl 외. 약화된 ΔAroA 돌...

궤양성 대장염(UC)과 크론병(CD)은 IBD의 두 가지 주요 형태이며 위장관의 만성 및 재발성 염증성 질환으로 특징지어진다 1,2. 이 무질서는 환자의 삶의 질에 중요한 충격이 있습니다. IBD의 현상은 복통, 설사, 구역질, 체중 감소, 발열 및피로를 포함합니다 3. 최근 연구는 질병 병인에 기여하는 유전적 및 환경적 요인을 확인했습니다. 그러한 위험 요소는 발광 항원 4의 전좌 또는 오버 샘플링을 초래하는 상피 장벽의 붕괴에기여한다고생각됩니다. 결과적으로, 이것은 장 내 면역 세포에 의해 매개된 동료 식물에 대한 비정상적인 염증 반응을개시4. IBD 관련 합병증의 특징은 합동, 피부 및 간1,2를포함하여 각종 기관에 영향을 미치는 위관을 넘어 사이트로 확장할 수 있습니다. UC의 특징은 결장1에서전형적으로 국한된 가혹하고 확산성 염증을 포함한다. 질병 병리학은 표면 점막 궤양의 결과로 창자의 점막 및 sub점막에 영향을 미칩니다1. 대조적으로, CD는 질병의 기록이 결장과 말단 ileum2에서일반적으로 발견되지만 기관의 어떤 부분에영향을 미칠 수 있습니다. 또한, CD의 염증은 장 벽2의모든 층에 영향을 미치는 교란입니다.
확인된 몇몇 IBD 감수성 유전자는 상피 장벽 또는 면역의 dysregulation가 질병 진행에 중요한 기여자임을 나타낼 것이다5. 단핵구에 의해 발현된 뉴클레오티드 올리고머화 도메인 2(NOD2)의 돌연변이는 CD에 대한 감수성 증가와 연관되는 것으로 나타났다; 이것은 세균성 분대의 변경한 선천적인 면역 탐지 와 질병6사이 링크를 강조합니다. 최근 게놈 전체 협회 연구 (GWAS)에서 유전 적 변이를 포함하여 IBD의 발병 기전에 잠재적으로 관여하는 추가 경로를 밝혔습니다: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R 종속 경로 적응형 면역, MUC1, MUC19및 PTGER4장 장벽 유지 보수 및 ATG16L-매개 자가 포식7,8,9에연결됩니다. 이 인구 기지를 둔 유전학 연구 결과가 IBD의 우리의 이해를 강화하는 동안, 감수성 eeles 혼자 만성 질병을 개시하고 유지하는 에 불충분합니다3. 창자 microbiome 조성에 있는 변경을 포함하여 그밖 비 유전 요인 및 다양성에 있는 감소는 장 염증과 연관되었습니다. 그러나, 그것은 창 자 dysbiosis 선행 또는 dysregulated 면역 반응의 결과 인지 불분명3. IBD의 병인학은 불분명하게 남아 있더라도, 질병의 병인의 우리의 이해는 장 염증의 실험적인 마우스 모형에 의해 강화되었습니다10,11. 이러한 모델은 개별적으로 인간 질병의 복잡성을 완전히 나타내지는 않지만 IBD와 관련이있을 수있는 병리 생리학적 경로를 해명하고 잠정 치료 전략10의검증에 유용합니다. 11. 이러한 마우스 모델은 전형적으로 화학적 유도 또는 감염, 면역 세포 전달 또는 유전 적 조작에 의한 염증의 개시에 의존한다. 더욱이, 이 전략은 수시로 상피 무결성또는 선천적인 적응성 면역의 변조에 있는 섭동을 관련시킵니다.
살모넬라 장테카 세로바르는 인간과 마우스를 감염시킬 수 있는 장 병원체입니다. 섭취 후, 살모넬라는 상피, M 세포, 또는 항원 제시 세포의 직접적인 침입에 의해 용기를 식민지화 할 수있다12. 마우스는 S와 구두로 감염. 티피무리움은 주로 비장 및 장만 림프절과 같은 전신 부위의 식민지화를 초래하며,기관(12)에서상대적으로 낮은 풍부도를 가진다. 그러나, 스트렙토마이신을 가진 마우스의 전처리는 일반적인 microbiota13의호스트 보호 효력을 감소시킴으로써 창자의 살모넬라 식민지화의 효율성을 향상시킵니다. 이 모델의 병리학적 특징은 상피 장벽의 중단 또는 궤양, 과립구 모집, 및 심한부종(13)을포함한다. 대안적으로, 백신 등급 S를 가진 감염. 티피무륨 ΔAroA 돌연변이는 감염14후에 40일까지 지속되는 장양과 결장의 만성 식민지화로 이끌어 냅니다. S. 티피무륨 ΔAroA 균주는 방향족 아미노산의 생합성에 결함이 있다; 이는 돌연변이 균주를 avirulent렌더링하고 매우 효과적인백신(15)으로서이용될 수 있다. 마우스에서의 경구 감염은 Th1- 및 Th17-사이토카인 관련 염증 반응, 광범위한 조직 리모델링 및 콜라겐 침착을 유도한다. 조직 병리학은 TGF-β1, CTGF 및 IGF14와같은 프로 섬유성 인자의 높은 수준과 연관됩니다. 이 모형에서 보고된 경막섬유성 흉터는 IBD에서 수시로 관찰된 협착한 구조물을 연상시킵니다. 살모넬라에 의한 섬유증의 유도는 살모넬라 병원성 섬 (SPI)-1 및 2 12에의해 인코딩 된 독성을 필요로한다. 중요한 것은,이 S. Tymphimurium ΔAroA 감염 모델은 C57/Bl6 배경상에 유지되는 돌연변이 마우스에서 섬유성 반응의 연구에 유용한 시스템이다. C57/Bl6 스트레인은 S에 매우 민감합니다. Typhiumurim SL1344 감염 때문에 자연 저항 관련 대 식 단백질을 코딩 하는 유전자에서 기능의 손실 돌연변이 (NRAMP)-116,17. 우리는 IL-17A 및 RORα 의존성 선천적 림프세포가 이 모델18에서병인에 중요한 기여한다는 것을 발견하였다.
CD의 주요 합병증은 콜라겐2,19를포함하는 세포외 매트릭스(ECM)의 이질및 과도한 침착이다. 기관은 재생에 대한 상대적으로 높은 용량을 가지고 있지만, 섬유성 흉터는 만성 및 심한 염증과 관련된 해결되지 않은 상처 치유 반응으로 인해 발생할 수 있습니다20,21. CD에서, 이것은 중요한 기관 손상으로 이끌어 내는 조직 건축에 해로운 효력 결과21,22. CD에서 관찰되는 염증의 경막특성은 궁극적으로 증상 협착 또는 협착형성(21)과관련된 장벽의 두껍게 하기 선행한다. CD 환자의 대략 1/3은 이 합병증을 위한 장절제술을 요구합니다 22. 아자티오프린 또는 항 TNFα 생물학적 제제와 같은 면역 억제제의 사용이 외과 적 개입의 요구 사항을 적당히 감소시켰거나 단지 겸손하게 감소했다는 점을 감안할 때 IBD에는 효과적인 항 섬유성 치료법이 없습니다19,23 . 섬유증은 만성 염증의 결과라고 생각되지만, 섬유아세포 및 회구와 같은 중간엽 기원의 세포는 섬유성흉터21,24에서ECM의 1차 세포 공급원으로 생각된다. 만성 S. 티피무리움 ΔAroA 감염은 CD와 같은 특징의 병인에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 장 섬유증의 강력한 마우스 모델입니다.

<table><tbody><tr><td>2 ml 둥근 바닥 안전 잠금 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 비드</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>대형 오리피스 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>2707134</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 메가블록 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>Gavage 니들</td><td>FST</td><td>18061-22</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토 마이신 설페이</td>트 <td>시그마</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>믹서 밀</td><td>Retsch</td><td>MM</td><td></td></tr></tbody></table>

만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

콜라겐과 같은 세포외 기질의 병리학적 축적을 특징으로 하는 조직 섬유증은 지속적인 염증 및 이질성 수선의 결과이다. 염증성 장 질환 (IBD)에서 섬유증은 외과 적 절제술 이외의 효과적인 치료법이없는 재발성 협착 형성으로 이어집니다. 그것의 늦은 개시 때문에, 섬유증을 구동하는 프로세스는 보다 적게 공부하고 크게 알려지지 않습니다. 그러므로, 섬유성 합병증은 IBD에 있는 중요한 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 장 섬유증의 강력한 생체 내 모델은 C57Bl/6 마우스의 스트렙토마이신 전처리가 백신 등급살모넬라 티피무리움 ΔAroA 돌연변이를 이용한 경구 관치에 이어 지속적인 병원체 식민지화로 이어지는 곳에 설명되어 있습니다. 장의 섬유증. S를 준비하기 위한 방법론. 시피무리움 ΔAroA 는 장 내 의 장 내 적폐증, 병원균 부하 정량화, 장 조직에서 콜라겐 침착 평가에 대해 설명합니다. 이 실험적인 질병 모형은 CD 같이 장 섬유증을 강화하거나 악화시키는 호스트 요인을 검토하기 위해 유용합니다.

S를 가진 경구 감염에 선행된 연쇄상 구균 성미 증 처리. 티피무륨 ΔAroA는 특히 맹장에서 강력한 장 염증 및 섬유증을 유발합니다(그림 1). 일반적인 병원균 부담은 1g의 삼장당 10 8~10CFU, 비장 1g당 104 CFU의 감염동물로부터 회복될 수 있다(그림2). 피로시리우스 적색 스테인드 세칼 섹션에서 섬유증의 평가는 감염 후 21일 동안 피크 섬유증을 나타내며 병리학의 대부분은 42pi(그림 3 및 그림 4)에의해 해결된다. 콜라겐 증착은 점막의 섬유증이 온화하면서 장의 점막에서 가장 두드러집니다.
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이 프로토콜은 갈모넬라 구동 장 섬유증의 마우스 모델을 설명합니다 이는 국외 염증과 섬유증을 포함하여 크론병의 주요 병리학 적 특징을 닮았다. 이 방법은 C57Bl/6 유전 적 배경에 유지 돌연변이 마우스를 사용하여 섬유성 결과를 변경 호스트 요인을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

조직 섬유증은 만성 염증 이나 노화에 대 한 응답으로 시간이 지남에 실패 하는 장기 주요 방법. 그리고 사실, 나는 당신이 전염성 에이전트 또는 암으로 정지하지 않는 경우에, 당신이 나이든 기관 섬유증에서 정지할 가능성이 있다는 것을 주장할 것입니다. 불행히도, 인간의 조직 섬유증을 모방하는 훌륭한 마우스 모델이 많지 않습니다.그래서 우리가 개발한 것은 크론병의 마우스 모형입니다, 그것은 창자의 섬유증을 일으키는 원인이 되고 크게 치료할 수 없는 인간에 있는 질병입니다. 사실, 당신이 그것을 치료할 수 있는 유일한 방법은 섬유 조직의 외과 제거 및 창자의 재 결찰을 통해서입니다. 우리의 모형의 장점은 모든 마우스 긴장에 있는 완전히 침투이고 아주 밀접하게 인간 Crohn의 질병을 모방하고 섬유증은 실제로 강력한 모형인 한 달 이상 지속한다는 것입니다.이 절차의 가장 어려운 부분은 마우스의 처리, 특히 경구 영역은 많은 연습 특별 인증을 필요로하기 때문에. 이 절차를 처음으로 수행할 때 살모넬라와 함께 작업하려면 적절한 안전 예방 조치와 멸균 기술이 필요하다는 것을 알아야합니다. 폐기물과 박테리아의 처리는 모두 실험 전에 계획되어야합니다.이 절차의 시각적 데모는 특별한 안전 예방 조치뿐만 아니라 적절한 멸균 기술이 필요한 살모넬라의 처리를 포함하기 때문에 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면, 밀리리터 당 100 마이크로 그램의 농도에 연쇄 상 미신을 포함하는 LB 천접시를 설정합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 S typhimurium 델타 화살표의 냉동 글리세롤 스톡으로 접시를 줄입니다.섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 줄무늬 플레이트는 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다. 감염 되기 하루 전에, 항생제를 준비 하기 위해 물 2.5 밀리 리터에 연쇄 상 균의 0.5 그램을 용해.필터는 연쇄상 구균 용액을 살균합니다. 그런 다음, 전구 팁 22 게이지 게이지 바늘을 1밀리리터 주사기를 사용하여 연쇄상 구균용액의 100 마이크로리터로 마우스를 구두로 게이버링한다. 다음으로, 배양 튜브에 밀리리터당 50 마이크로그램의 농도로 연쇄상 구균을 함유한 LB 국물의 3밀리리터를 첨가한다.접종 루프를 사용하여 단일 콜로니로 LB 국물을 접종합니다. 200 rpm에서 흔들어와 37 섭씨에서 하룻밤 문화를 배양. 감염 당일, 멸균 PBS를 사용하여 하룻밤 살모넬라 배양의 2회 연속 1~10희석을 수행하

chronic-salmonella-infection-induced-intestinal-fibrosis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

영구와 만성 세균 감염 마우스 모델...

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

염증성 장 질환의 실험적 모델은 우리가 pathogenesis와 관련된 복잡한 본래과 적응 면역 반응을 조사 수 있습니다. histological 채점, 프로 - 염증 크린 시토킨 및 myeloperoxidase 활동 부량 사용하여, 하나는 염증성 장 질환에서 볼 이러한 반응을 평가하기 시작할 수 있습니다.

IBD의 DSS 유발 모델에서 창자 염증을 조사

출처: Lo, B. C. 외 만성 살모넬라 감염으로 인한 장섬유증. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 스트렙토마이신 내성 살모넬라 티피무리움 에 감염된 마우스 모델에서 박테리아 부하를 정량화하는 과정을 보여줍니다. 안락사와 멸균 해리 후에는 맹장과 비장 조직을 채취하여 박테리아를 방출하기 위해 강철 구슬로 균질화하고, 연속적으로 희석합니다. 희석액은 선택적 한천에 도판되며, 가시적 군락을 세기 위해 장 및 전신 부위의 조직당 세균 부하를 추정합니다.

만성 장 감염 마우스 모델에서 조직 세균 부하의 정량화

Citrobacter rodentium 감염이 장의 세균 감염을 공부뿐만 아니라 마우스의 면역 반응 및 대장염를 개최 할 수있는 중요한 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 장벽 무결성, 병원체 부하와 손쥐 전염성 대장염에 대한 병원체 및 호스트 공헌의 철저한 특성을 허용하는 조직 학적 손상의 측정을 설명합니다.

<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; 마우스 모델 : 감염성 대장염에 대한 공부 병원체 및 호스트 기부

담즙 흐름의 중단은 형태학적 변화의 특징적인 시간 의존적 순서와 함께 심각한 염증성 담즙 유발성 간 손상을 초래합니다. 여기에서는 21일에서 28일 후에 강한 섬유화 반응을 유도할 수 있는 마우스의 총담관 수술 결찰에 대한 프로토콜을 제시합니다.

마우스의 담관 결찰 : 폐쇄성 담즙에 의한 염증성 간 손상과 섬유화의 유도

이 연구에서는, 우리는 Crohn의 섬유증에 비교병생리학을 전시하는 TNBS 중재장 섬유증의 상세한 절차를 기술합니다. 우리는 또한 라파마이신이 장 섬유증에 대한 억제 효과를 촉진에 비추어이 접근법을 논의합니다.

TNBS 중재장 섬유증의 발달에 기계론적 통찰력 과 라파마이신의 억제 효과 평가

우리는 살아있는 유기체의 합병증 없이 모계 염증에 태아 노출을 시뮬레이션하기 위하여 chorioamnionitis의 모형을 개발했습니다 자손의 창자 발달에 FEMI의 효력을 검토합니다. 이것은 chorioamnionitis 다음 장 상해의 발달을 위한 기계론적인 원인의 연구를 허용합니다.

신생아 장 발달에 급성 chorioamnionitis의 효력을 연구하기 위하여 모성 염증에 태아 노출의 Murine 모형

본 프로토콜은 설치류에서 크론과 같은 대장염 모델의 개발을 설명합니다. 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서 협착으로 이어지고, 협착증에 근접한 세그먼트에서 기계적 확대가 관찰됩니다. 이러한 변화는 대장염의 기계적 스트레스를 연구 할 수있게합니다.

크론병에서 기계적 스트레스의 병원성 역할을 연구하는 TNBS 유도 설치류 모델

이 프로토콜은 마우스 모델 시스템에서 그람 음성 단세균 패혈증의 유도를 기술한다. 상기 모델은 패혈증 동안 염증성 및 치명적인 숙주 반응을 조사하는데 유용하다.

살모넬라 티피뮤리움-유도된 마우스의 패혈성 복막염의 특징

이 프로토콜은 크론병(CD) 유사 회장 염증 및 섬유증의 Src 상동성 2 도메인 함유 5'-이노시톨 포스파타제(SHIP) 결핍 마우스 모델을 사용하여 CD에 대한 새로운 치료법을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

크론병 유사 회장염 및 섬유증의 SHIP 결핍 마우스 모델에서 치료 개입 평가

배우세요 만성 살모넬라 감염을 이용한 마우스 장 섬유증 모델 구축 방법을. 스트렙토마이신 전처리와 경구 감염으로 크론병 유사 섬유증을 유도하여 치료 표적 연구에 활용할 수 있습니다.

만성 살모넬라 감염 유도 장 섬유증

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