Name: 세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 배우세요 LIMAP 기법을 활용한 세포외 매트릭스 단백질의 광유도 분자 흡착으로 신경세포 축삭 성장 및 경로 탐색 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학에서 신경 손상 치료에 활용될 수 있습니다.

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이 작품은 BBSRC, EPSRC, MRC 및 웰컴 트러스트에 의해 지원됩니다. C.B. 실험실은 웰컴 트러스트 (보조금 번호 088785 / Z / 09 / Z)의 핵심 자금으로 지원되는 맨체스터 대학의 셀 매트릭스 연구를위한 웰컴 트러스트 센터의 일부입니다. 저자는 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC)가 C.M., K.J.(BB/M020630/1) 및 P.A.(BB/P000681/1)와 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC) 및 의료에 의해 제공된 자금을 인정하고자 합니다. 연구위원회 (MRC) A.K.에 재생 의학 박사 교육을위한 센터 (EP / L014904/1). 저자는 그들의 서신과 판매 후 지원 팀에 대한 Alvéole에게 감사드립니다. 저자는 현미경 검사법에 그들의 도움을 맨체스터 대학, 생물 이미징 시설에서 피터 월과 로저 메도우스 감사합니다. 이 연구결과에 사용된 생물이미징 시설 현미경은 BBSRC, 웰컴 트러스트 및 맨체스터 전략 기금 대학의 보조금으로 구입되었습니다.

저자는 공개 할 것이 없다.

LIMAP(PRIMO) 마이크로 패터닝 의 장점과 마이크로 접촉 인쇄와의 비교 마이크로접촉 인쇄는 아마도 생물학적분야에서가장 일반적으로 사용되는 마이크로 패터닝 기술이지만, LIMAP 기술40,41,42를 사용하는 연구자의 수가 증가하고 있는 것으로 보입니다. ,43,44. 여기서는 LIMAP용 상용 시스템인 PRIMO를 사용하는 프로토콜을 제시했습니다. 아래에서는 마이크로접촉 인쇄 및 LIMAP 사진 패터닝의 잠재적인 장점과 한계에 대해 간략하게 설명합니다.
마이크로 접촉 인쇄는 유리 또는 실리콘 웨이퍼에 포토 마스크 (일반적으로 SU-8)를 스핀 코팅하여 생산 된 석판 화 마스터를 필요로하며, 원하는 마이크로 특징으로 레이저 에칭됩니다. 이러한 마스터는 PDMS 스탬프45를만드는 템플릿으로 사용됩니다. 스탬프는 그것에 부속하는 선택된 단백질로 배양되고, 그 때 세포 배양 접시에 (스탬프) 옮겨질 것입니다. PDMS 스탬프에 단백질의 흡착 과정은 단백질 농도, 완충제 및 배양 시간에 의존한다. 이러한 매개 변수는 최적의 결과를 위해 사전에 테스트해야합니다 46.
마스터는 제대로 보존하는 경우, 개월 또는 년 동안 지속, 실험의 상당수에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 기술의 제한 요소는 원하는 모든 수정에 대해 새로운 석판 화 마스터를 다시 디자인할 필요성입니다. 실험 설계의 변경으로 인해 새로운 마스터(최대 몇 주)의 생산시간이 소요되므로 실험이 지연될 수 있습니다. 이에 비해 LIMAP 포토패킹에는 물리적 마스터가 필요하지 않습니다. 원하는 마이크로 패턴 의 형상을 변화하는 연구 질문에 유연하게 적응하는 데 사용할 수있는 소프트웨어 생성 패턴 템플릿을 사용합니다. LIMAP는 또한 마이크로접촉프린팅(47)을사용하여 재현성 방식으로 얻기 어려운 동일한 마이크로패턴(도 8)내에서 단백질 구배를 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, LIMAP로 달성된 마이크로 패턴 분해능은 2 μm(도6B)이다.
이 해상도에 접근하면 인트라-및 인터-패턴 가변성이 증가했습니다. 10 μm 너비 주위 또는 그 이상의 패턴을 생성하는 것은 매우 재현성이있었습니다(그림 6G,H). 반대로 마이크로 접촉 인쇄를 사용하면 10 μm 미만의 해상도를 일관되게 얻기가 어려우며 작은 피처(데이터가 표시되지 않음)를 스탬핑할 때 유물을 찾는 것이 일반적입니다.
우리는 LIMAP가 동일한 마이크로 웰 내에서 여러단백질을마이크로 패턴화하는 데 사용될 수 있음을 보여주었으며, 더 많은 수준의 복잡성을 실험에 추가할 수 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄를 통해 이를 달성할 수 있지만, 다른 단백질을 높은 정밀도로 정렬하는 것은 기술적으로 오히려 까다로울 수 있습니다. LIMAP를 사용하여 여러 단백질을 패터닝하는 것은 곧바로 앞으로 보이지만, 순차적 코팅 절차를 통해 단백질의 교차 결합은 시약을 차단하지만 완전히 제거되지는 않음을 통해 감소될 수 있다는 점을 언급하는 것이중요합니다(그림 9).
하나 또는 다른 기술의 비용에 관하여, 여기에 기술된 바와 같이 LIMAP는 상이한 형광 현미경에 설치될 수 있고 전동 단계를 필요로 하는 마이크로 패터닝 장비(PRIMO)의 구입을 요구한다. 이 투자는 처음에는 비용 집약적이지만 LIMAP와 관련된 장기적으로 소모품 (스텐실, PEG 및 PLPP) 이외의 추가 구매는 없습니다. 대안적으로, PDMS 스텐실은 또한 출판된 프로토콜18,32에따른 자체 실험자에 의해 실험실에서 생산될 수 있다. 마이크로 접촉 인쇄에 대한 가장 큰 비용은 새로운 마스터의 생산과 관련될 수 있으며, 실험에 새로운 패턴이 필요한 경우 상당한 규모가 될 수 있습니다.
LIMAP의 한 가지 단점은 이 기술의 처리량이 상대적으로 낮다는 것입니다. 마이크로 접촉 인쇄는 LIMAP를 사용하는 필요한 순차 레이저 마이크로 패터닝에 비해 동시 스탬핑 단계에서 많은 수의 마이크로 패턴을 빠르고 효율적으로 생성할 수 있습니다. 예를 들어, PDMS 스탬프(스탬프 준비 제외)를 이용한 마이크로접촉 인쇄를 통해 약 2시간 동안 6개의 스탬핑 유리 커버슬립을 생성할 수 있습니다. LIMAP와 유사한 영역(6-well 접시)을 패터닝하는 것은 표면 패시베이션의 절차를 제외하고 약 4시간이 걸릴 것이다(5.12단계에 설명된 패턴 템플릿 구성을 고려하고 도 5B참조).
LIMAP 기술의 또 다른 속도 제한 계수는 넓은 영역을 패터닝하는 데 필요한 긴 조명 시간입니다(설계 단위당 7.5mW/mm2 레이저가 있는 설계 단위당 30s). 이러한 경우 마이크로 접촉 인쇄가 선호되는 옵션일 수 있습니다. 새로 출시된 광 이니시에이터(PLPP 젤, 재료 표)는패터닝에 걸리는 시간을 상당히 단축하여 단 몇 분 만에 넓은 영역(최대 8mm2)에서수백 개의 마이크로 패턴을 생성할 수 있습니다.
세포 배양을 위한 마이크로 패터닝 표면이 마이크로 접촉 인쇄로 얻어진 가변성과 비교하여 상이한 실험 반복 들 사이에서 마이크로 패턴의 재현성일 때 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는. 예를 들어, 도 7B,D에 도시된 그래프는 매우 유사한 결과를 가진 3개의 독립적인 실험 반복의 대표적인 데이터이다(데이터는 도시되지 않음). 우리의 경험과 이전 간행물에 기초하여, 재현성의이 수준은 마이크로 접촉 인쇄48,49,50,51,52로달성하기 어렵다.
감광성 물질을 설계하기 위해 전용 화학을 필요로하는 다른 사진 패터닝 기술과는 달리 일반적으로 생체 적합성3,LIMAP (PLPP)의 감광 성 성분은 매우 생체 적합성이 아닌 광 감작제의 사용 )은 생체 적합성이며 세포(21)에의해 잘 용납된다; 우리의 손에 우리는 CAD, DRG 뉴런(그림 10),섬유 아세포, 상피 세포 및 흑색종 세포 (데이터가 표시되지 않음)를 포함하여 다양한 세포에 걸쳐 세포 독성을 경험하지 않았습니다. 다른 사진 패터닝 기법에 비해 PRIMO를 사용하는 LIMAP의 또 다른 장점은 포토마스크가 필요하지 않다는 것입니다. 마이크로 접촉 인쇄와 마찬가지로 새로운 포토마스크는 원하는 모든 패턴에 대해 설계및 생성되어야 합니다.
마이크로 접촉 인쇄에 대해 위에서 언급 한 모든 제한 사항은 기술의 수동 접근 방식을 참조하십시오. 그러나, 스탬프 하중 및 압력제어(53)를이용한 자동화된 장치를 사용하여 마이크로접촉 인쇄의 처리량 및 재현성을 향상시킬 수 있다.
PRIMO를 사용하여 LIMAP에 대한 프로토콜 및 문제 해결의 주요 단계 이 프로토콜 에서 발견되는 가장 일반적인 문제 중 하나는 마이크로 패턴 내에서 높은 수준의 배경 형광을 갖는 것입니다. 이것은 종종 작은 부피로 인해 발생하는 마이크로 웰의 건조때문일 수 있습니다. 이러한 현상이 발생하면, PBS 결정은 종종 ECM 패턴을 둘러싸고나타난다(그림 11A).
단백질 배양 후 불충분하거나 비효율적인 세척 단계는 또한 배경 형광의 상부귀착될 수 있습니다. 이는 특히 10 μg/mL 이상의 단백질 농도를 사용할 때 관찰될 수있다(그림 11B)이상. 배경에 있는 단백질의 과잉은 PBS를 가진 추가 세척 단계를 포함하여 감소될 수 있습니다.
단백질 배경의 존재를 측정하고 각 실험에서 특성화할 필요가 있으며, 배경 형광 강도를 계산하고(도6E)마이크로 패턴 강도에서 빼기(그림6F-H) 및 그림 7B,D). 높은 단백질 배경은 CAD 세포의 부착 및 발아에 영향을 미칠 수 있으며, 결과의 해석을 손상시다.
디자인 단위 간의 간격이 있는 것은 사용자가 패턴 간의 중복이 부족하여 발생하는경험(그림 11B)이제한되어 있는 일반적인 문제입니다. 레오나르도 소프트웨어의 두 파라미터는 이를 극복하기 위해 조정될 수 있다: 1) 패턴의 설계에 따라 컬럼 들 사이의 음의 간격이 필요할 수 있다(단계 5.7및 도 5B,C참조). 또는 2) 전문가 메뉴에서 그라데이션 옵션을 사용하여 열을 스티치합니다. 최적의 간격 파라미터를 결정하기 위한 신속한 시험은 UV 접착제(재료표)를사용하여 수행될 수 있다. 이 접착제의 작은 방울은 유리 슬라이드에 적용된 다음 유리 커버 슬립으로 덮여 필름을 만듭니다. 내장 된 UV 접착제는 낮은 레이저 용량 (30 mJ / mm2)을사용하여 관심있는 패턴 템플릿으로 포토 패턴화됩니다. 임베디드 접착제의 UV 노출 영역은 경화되어 밝은 필드 현미경 검사법으로 볼 수 있습니다. 테스트 결과는 패턴 내에서 얻은 간격을 평가하기 위해 시각화됩니다. 우리의 신경 실험에서, 줄무늬 사이의 간격은 세포 행동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다., 성장 역학에 변화를 생산 (감소 속도 또는 경로의 포기).
레오나르도 소프트웨어의 최신 업데이트 (출판 시, 레오나르도 4.11), 마이크로 웰 표면의 훨씬 더 큰 영역 (최대 8mm2 2를 사용 하 여) 커버 하는 이전에 설계 된 더 큰 패턴 템플릿을 업로드할 수 있습니다. 설계 단위당 현재 0.1mm2와 비교하여 더 작은 설계 유닛을 함께 스티치할 필요가 없습니다. 정의되지 않은 모서리는 패턴 생성 중에 레이저 초점 조정이 부족하여 발생할 수있습니다(그림 11C). 따라서 패터닝 전에 레이저를 교정하고 기준 패턴 단계(4단계 참조)를 수행하는 것이 중요합니다. 줄무늬가 잘못 정의되면 줄무늬 너비가 달라지므로 축축한 성장 역학과 줄무늬 너비 간의 상관 관계가 어려워지습니다. 축삭은 또한 가장자리가 분산된 줄무늬를 포기하는 경향이 있습니다. 또한 10-20 μm 너비 이상의 줄무늬를 인쇄할 때 가장자리의 가변성을 발견할 수 있으며, 그 결과 패턴의 중앙 영역에 비해 가장자리에서 단백질 함량이 높아질 수있습니다(그림 6B,D). 이 에지 효과는 포토 패터닝 프로세스 중에 광 개시자의 비균질 확산에 의해 생성됩니다. 광선화 반응은 산소에 의존하며 가장자리에서 더 많이 확산됩니다. 이러한 에지 효과는 포토패터닝 공정 중에 마이크로웰에 파이펫을 장착하여 광이니시에이터를 균질화하는 것을 최소화할 수 있다. 더욱이, 새로운 상용화 된 광 이니시에이터 (PLPP 젤), 또한 에지 효과 (PRIMO 시스템 지원 팀, 개인 통신)를 줄일 수 있습니다.
하나 이상의 단백질의 마이크로 프린팅은 교차 결합을 초래할 수있다(도 9A-D). 이는 두 개의 상이한 단백질에 대한 배양 단계 들 사이의 비특이적 결합 부위를 차지하는 데 사용되는 차단 효율을 증가시킴으로써 최소화될 수 있다. 단백질의 교차 결합은 실험 결과의 재현성을 교란시킬 수 있고, 축삭 성장 역학 및 그밖 세포 행동에 각 단백질의 기여를 결정하는 것이 어렵기 때문에, 데이터의 오해로 이끌어 낼 수 있습니다.
결론 우리는 LIMAP를 사용하여 제공된 프로토콜이 PRIMO 시스템의 사용을 통해 단백질 마이크로 패턴의 생성을 용이하게 하기를 희망한다. 우리의 프로토콜은 2D 유리 표면에서 마이크로 패턴을 안정적으로 생성하는 방법에 초점을 맞추고 있지만, 다른 프로토콜은 3D 배양체(42)의부드러운 기판(54)및 미세 구조화 표면의 마이크로 패터닝에 LIMAP를 사용할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 마이크로 패턴은 마이크로 환경의 변화에 대한 세포 반응을 연구하는 다목적 도구가 될 수 있습니다.

최근 몇 년 동안, 생물 과학은 점점 재료 과학에 의해 제공되는 발전을 사용했다. 한 가지 눈에 띄는 예는 세포 증식과 같은 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 기판의 마이크로 패터닝입니다.1,2차별화3,4,5,6, 셀 마이그레이션7,8,9및 경로 찾기10,11. 다광자 광화학과 같은 기판의 마이크로 패터닝을 가능하게 하는 여러 가지 기술이 있습니다.12, AFM 딥펜 나노리소그래피13, 핀 및 잉크젯 직접 인쇄14, 전자 빔 리소그래피15또는 미세 유체 학적16. 그러나, 생물학 분야에서 널리 사용되는 두 가지 기술은 마이크로 접촉 인쇄입니다.17,18,19또는 레이저 보조 패터닝3(그림 1). 레이저 보조 패터닝은 마이크로접촉 인쇄에 비해 패턴에 대한 단백질 및 PEG 안정성 및 세포 감금 측면에서 보다 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 간주됩니다.20. 여기에 설명된 마이크로 패터닝에 대한 보다 새로운 접근법은 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 사용입니다.21(LIMAP,그림 1 D) 상용 시스템(PRIMO,재료 표). 각 방법에는 아래에 간략하게 설명되어 있는 장점과 제한 사항이 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄는 석판 화 마스터에서 생성되는 원하는 마이크로 피처와 PDMS 금형 (스탬프)을 사용합니다. 우표는 선택한 단백질로 배양된 후 세포 배양 기판으로 옮겨(스탬프)18(그림 1 A.). 레이저 보조 패터닝은 UV 광을 사용하여 오염 방지 필름을 파쇄합니다.22,23,24,25관심 있는 단백질로 나중에 코팅될 수 있는 노출 영역(그림 1 B). 포토 패터닝 접근법으로 달성된 해상도는 미칸 범위에 있습니다.25,26, 이러한 기술의 대부분은 샘플과 접촉하거나 현미경 목표의 물체 평면에 위치하는 포토 마스크를 필요로합니다.23,27,28. 마이크로 접촉 인쇄 및 사진 패터닝 모두에서 마스크에 대한 요구 사항은 제한될 수 있습니다. 특정 마스크는 모든 기하학적 패턴과 크기에 필요하며, 생성하는 데 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 이러한 기술과 달리 LIMAP에는 마스크가 필요하지 않습니다(그림 1 D). LIMAP용 PRIMO 시스템을 사용하면 장비 구매가 필요하기 때문에 처음에는 비용이 많이 들 수 있습니다. 그러나 오픈 소스 소프트웨어는 원하는 형상의 패턴을 설계하는 데 사용되어 훨씬 더 많은 자유를 제공하고 단백질 농도 그라데이션사용을 포함하여 더 복잡한 실험을 허용합니다. PRIMO 레이저는 디지털 제어 마이크로미러 장치(DMD)에 의해 제어 및 지시되어 사용자 정의 형상의 수에 관계없이 패턴을 생성합니다. LIMAP는 배양 표면이 세포 부착을 방지하는 분자로 코팅되어야 합니다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 이러한 "반오홍" 시약으로서 가장 일반적으로 사용된다; 그것은 유리 또는 플라스틱 표면에 조밀 한 안티 접착제 필름을 형성29. 그 후, 광시전 메커니즘을 통해 PEG 필름을 고정밀로 제거할 수 있는 광이니시에이터가 추가되었습니다.30DMD의 제어 하에 자외선에 국소 노출됩니다. 이러한 PEG 프리 영역은 레이저 에칭 표면에 흡착되는 단백질로 코팅되어 마이크로 패턴을 생성할 수 있습니다. 레이저 파워를 변화시킴으로써 표면에서 다양한 양의 PEG를 제거하여 사용자가 단백질 그라데이션을 생성할 수 있습니다. PEG 제거 및 코팅 절차를 반복하여 동일한 마이크로 웰에서 두 개 이상의 뚜렷한 단백질로 패턴을 만들 수 있습니다.21. 생성된 마이크로 패턴은 세포에 대한 접착제 표면을 제공하여 세포 행동을 연구할 수 있도록 합니다. 우리의 연구에서, 우리는 신경 세포주 (CAD (Cathecholaminergic-분화) 세포의 neurite 또는 축색 경로 찾기를 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 사용합니다.31) 또는 1차 쥐 등-근근 신경절(DRG) 뉴런을 각각. 여기서는 LIMAP(에 대한 단계별 프로토콜)에 대해 간략하게 설명합니다.그림 2) 상용 PRIMO 시스템 및 레오나르도 소프트웨어를 함께 사용합니다. 우리는 우리가 축색 경로 찾기를 연구하는 데 사용하는 정의 된 기하학 및 여러 단백질패턴의 생성을 위해 사용될 수있는 방법을 보여줍니다. 발생할 수 있는 일반적인 문제와 이러한 문제를 피할 수 있는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa 488 단백질 라벨링 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A10235</td><td>작업 농도 : N.A.</td></tr><tr><td>Alexa 647 단백질 라벨링 키트</td><td>Invitrogen</td><td>A20173</td><td>작업 농도 : N.A.</td></tr><tr><td>CAD 셀</td><td>ECACC</td><td>8100805</td><td>작업 농도: N.A.</td></tr><tr><td>공액 피브리노겐-488</td><td>분자 프로브</td><td>F13191</td><td>작동 농도: 10 & g/ml</td></tr><tr><td>DMEM 배양 배지</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>작업 농도: N.A.</td></tr><tr><td>에피 형광 현미경 **</td> <td>Nikon</td><td>Eclipse Ti 반전</td><td>작업 농도 : N.A.</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma</td><td>F4759</td><td>작업 농도: 10 & g/ml (Alexa 488 단백질 라벨링 키트로 라벨링한 후 위 참조) (PBS로 희석)</td></tr><tr><td>Fiji-Image J</td><td><a href="http://www.imagej.nih.gov" target="_blank">www.imagej.nih.gov</a></td><td>Version 2.0.0-rc-54/1.51f</td><td>작업 농도: N.A.</td></tr><tr><td>형광 형광펜</td><td>Stabilo Stabilo</td><td>Boss Original</td><td>작업 농도 : N.A.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>작업 농도 : 1M</td></tr><tr><td>Inkscape 소프트웨어</td><td>Inkscape</td><td>마지막 업데이트 확인</td><td>작업 농도 : NA</td></tr><tr><td>라미닌 레드 형광 로다민</td><td>세포골격, Inc.</td><td>LMN01</td><td>작업 농도 : 10 & g/ml (PBS에서 희석)</td></tr><tr><td>Leonardo 소프트웨어</td><td>Alv&eacute; OLE</td><td>버전 4.11</td><td>작업 집중도: N.A.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>작업 농도: 1%</td></tr><tr><td>마이크로 매니저 소프트웨어</td><td>오픈 이미징</td><td>마지막 업데이트 확인</td><td>작업 농도: N.A.</td></tr><tr><td>자동화된 x/y 단계</td><td>이전 과학적인</td><td>Proscan II</td><td>작동 농도: N.A.</td></tr><tr><td>NIS 요소 소프트웨어</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR 4.60.00 64비트(Nikon 작업 포함)</td><td>작업 농도: N.A.</td></tr><tr><td>PBS (without Ca2+, Mg2+)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>작업 농도: 1X</td></tr><tr><td>PDMS 스텐실</td><td>Alv&eacute; ole</td><td>방문 <a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td><td>작업 집중: N.A.</td></tr><tr><td>PEG-SVA</td><td>레이산 바이오, Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>작동 농도: 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Phalloidin 405</td><td>Abcam</td><td>ab176752</td><td>작동 농도: 1:1000</td></tr><tr><td>광개시제(PLPP)</td><td>Alv&eacute; ole</td><td>Classic PLPP</td><td>작업 농도 : 14.5 mg / ml</td></tr><tr><td>광개시제 (PLPP gel)</td> <td>Alv&eacute; 올레</td><td>PLPP 젤</td> 작업 농도: 에탄올 플라즈마 세정제 Harrick Plasma PDC-32G (115V)<td>에 희석 4.76%</td></tr><tr><td></td><td></td><td>| PDC-32G-2 (230V)</td><td>작업 농도 : NA</td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS (Alv&eacute에서도 배포; ole)</td><td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td><td>작업 농도: 0.1 mg/ml (PBS에서 희석)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td><a href="https://www.sigmaaldrich.com/ProductLookup.html? 제품번호=P4707& 브랜드=SIGMA">P4707</a></td><td>작업 농도: 0.01%</td></tr><tr><td>Primo equipment</td><td>Alv&eacute; ole</td><td><a href="http://www.alveolelab.com" target="_blank">www.alveolelab.com</a></td><td>작업 집중도: N.A.</td></tr><tr><td>Pen / Strep</td><td>Thermo Fisher</td> <td><a href = "https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122">15140122< / a ></td> <td>작업 농도 : 1 %</td></tr> <tr><td>Tubulin 안티 알파 항체</td><td>Abcam</td><td>DM1A</td><td>작업 농도 : 1 : 1000 CAD 세포</td></tr><tr><td>Tubulin 안티 베타 3 항체</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td>작동 농도 : 1 : 500 DRG 뉴런</td></tr><tr><td>UV 접착제</td><td>Norland 제품</td><td>NOA81</td><td>작업 농도 : N.A.</td></tr><tr><td>1 웰 유리 바닥 접시</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>작업 농도 : NA</td></tr><tr><td>6 웰 유리 바닥 접시</td><td>Cellvis</td><td>P06-20-1.5-N</td><td>작업 농도 : NA</td></tr><tr><td>20x 대물렌즈**</td><td>Nikon</td><td>no phase ring (업데이트된 카탈로그 확인)</td><td>작업 농도: N.A. **에피형광 현미경: PRIMO 마이크로 패터닝 장비(Alv&eacute; ole)을 사용하여 20x 대물렌즈(0.75 S Plan Fluor(nophasering, Nikon)를 사용합니다. GFP, mCherry 및 Cy5에 대한 Nikon 전용 필터 세트가 사용되었으며 형광 광원은 LED(Lumencor)였지만 다른 형광 소스 및 필터 세트를 사용할 수 있습니다. 현미경에는 다중 필드 패터닝의 인쇄를 위한 자동화된 x/y 스테이지(PRIOR Scientific)와 초점 드리프트를 방지하기 위한 Nikon Perfect Focus가 있습니다. 이미지는 Retiga R6(Q-Imaging) 카메라를 사용하여 수집되었습니다.</td></tr></tbody></table>

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 primo 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

세포는 세포 자체에 의해 합성되고 리모델링되는 세포 외 매트릭스의 조성 및 기하학을 포함하여 다양한 세포 외 단서를 감지합니다. 여기서, 우리는 단백질의 단일 또는 조합을 사용하여 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 (ECM) 기판을 생산하는 패터닝 기술로 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질 (LIMAP)의 빛 유도 분자 흡착의 방법을 제시한다. 이 방법을 사용하면 뛰어난 재현성으로 미크로넨 해상도로 ECM 패턴을 인쇄할 수 있습니다. 우리는 단계별 프로토콜을 제공하고 이것이 신경 경로 찾기의 과정을 연구하기 위해 어떻게 적용될 수 있는지 보여줍니다. LIMAP는 두 개 이상의 구성 요소를 패터닝하는 용이성과 형상 또는 그라데이션을 사용하여 패턴을 생성하는 기능 측면에서 기존 마이크로 프린팅 방법에 비해 상당한 이점이 있습니다. 프로토콜은 세포 운명 및 세포 행동으로 거의 모든 화학 성분의 기여를 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다. 마지막으로, 발생할 수 있는 일반적인 문제와 이러한 문제를 피할 수 있는 방법에 대해 논의합니다.

우리의 전반적인 목표는 세포가 지시된 축색 성장으로 이끌어 내는 세포외 단서를 어떻게 감지하는지 이해하는 것입니다. 여기에서는 축세포 자성장 및 경로 찾기를 제어하는 특정 이벤트를 연구하기 위해 세포 외 매트릭스 구성 요소의 정의된 마이크로 패턴을 생성하는 데 사용되는 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 방법론을 설명합니다.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

마이크로 패터닝은 세포가 살아있는 유기체에서 만나는 생화학적 및 생물리신호를 정의하기 위해 세포 반응을 연구할 수 있기 때문에 매우 강력한 도구입니다. 다른 방법과 달리, 설명된 것은 패턴 생성을 위해 더 유연하다. 예를 들어, 그것은 높은 재현성을 가진 다중 단백질의 그라데이션 및 마이크로 패턴의 생산을 허용합니다.우리 그룹은 LIMAP를 사용하여 신경 병리학을 연구할 뿐만 아니라 다른 세포가 세포 증식, 분화 및 마이그레이션에 영향을 미치는 신호에 어떻게 반응하는지연구합니다. 마이크로 패터닝은 세포 생물학의 근본적인 질문에 대답하는 데 사용됩니다. 얻은 지식은 재생 의학에서 기존 장치를 수정하는 데 사용할 수 있습니다, 예를 들어, 말초 신경 부상 후 신경 수리.디지털 드로잉 소프트웨어에서 패터닝을 위한 템플릿을 디자인하는 것으로 시작합니다. 길이 1, 824픽셀, 너비 1, 140픽셀의 이미지 크기를 선택합니다. 템플릿을 디자인하고 템플릿을 8비트 TIFF 파일로 저장합니다.패터닝 전에 1, 000 ~ 1, 300 밀리토르 및 1 ~ 5 분 동안 29.6 와트의 전력을 사용하여 플라즈마 클리너로 표면을 청소하고 활성화하십시오. 20mm 이너 웰 사이즈와 유리 두께0.16 ~0.19밀리미터의 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 테스트 중인 조건의 수에 따라 6웰 또는 단일 웰 요리를 선택합니다.멸균 조건에서 PDMS 스텐실을 잘라 내부 유리 바닥에 잘 맞도록 합니다. 멸균 집게로 내부 마이크로웰 충전재를 제거하고 스텐실을 유리에 잘 붙입니다. PBS에서 밀리리터 당 0.1밀리그램 PLL-PEG 솔루션을 준비하고 각 마이크로웰에 20마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 실온에서 1 시간 동안 접시를 배양하십시오. 인큐베이션 후, PLL-PEG의 마이크로리터 15개를 각 웰에서 제거하고, 건조시키지 않고 PBS 20 마이크로리터로 5회 세척합니다. 하나의 우물에서 PBS의 18 마이크로리터를 제거하고 5 개의 광시니티에이터를 추가하여 나머지 마이크로웰에 PBS를 남겨 서 기준 패턴을 만들기 위해 하나의 마이크로웰을 준비합니다.그런 다음 형광형광을 사용하여 빈 내부 유리를 잘 표시합니다. 목표 보다 잘 배치하고 PRIMO 로고와 태그라인이 셀을 돌볼 때까지 목표 초점을 조정합니다." 그런 다음 초점 평면의 Z 위치를 기록합니다.참조 패턴을 만들려면 카메라를 통해 전송된 빛을 사용하여 광합성기로 마이크로웰의 가장자리를 시각화하고 오른쪽 메뉴에서 ROI 기호를 선택합니다. 설계 단위로 ROI에 투영될 원하는 패턴 템플릿을 업로드하려면 PRIMO를 선택합니다. 마이크로웰의 주변 영역으로 이동하여 잠금을 선택하고 교정의 Z 위치에 초점을 조정합니다.그런 다음 레퍼런스 패턴을 포토패닝하기 시작하려면 재생을 선택합니다. 기준 패턴을 PBS 20 마이크로리터로 3회 세척하여 광신염을 제거합니다. 그런 다음 형광으로 표지된 세포외 매트릭스 또는 ECM, 단백질 용액20 마이크로리터를 추가합니다.10~20분 동안 실온에서 접시를 배양하여 빛으로부터 참조를 잘 보호하십시오. 인큐베이션 후 18마이크로리터의 단백질 용액을 제거하고 PBS 20마이크로리터로 3회 세척합니다. 상피 현미경을 사용하여 참조 패턴을 시각화합니다.카메라 경로를 통해 패턴 모서리에 초점을 조정하고 최상의 초점에 따라 Z 위치를 기록합니다. 이 위치는 후속 패터닝에 사용되는 최적의 레이저 초점이 될 것입니다. 멸균 조건하에서 모든 마이크로웰에서 18마이크로리터의 PBS를 제거하십시오.각 웰에 5개의 마이크로리터를 추가하고 위아래로 파이프를 사용하여 균질화합니다. 동일한 마이크로웰에 여러 단백질을 패킹하는 경우 원하는 패턴 템플릿의 모든 세트를 동시에 업로드합니다. 그런 다음 행, 열 및 용량 수를 선택합니다.템플릿 구성을 소프트웨어에 파일로 저장합니다. 참조 패턴이 생성된 영역으로 이동하여 최적의 Z 위치로 초점을 조정합니다. 그런 다음 재생을 선택하여 포토패팅을 시작합니다.포토패싱이 완료되면 디자인 단위가 빨간색에서 파란색으로 바뀝니다. PBS의 20 마이크로 리터로 세 번 세척하여 마이크로웰에서 광신료를 제거합니다. 마지막 세척 후 각 마이크로웰에서 18마이크로리터의 PBS를 제거하고 20마이크로리터의 ECM 단백질 용액을 추가합니다.20~30분 동안 실온에서 접시를 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 다음으로, ECM 단백질 용액의 15 마이크로리터를 제거하고 PBS 20 마이크로리터를 사용하여 마이크로웰을 세 번 세척합니다. 교차 결합을 방지하기 위해 20 마이크로리터(PLL-PEG) 또는 BSA를 마이크로웰에 추가하고 어둠 속에서 실온에서 접시를 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 차단제의 마이크로리터 15를 제거하고 PBS 20 마이크로리터로 모든 마이크로웰을 세 번 세척합니다. PBS의 18 마이크로리터를 제거하고 각 마이크로웰에 광리니티에이터 5 마이크로리터를 추가하여 마이크로웰의 전체 표면에 균일한 광신염을 보장합니다. 첫 번째 마이크로웰로 이동하여 이전에 저장한 템플릿 구성을 로드합니다.그런 다음 두 번째 포토패팅에 대해 패턴화할 작업을 선택하여 첫 번째 라운드에서 작업을 선택 해제합니다. 포토패싱 후 PBS로 세척하여 PLPP를 제거하십시오. 그런 다음, 제2 ECM 단백질 용액으로 20 분 동안 배양하고 PBS의 20 마이크로 리터로 마이크로웰을 세 번 세척합니다.인쇄된 패턴을 시각화하고 이미지화하기 위해 피형성 현미경을 사용합니다. 세포를 플레이트할 준비가 되면, 모든 마이크로웰을 커버해야 하는 내유리에 세포가 있는 1밀리리터의 매체를 잘 추가합니다. 그리고 문화 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓습니다.생성된 패턴이 템플릿을 정확하게 표현하도록 하기 위해 형광 강도 측정은 줄무늬를 따라, 각 스트라이프 위의 해당 배경 영역에서 얻어집니다. 재현 가능한 정의 된 마이크로 패턴은 폭 20에서 2 마이크로 미터에 이르기까지 달성되지만 인쇄 가 20 마이크로 미터 또는 더 넓은 기능을 인쇄 할 때 에지 효과를 관찰 할 수 있습니다. 정의된 단백질 농도는 다양한 단백질 농도로 배양하거나 항응고 필름을 크리브하는 데 사용되는 레이저 용량을 변화시킴으로써 얻어진다.레이저 강도는 템플릿의 그레이스케일 레벨에 비례하여 UV 조명의 그라데이션을 생성합니다. 그라데이션 스트라이프를 따라 형광 강도 프로파일을 측정하고 패턴 템플릿및 생성된 그라데이션 패턴에서 선형입니다. 이 프로토콜은 동일한 마이크로웰에 여러 단백질을 가진 마이크로 패턴을 만드는 데 사용할 수 있습니다, 이러한 섬유 네틴의 가로 줄무늬와 교차 패턴, 라미닌의 수직 줄무늬.그러나 단백질의 교차 결합을 방지하기 위해 차단 단계가 필요합니다. 생성된 교차 패턴은 뉴런 세포주, 또는 CAD 세포, 또는 1차 뉴런, 쥐 DRG를 이용한 세포 검사에 나중에 사용될 수 있다. 이 프로토콜을 수행할 때 기억해야 할 가장 중요한 측면은 적절한 시스템 교정을 수행하고, 여러 세척 단계에서 마이크로웰이 건조시키지 않고, 단백질 인큐베이션 및 차단에 적합한 매개 변수를 사용하는 것입니다.세포 행동의 분석은 전형적으로 형광, 시간 경과, AFM과 같은 현미경 검사를 관련시킵니다. 추가 특성화는 유전자 발현 프로파일링과 같은 다른 생화학적 방법을 포함할 수 있다.

light-induced-molecular-adsorption-proteins-using-primo-system-for

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Microcontact 인쇄는 소재 표면에 패턴 단백질 및 다른 분자로 광범위하게 사용됩니다. 우리는 유리에 fibronectin의 패턴을 스탬핑,이 과정의 기본 단계를 보여줍니다.

세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄

이 비디오는 마이크로 패턴 표면의 사용에 의해 단백질 단백질 상호 작용의 후속 분석 실험을 보여줍니다. 접근 방식은 살아있는 세포의 단백질 상호 작용을 감지하는 가능성을 제공하며 양적 정보를 추출 가능성이 높은 처리 기능을 결합한 제품입니다.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

감지 재료의 설계 및 생산을 크게 단순화하고 eT가 액체 샘플에 대한 연속적인 진화 프로필과 풍경을 생성할 수 있도록 하는 eT(electronic tongue)의 구성에 대한 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 얻어진 eT는 변별과 같은 일반적인 단백질 분석에 효율적입니다.

단백질 분석을위한 지속적인 인식 패턴을 생성하는 전자 혀

간 셀룰러 통신은 내부와 세포 외부의 각종 생리 활성 조절에 중요​​하다. 이 논문은 단일 세포 분비물의 시공간적 특성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이를 달성하기 위해, 종합 접근법 생균 이미징 감지 라벨없는 nanoplasmonic을 통합하는 데 사용된다.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

여기에서는 인공 지질막에서 높은 시공간 정밀도로 광 조절 및 가역성 단백질 패턴을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 청색광 아래에서 파트너 단백질 Nano(야생형 SspB)에 결합하는 모델 멤브레인에 고정된 단백질 iLID(Improved Light-Inducible Dimer)의 국부적인 광활성화로 구성됩니다.

모델 멤브레인에서의 Dynamic light-induced protein pattern

배우세요 LIMAP 기법을 활용한 세포외 매트릭스 단백질의 광유도 분자 흡착으로 신경세포 축삭 성장 및 경로 탐색 메커니즘을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 재생의학에서 신경 손상 치료에 활용될 수 있습니다.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

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