Name: 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-Cas9를 이용한 정의된 게놈 수정 기법을. 이 방법은 이형접합 및 동형접합 돌연변이를 효율적으로 생성하여 유전자 기능과 질병 연구에 필수적인 동일유전자계 세포주를 만듭니다.

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이 연구는 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 (NHLBI), 보조금 U01HL099656 (P.G. 및 D.L.F.) 및 U01HL134696 (P.G. 및 D.L.F.)를 통해 건강의 국립 연구소에서 자금지원되었다.

1. 가이드 RNA (gRNA)의 설계 및 건설
참고: 각 gRNA는 100 bp 이중 연선(ds) 올리고뉴클레오티드(그림1A-C)를생성하기 위해 어닐링되는 2개의 60염기쌍(bp) 올리고뉴클레오티드로 구성된다. gRNA 설계, 생성 및 테스트 절단 효율에 대한 타임라인은 약 2주입니다(그림2).
<ol><li>유전체 편집할 관심 있는 DNA 영역을 선택하고 형식에 맞는 3-4 23 bp서열을 식별, 5'-G(N 19)NGG-3'. 이러한 서열은 관심 영역의 20 bp 내에 위치해야 합니다. 참고: 타겟팅은 감지 또는 안티센스 가닥에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>CRISPOR(http://crispor.tefor.net)와 같은 자원을 사용하여 게놈 중복 성 및 오프 타겟 확률에 대한 gRNA 서열을 평가합니다.</li>
	<li>도시된 바와 같이 20bp 표적 서열(프로토스페이서 인접 모티프 또는 PAM 제외)을 2개의 60-mer 올리고뉴클레오티드(서열은 5' ~ 3'이고 적색 및 녹색은 도 1C에도시된 바와 같이 역보수)에 통합한다.</li>
	<li>선택의 공급 업체에서 두 60 bp 올리고 뉴클레오티드를 주문합니다. 올리고뉴클레오티드가 수신되면, ddH2O. 10 μM의 작동 스톡을 만들어 100 μM의 최종 농도로 각각 재중단한다.</li>
	<li>두 올리고뉴클레오티드를 어닐레에 DNA 폴리머라제(표자료)를이용하여 100 bp dsDNA 단편을 생성한다. 5 μL의 10 μM 포워드 올리고뉴클레오티드 및 10 μM의 역 올리고뉴클레오티드를 중합효소 연쇄 반응(PCR) 스트립 튜브에 결합하고 95°C에서 5분간 배양합니다.</li>
	<li>표 1에설명된 대로 PCR을 설정합니다. 표 2에 설명된 매개 변수를 사용하여 열 주기에서 PCR 증폭을 수행합니다.</li>
	<li>PCR 제품을 1.5% (w/v) 에티듐 브로마이드(EtBr) 아가로즈 젤을 80-100V에서 40분 동안 40분 동안 전기화시켰다. 추출 키트(재료 표).</li>
</ol>2. 스크리닝을 위한 PCR 프라이머 설계
<ol><li>관심 있는 유전자의 400-500 bp 영역을 증폭하도록 특별히 설계된 전진 및 역방향 PCR 프라이머를 사용하여 편집된 DNA의 스크리닝을 수행한다(표2). 임의의 대조군 iPSC 라인에서 분리된 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인한다.</li>
	<li>1시간 동안 80-100V에서 전기영동을 한 후 1.5%(w/v) 젤로 PCR 제품을 시각화합니다. 참고: 편집된 클론의 시퀀싱은 스크리닝 프라이머 세트의 확인 후 설계된 중첩 프라이머를 사용하여 수행됩니다. 시퀀싱을 위해 시료를 상용 소스로 보냄.</li>
</ol>3. gRNA_복제 벡터 플라스미드의 준비
<ol><li>복제 벡터를 선형화하려면 1.5 mL 원심분리기 튜브를 취하고 AflII 제한 효소 완충제의 4 μL과 함께 gRNA_클로닝 벡터의 DNA 1-5 μg를 추가하고 AflII 제한 효소의 1.5 μL을 추가합니다. ddH2O. 24 μL의 반응을 불러오십시오. 밤새 37 °C에서 배양하십시오 (O / N).</li>
	<li>전기포어는 80-100 V에서 80-100 V에서 1 시간 및 소비세 대역에 대한 1% 아가로즈 겔에 (예상 밴드 크기는 ~ 3519 bp이다).</li>
	<li>1.6단계에서와 같이 추출및 정제한다.</li>
</ol>4. gRNA 벡터의 조립
<ol><li>표 3에기재된 바와 같이 AflII 소화gRNA 클로닝 벡터의 1:5 비율로 1:5 비율로 반응을 설정하고 DNA 단편을 조립한다.</li>
	<li>50°C에서 15분 동안 배양하여 ddH2O에서 반응을 1:3 희석하고 제조자의 지시에 따라 세균 변환을 위해 3 μL을사용한다(재료 표). 카나마이신 LB/한천 플레이트의 플레이트 셀.</li>
	<li>gRNA당 3-5개의 콜로니를 선택합니다. 각 콜로니를 LB 4 mL로 접종하고 궤도 흔들림 인큐베이터에서 37°C에서 O/N을 성장시다.</li>
	<li>미니프렙 플라스미드 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화하고, 성공적인 복제를 보장하기 위해 다음 프라이머를 사용하여 각 gRNA를 서열화한다: 앞으로: GTACAAAAAAAAAAAAAAAGCAGGTTAAGGAAGGAAGG; 역: TGCCAACTTTGTACAAAGCT.</li>
</ol>5. 테스트 gRNA 절단 효율
<ol><li>앞서 설명한바와같이 6웰 플레이트에서 조사된 뮤린 배아 섬유아세포(MEFs)에 대한 플레이트 hESCs. 세포가 70-80% 동률에 도달하면 표 4에설명된 형질감염 마스터 믹스를 준비합니다.</li>
	<li>파이펫팅하고 RT에서 15 분 동안 배양하여 혼합하십시오. 세포에 드롭 와이즈를 추가하고 37 °C에서 48 시간 동안 배양하십시오 (24 시간 후 미디어 변경).</li>
	<li>48 시간 후에 분류하기위한 수확 세포.<ol>
<li>3분 RT 인큐베이션으로 MEF를 효소적으로 제거합니다(재료표).</li>
		<li>hESC배지로세포를 1x 헹구고 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 다수소염화물(재료 표)로긁어냅니다.</li>
		<li>펠릿 세포는 300 x g에서 3 분 동안 hESC 배지 + 10 μM Y-27632 디하이드로 클로라이드의 0.5 mL에서 재중단.</li>
		<li>35 μm 셀 스트레이너 캡을 통해 5 mL 튜브로 필터링합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 활성화 세포 선별(FACS)을 사용하여, 살아있는 세포에 대한 게이트및 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포를 정렬한다.</li>
	<li>최대 1.5 x 104 개의 분류 된 세포를 1:3 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표)로코팅 한 10cm2 접시에 직접 옮기고 Y-27632 디하이드로 염화물을 함유 한 hESC 배지(표 5)에조사 된 MEF를 조사합니다.</li>
	<li>Y-27632 디하이드로클로라이드없이 hESC 배지(표 5)를사용하여 매일 배지를 변경하고 콜로니가 직경이 ~ 1mm인 경우 10-15 일 후에 수동으로 클론을 선택합니다.<ol>
<li>P200 파이펫과 현미경을 사용하여 조심스럽게 단일 클론을 긁어 내고 피펫에 세포를 그립니다.</li>
		<li>콜로니와 함께 그려진 배지에서 96 웰 플레이트에서 3-4x를 부드럽게 피펫팅하여 세포를 분산시.</li>
		<li>5 분 동안 10,000 x g에서 원심 분리하여 세포를 스크리닝하고 펠릿을 위해 PCR 스트립 튜브에 분배하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 복제 스크리닝
<ol><li>단백질화 K 완충액의 20 μL에서 세포 펠릿을 배양하여 DNA를 분리(표 55°C에서 1 시간 및 95 °C에서 10 분) 및 와류를 힘차게. 10,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를 수집하고 상류를 수집합니다.</li>
	<li>단백질분해제 K 다이제스트의 관심 영역 및 5 μL을 증폭하도록 설계된 프라이머를 포함하는 마스터 믹스를 사용하여 총 부피 20 μL에서 스크리닝 PCR(섹션 2)을 수행한다. 유전자가 대조군으로서 편집된 세포주로부터 분리된 게놈 DNA를 사용한다.</li>
	<li>2.5% (w/v) 아가로즈 겔(그림 3B,C)에70-90 V에서 1 시간 전기 영동 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 크기 차이는 분열을 나타냅니다.</li>
</ol>7. 단일 가닥 올리고 DNA (ssODN)를 사용하여 다능성 줄기 세포에서 정확한 게놈 편집
<ol><li>설계 100 bp ssODN은 최고의 절단 효율을 가지는 것으로 결정된 가장 효율적인 gRNA 서열을 중심으로 합니다.</li>
	<li>gRNA 서열에 침묵하는 돌연변이를 도입하여 재결합된 ODN의 재절단을 방지한다. PAM 서열에서 단일 무음 돌연변이는 충분하지만 가능하지 않은 경우 3-4 개의 자동 돌연변이가 작동합니다. 참고: 표적 클론의 스크리닝을 용이하게 하기 위해, gRNA 서열의 ~20 bp 이내의 제한 부위의 도입이 이상적이다.</li>
	<li>원하는 염기 변경으로 하나의 ODN을 설계하여 베이스 변경 없이 관심 있는 돌연변이와 하나의 ODN을 생성합니다. 참고: 이러한 변경 사항은 더 먼 거리에서 재조합이 상당히 떨어지기 때문에 예측된 CRISPR/CAS9 절단 사이트에서 ~20bp 를 넘지 않아야 합니다.</li>
	<li>2개의 ssODN을 선택한 공급업체에서 주문하고 물에 다시 일시 중단하여 1 μg/μL 스톡을 만듭니다. -20 °C에서 주식을 저장합니다.</li>
</ol>8. 형질 감염 설정
<ol><li>ssODN 및 CRISPR-CAS9 플라스미드를 트랜스펙트하기 위해, O/N 인큐베이션 후 70-80% 수렴에 도달하기 위해 조사된 MEF에 6웰 접시에 표적 세포줄을 플레이트한다.</li>
	<li>표 6에기재된 바와 같이 형질감염 반응을 설정한다. 파이펫팅에 의해 반응을 혼합하고 RT에서 15 분 동안 배양. 형질전환 반응 혼합물을 세포에 드롭 와이즈를 추가합니다.</li>
	<li>48시간 후, 섹션 5.3에 기재된 바와 같이 세포 정렬을 위한 세포를 준비한다.</li>
	<li>200 μL 파이펫을 사용하여 단일 세포를 도금 한 후 ~ 10 일 동안 식민지를 선택하십시오. 100 μL의 세포를 이전에 젤라틴으로 코팅한 24 또는 48 웰 플레이트 중 하나에 전달하고 Y-27632 디하이드로클로라이드로 hESC 배지에 조사된 MEF를 조사하였다. 섹션 6에 기재된 바와 같이 DNA 격리를 위해 나머지 100 μL을 사용한다.</li>
</ol>9. 단일 식민지에서 돌연변이 확인
<ol><li>ssODN의 성공적인 통합을 확인하려면, 섹션 2에서 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 콜로니로부터 분리된 DNA의 5 μL을 취하십시오. PCR제품(재료표)을정화하고 ssODN에서 생성된 독특한 효소 부위를 이용하여 제한 효소 소화를 준비한다. 참고: 이 소화에는 제한 효소 완충제와 제조업체가 권장하는 제한 효소 농도가 40 μL의 양으로 포함되어 있습니다.</li>
	<li>파이펫팅하여 반응을 혼합하고 제조업체의 권장 온도에서 1-3 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>소화된 PCR 제품을 1.5% (vv) EtBr 아가로즈 젤에 80-100V에서 40분 동안 전기로 가다. ssODN의 성공적인 통합이 발생한 경우, 중첩된 프라이머를 사용하여 특정 돌연변이를 시퀀스한다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서, CRISPR-CAS9를 2개의 ssODN 수리 템플릿과 함께 사용하여 특정 이형이능 또는 동형접합체 게놈 변화를 생성하는 것은 인간 다능성 줄기 세포에서 입증된다. 이 방법은 10%에 가까운 효율로 이형게놈 변화를 발현하는 이소제세포주를 성공적으로 생성시켰다. 이 프로토콜은 세포 선별 후 저밀도에서 세포를 배양한 후 세포 성장과 생존을 지원하는 조사된 MEF에서 성장한 인간 ESCs 및 iPSCs 모두에 최적화되었습니다. 세포 사멸은 10 ng/mL bFGF 및 Y-27632 디하이드로클로라이드로 세포를 유지함으로써 최소화될 수 있다. 이 프로토콜은 피더 프리 컬쳐 시스템에 적용될 수 있지만 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
형질감염 효율은 세포주에서 세포주까지 가변적일 수 있지만, 지질 형질전환 시약의 DNA 3 μg 및 3 μL의 사용은 일반적으로 0.5-2% 사이의 형질감염 효율의 최상의 결과를 주었다. 그러나, 형질감염 효율이 낮으면, DNA 및 지질 ...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 다른 혈통의 세포 유형을 생성하는 능력을 유지하면서 재생 능력으로 인해 인간 질병을 모델링하기위한 귀중한도구입니다1,2 ,3,4. 이들 모델은 유전자 기능을 심문할 수 있는 가능성을 열어주며, 특정 돌연변이와 표현형이 다양한질병과어떻게 관련되어 있는지 를 이해한다5,6. 그러나, 특정 변경이 특정 표현형에 어떻게 연결되는지 이해하기 위하여, 쌍이성 등소제 학적 제어 및 돌연변이 세포주의 사용은 라인 대 라인 가변성7,8에대한 제어에 중요하다. 전사 활성제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제는 1차 세포를 포함한 다양한 유전 모델에서 삽입 또는 결실(indels) 돌연변이를 생성하는데 사용되어 왔다; 그러나 이 뉴클레아제는 9,10,11,12,13,14를사용하는 것이 번거로울 수 있습니다. 클러스터된 정기적인 간격짧은 palindromic 반복 (CRISPR)-CAS9 뉴클레아제의 발견은 게놈의 거의 모든 영역에서 인델 형성의 효율성, 사용의 단순성 및 비용 절감으로 인해 분야에 혁명을 일으켰습니다15 , 16세 , 17세 , 18세 , 19.
CRISPR-CAS9 기반 게놈 편집 기술을 사용하는 데 있어 도전과제는 제2 대문자20에서인델 돌연변이를 생성하지 않고 하나의 대문자에서 특정 돌연변이의 생성 또는 보정이었다. 이 프로토콜의 주요 목표는 두 개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(ssODN) 수리 템플릿을 사용하여 제2 대문에서 의인 형성을 감소시킴으로써 이러한 과제를 극복하는 것이다. 두 ssODN은 CAS9 뉴클레아제에 의한 재절단을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하도록 설계되었지만, 오직 하나만이 관심의 변경을 포함하고 있다. 이 방법은 제2 대문예에서 인델 형성을 유도하지 않고 특정 이형 유전적 변형을 생성하는 효율을 증가시킨다. 이 프로토콜을 사용하여, 6개의 독립적인 게놈 위치에서의 유전자 편집 실험은 두 번째 알레르에서 인델 형성없이 하나의 대틀에서 원하는 게놈 변화의 정확한 도입을 입증하고 ~ 10%의 전반적인 효율로 발생한다. 기재된 프로토콜은 Maguire 외21에서적응되었습니다.

<table><tbody><tr><td>세포 여과기 캡이 있는 5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6웰 폴리스티렌 조직 배양 접시</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>형광 활성화 세포 분류기(FACS) 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson 조립 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 플레이트 포함 50 &mu; g/ml 카나마이신</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>리포펙타민 줄기 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 성장 인자 감소(GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>쥐 배아 섬유아세포(MEF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오스핀 겔 추출 및 PCR 클린업 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaking incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP 벡터</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스트립 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5&times; Phusion buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드/ROCK 억제제 (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 다능성 줄기 세포에서 crispr-cas9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

인간의 다능성 줄기 세포는 유전자 기능을 연구하고 질병과 관련된 특정 돌연변이를 모델링하는 강력한 시스템을 제공합니다. 정확한 이형 유전 적 변형의 생성은 CRISPR-CAS9가 두 번째 알레일에서 인델 형성을 매개했기 때문에 도전적입니다. 여기서는 두 템플릿 모두 재절단 및 인델 형성을 방지하기 위해 자동 돌연변이를 포함하는 반면, 하나의 복구 템플릿만 이 문제를 극복하는 데 도움이 되는 프로토콜을 시연합니다. 이 방법론은 인간 질병 및 생물학을 공부하기 위한 이원성 제어 및 돌연변이 인간 줄기 세포주를 생성하는 DNA의 유전자 편집 코딩 영역에 가장 유리하다. 또한 유전자 편집 실험의 인건비와 비용을 줄이기 위해 형질전환 및 스크리닝 방법론의 최적화가 수행되었습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포 모델을 활용하는 많은 게놈 편집 프로젝트에 널리 적용가능하다.

인델에 대한 gRNA 생성 및 스크리닝
각 gRNA는 플라스미드 벡터로 복제되고 U6 프로모터를 사용하여 발현될 것이다. AflII 제한 효소는 플라스미드(addgene #41824)를 선형화하는 데 사용되며 U6 프로모터 의 후에 위치한다. 2개의 60 bp 올리고를 어닐링한 후에 생성된 100 bp 대역은 DNA 조립체를 사용하여 gRNA 발현 벡터내로 복제된다. gRNA 플라스미드가 생성되면, 그들은 CRISPS-CAS9 GFP 플라스미드(addgene #44719)와 함께 hESCs 또는 iPSCs로 형질감염된다. GFP+ 세포는 형질감염된 세포를 풍부하게 하기 위해 2일 후에 분류되고 도금된다(섹션 5 참조). 10-14일 후에, 단세포 유래 식민지는 각 gRNA를 위해 생성된 인델 형성을 위해 DNA를 선별하고 분리하는 데 사용된다. gRNA 부위에 걸친 프라이머를 이용한 PCR 증폭은 EtBr을 이용한 2.5%(w/v) ...

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

유전자 기능 과 질병의 연구는 인간 인구의 근간 특성에 의해 방해된다. 환자 특이적 및 제어 iPS 세포주의 다른 유전 적 배경은 주어진 기능적 분석에서 발견되는 분화 효율 및 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 유일한 차이점은 관심의 특정 돌연변이는 이 문제점을 극복하기 위하여 중요한 유전으로 동일하거나 동소성 선의 사용은 중요합니다.많은 인간 질병은 CRISPR-Cas9 시스템으로 생성하기 어려울 수 있는 이종화구 돌연변이에 기인합니다. 이것은 매우 높은 주파수에서 발생할 수있는 비 표적 적 진상선에서 인델 돌연변이의 생성에 기인한다. 우리의 기술은 하나의 관심의 돌연변이를 항구두 수리 템플릿을 사용하여이 문제를 극복.이 기술을 시도하는 모든 구문은 인간 다능성 줄기 세포 배양에 숙련되어야합니다. 식민지 따기의 비디오 데모는 정확한 크기와 형태뿐만 아니라 따기 및 스크리닝에 사용되는 기술을 표시하는 데 도움이 될 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 레오 카르데나스입니다.먼저, 6웰 플레이트에 조사된 MEF에 인간 ESC를 플레이트합니다. 트랜스펙트 마스터 믹스를 준비합니다. 파이펫팅으로 섞고 실온에서 15분간 배양합니다.세포가 70 ~80%의 합류에 도달하면, 세포와 잘 현명하게 수축하는 형질 전환 마스터 믹스를 추가하고 48시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 24시간마다 미디어를 변경합니다. 세포를 수확하려면 먼저 실온에서 3 분 동안 트리플 E로 세포를 배양하여 MEF를 효소적으로 제거합니다.10 마이크로 몰라 ROCK 억제제와 HESC 배지의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 펠릿 세포는 3분 동안 300배 g로, 10개의 마이크로몰러 ROCK 억제제로 인간 ESC 배지의 0.5 밀리리터에서 다시 중단한다. 세포 현탁액을 35 미크론 세포 스트레이너 캡을 통해 5 밀리리터 튜브로 필터링합니다.형광 활성화 세포 분류를 사용하여 살아있는 세포에 게이트와 녹색 형광 단백질 양성 세포를 정렬합니다. 다음으로, 최대 1.5배 10회 를 10센티미터 의 정산세포로 직접 10센티미터 의 접시로 이송하여 1~3개의 지하 막 매트릭스로 코팅하고, ROCK 억제제가 함유된 MEF및 인간 ESC 배지를 조사하였다. ROCK 억제제 없이 인간 ESC 배지를 사용하여 매일 배지를 변경합니다.10 내지 15일 후에, 식민지는 직경이 대략 1 2 밀리미터입니다. 현미경으로 P200 파이펫을 사용하여 단일 클론을 조심스럽게 긁어 내고 세포를 파이펫으로 그립니다. 콜로니와 함께 작성된 배지에서 3~4회 부드럽게 파이프를 사용하여 96웰 플레이트의 우물에 세포를 분산시한다.그런 다음 각 가이드 RNA에 대해 20 개의 콜로니를 선택하고 검사를 위해 PCR 스트립 튜브로 분배하십시오. 5 분 동안 10, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 이제, DNA와 소용돌이를 적극적으로 격리하기 위해 Proteinase K 버퍼의 20 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 배양합니다.원심분리기는 10, 000배 G에서 5분간. 다음으로, 편집된 DNA의 PCR 스크리닝을 수행한다. 관심 영역을 증폭하도록 설계된 전방 및 역 프라이머를 포함한 마스터 믹스의 20 마이크로리터와 Proteinase K 다이제스트의 5개의 마이크로리터를 튜브에 추가합니다.대조군 iPSC 라인에서 분리된 게놈 DNA를 사용하여 스크리닝 PCR을 수행할 때 깨끗한 앰플리콘을 확인합니다. 부피 아가로즈 젤에 의해 2.5 %의 무게에 70 ~ 90 볼트에서 전기 전구의 1 시간 다음 PCR 제품의 크기 변화를 평가합니다. 모든 크기 차이는 분열을 나타냅니다.단일 가닥 올리고 DNA와 CRISPR-Cas9 플라스미드를 변형시키기 위해, 조사된 MEF에 대한 6웰 접시에 표적 세포주를 플레이트하여 하룻밤 동안 인큐베이션을 통해 70~80%의 인플루언스에 도달합니다. 설명된 바와 같이 형질 전환 반응을 설정합니다. 파이펫팅으로 반응을 혼합하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.그런 다음, 세포에 현명하게 떨어지는 형질 전환 반응 혼합물을 추가한다. 48 시간 후에, 이전과 같이 세포 분류를 위한 세포를 준비합니다. 단일 세포를 도금 한 후 약 10 일, PCR 스트립 튜브에 식민지를 선택하고 젤라틴과 MEF로 미리 코팅 된 12 웰 플레이트의 우물에 200 마이크로 리터 파이펫을 사용합니다.이전에 는 젤라틴으로 코팅되고 ROCK 억제제와 인간 ESC 배지에서 조사 MEFs24 또는 48 웰 플레이트의 각 우물에 세포의 100 마이크로 리터를 전송합니다. DNA 격리를 위해 나머지 100 마이크로리터를 사용합니다. 단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합을 확인하려면 이전에 설계된 스크리닝 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하기 위해 각 식민지에서 분리 된 DNA의 5 마이크로 리터를 복용하십시오.PCR 제품을 정화하고 단일 스트랜드 올리고 DNA에서 생성 된 독특한 효소 부위를 사용하여 제한 효소 소화의 40 마이크로 리터를 준비합니다. 제조업체의 권장 온도에서 파이펫팅및 인큐베이션을 사용하여 반응을 1~3시간 동안 섞습니다. 이어서, 에디듐 브로마이드 아가로즈 젤, 전기전도80~100볼트에 40분 동안 1.5%의 중량으로 로딩 염료로 첨가된 소화PCR 제품을 시각화한다.단일 가닥 올리고 DNA의 성공적인 통합이 발생한 경우 중첩 된 프라이머를 사용하여 서열 특정 돌연변이가 발생합니다. 이 연구에서는, 가이드 RNA 시공을 위해, 100개의 베이스 쌍 밴드가 1.5%의 아가로즈 젤로부터 절제되었다. 세포 형질전환 에 이어, 가이드 RNA 절단의 유효성 검사는 2.5%의 아가로즈 젤을 사용하여 시각화하였다.180베이스 페어 PCR 제품은 인델 형성을 나타내는 밴드 시프트가 있는 절단되지 않은 컨트롤과 다른 클론을 보여주었습니다. 다른 가이드 RNA는 다른 절단 효율성을 했다. 편집된 알레일의 CRISPR-Cas9 재절단을 피하기 위해, PAM 서열은 G를 사용하여 자동 돌연변이로 수정하였다.PAM 서열의 자동 돌연변이는 하나의 또는 두 개의 모두에 성공적인 통합을 위해 스크리딩하는 데 도움이 되는 고유한 제한 사이트를 생성했습니다. 게놈 편집 줄기 세포주 다운스트림 분화 및 기능적 분석은 인간의 발달과 질병에 주어진 돌연변이의 효과를 연구하기 위해 사용될 수있다. 이 방법론은 다양한 인간 질병에 연루된 특정 이종화구 또는 동종질 돌연변이를 가진 동종 세포주의 생성을 허용합니다.이 질병 모형은 새로운 세포 치료의 발달을 위한 도로를 포장하고 약 발견을 위한 발판을 제안합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 아연-핑거 뉴클레아제 기반 게놈 편집 기술을 보여줍니다. hPSC는 잠재적으로 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있기 때문에 이 기술은 환자 맞춤형 방식으로 체외 병리학 및 약리학 연구에 도움이 됩니다.

Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS(CRISPR-associated) 시스템과 같은 게놈 편집 도구는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)의 유전자 표적화 효율성을 크게 향상시켰습니다. 이 원고는 CRISPR/Cas 시스템 보조 상동 재조합을 사용하여 계통 특이적 hiPSC 리포터를 생성하는 프로토콜을 설명합니다.

hiPSC 신경 리니지 특정 올림피아 기자의 효율적인 생성 사용 CRISPR / Cas9 및 Cas9 더블 Nickase 시스템

인간 만능 줄기 세포(hPSC)의 게놈 편집을 빠르고 효율적으로 수행할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 EGFP를 발현하고 항생제 내성을 도입하기 위해 AAVS1 세이프 하버 유전자 자리를 편집하여 예시된 바와 같이 hPSC를 유전적으로 조작하는 강력한 실험 절차입니다.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기에 설명 된 endogenously 태그 프로토콜 표시 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에 형광 태그와 단백질 이다. 상 편집된 셀 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 풍성 하 게 하 고 클론 세포 생성 됩니다.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 형질주입 및 mRNA 핵 박션을 사용하여 인간 세포주에서 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 후성유전체 편집 방법을 설명합니다.

Plasmid DNA Transfection 및 mRNA Nucleofection Delivery를 사용한 인간 세포의 CRISPR 에피게놈 편집

배우세요 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-Cas9를 이용한 정의된 게놈 수정 기법을. 이 방법은 이형접합 및 동형접합 돌연변이를 효율적으로 생성하여 유전자 기능과 질병 연구에 필수적인 동일유전자계 세포주를 만듭니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

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