Name: 배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 배우세요 배아 줄기 세포에서 GM-CSF를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포를 격리하는 방법을. 초고속 원심분리와 젤라틴 코팅 배양을 통해 고품질 면역 조절 소포를 생산할 수 있습니다.

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우리는 전송 전자 현미경 이미지를 획득하기 위한 Arkadiusz Slusarczyk 및 켄터키 생물 의학 연구 인프라 네트워크 (KBRIN, P20GM103436)에 감사드립니다. 이 작품은 NIH AA018016-01 (J.W.E.), 켄터키 연구 챌린지 트러스트 펀드 (J.W.E.), NIH CA106599 및 CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), 무료 호흡 연구 (K.Y.)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. ES-D3 세포 배양
<ol><li>외성 없는 태아 소 혈청(FBS)을 생성하려면 FBS를 4°C에서 16시간 동안 100,000 x g의 초원심분리기 및 원심분리기로 로드합니다. 원심분리에 따라, 뮤린 ESC 세포주 ES-D3를 배양하고 엑소좀 농축 된 전기를 획득하기 위한 외성 없는 FBS로서 혈청 상피물을 수집합니다.</li>
	<li>ES-D3 세포를 도금하기 전에 실온에서 젤라틴(0.1%)을 사용하여 15cm 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅합니다.</li>
	<li>이전에 설명된프로토콜(16)에이어, 젤라틴 코팅 15cm 조직 배양식에서 피더 층 세포없이 ES-D3 세포를 배양한다. ES-D3 세포 배양 배지는 DMEM으로 구성되며, 엑소좀 없는 FBS(15%), 비필수 아미노산(0.1mM), L-글루타민(2mM), β-메르카토에탄올(0.1mMM), 페니실린(50단위/mL), 연쇄상구(50μg/mL), 백혈병 억제제 인자(LIF; 10000mL) 배양 ES-D3 세포는 37°C에서 5%CO2 가습인 인큐베이터에서.</li>
	<li>ES-D3 세포가 15cm 조직 배양 접시에 약 90%의 합류에 도달하면 포부로 배지를 제거합니다. 트립신 (5 mL; 0.05 %)을 사용하여 세포를 세척합니다. 접시에 트립신 (5 mL)을 추가하고 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 요리에서 세포를 수집합니다.</li>
	<li>수집된 세포에 신선한 배양 배지(5mL)를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 신선한 배지에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포 수를 결정합니다.</li>
	<li>월세 세포의 경우, ES-D3 세포(5 x106)를젤라틴 코팅(0.1%) 15cm 조직 배양 접시에 신선한 배지(15mL) 및 배양으로 플레이트하여 세포를 세분화하기 전에 3일간 한다.</li>
	<li>외음이 농축된 전기자동차의 분리를 위한 세포 배양 상체를 수집하기 위해, ES-D3 세포(1 x 107)를젤라틴 코팅(0.1%) 15cm 조직 배양 접시에 신선한 배지(15mL)로 플레이트하여 세포 배양 상류체를 수집하기 전에 3일간 한다.</li>
</ol>2. GM-CSF 발현 플라스미드 세대
참고: ES-D3 세포에서 GM-CSF를 과발하게 하기 위해 트랜스포마이트 플라스미드 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 생성한다. 본 플라스미드에서, 마커 단백질과 함께 뮤린 GM-CSF cDNA의 발현은 인간 폴리펩티드 사슬 연신인1α(EF1α) 프로모터17,18에의해 구동된다.
<ol><li>벡터 백본을 생성합니다.<ol>
<li>2시간 동안 37°C에서 37°C에서 제한 효소 EcoRI(100단위)를 이용하여 플라스미드 pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP(DNA의 20μg)를 소화하여 벡터 백본(6.0kb) 및 FD3ER 인서트(2.5kb)를 생성한다.</li>
		<li>소화된 플라스미드 DNA(10μg)를 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기고 알칼리성 인산염(20대)으로 1시간 동안 37°C로 치료한다. 아가로즈 젤 전기포진(2%)을 사용하여 치료되지 않은 DNA와 탈포증 DNA를 모두 해결합니다.</li>
		<li>DNA 겔 추출 키트를 사용하여 벡터 백본 DNA 단편(6.0 kb)을 정화한다. 처리되지 않은 벡터 백본은 빈 벡터(pEF1α-IRES-hrGFP)로 작용하지만, 탈포량 벡터 백본은 GM-CSF-발현 플라스미드(pEF1α-mGM-CSRES-HrGFP)를 생성하는 데 사용될 것이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GM-CSF cDNA 인서트를 생성합니다.<ol>
<li>플라스미드 pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19(20 μg)를 사용하여 37°C에서 37°C에서 2시간 동안 2개의 DNA 단편을 생성한다: 벡터 백본(6.5 kb) 및 뮤린 GM-CSF cDNA 삽입물(474bp).</li>
		<li>아가로즈 젤 전기포진(2%)을 통해 소화된 DNA를 해결한다. DNA 젤 추출 키트를 사용하여 뮤린 GM-CSF cDNA 단편(474bp)을 정화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>발현 플라스미드를 생성합니다.<ol>
<li>DNA 결찰 키트를 사용하여 2개의 결찰 반응(10 μL 총 부피)를 설정합니다.<ol>
<li>빈 벡터 pEF1α-IRES-hrGFP를 생성하려면, 처리되지 않은 벡터 백본을 단계 2.1.3(6.0 kb; 500 ng)에서 리게이트한다.</li>
			<li>pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 생성하기 위해, 다음 DNA 단편을 리게이트: (1) 단계 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) 및 (2) mGM-CSF cDNA 단편은 단계 2.2.2(474bp; 200 ng)에서 생성된 mGM-CSF cDNA 단편으로부터 의 경우</li>
		</ol>
</li>
		<li>5 분 동안 25 °C에서 리게이트. 결찰된 DNA를 DH5α 유능한 대장균 세포로 변환합니다. 카베니실린(50 μg/mL)을 함유한 LB-agar 플레이트에 변형된 대장균 세포를 플레이트.</li>
		<li>DNA 격리 키트를 사용하여 단일 대장균 콜로니에서 플라스미드를 정화합니다. DNA 시퀀싱에 의해 플라스미드의 정체성을 검증합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포의 생성
참고: PLAsmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP를 통해 ES-D3 세포를 트랜스펙트하여 GM-CS를 과발성한다. 코트랜스펙트는 안정적으로 전염된세포(18,20)의선택을 용이하게 하기 위해 ES-D3 세포로 플라스미드 pBabe-Neo를 한다.
<ol><li>플라스미드를 ES-D3 세포로 전환합니다.<ol>
<li>ES-D3 세포(1.4 x106)를젤라틴 코팅(0.1%) 10cm 조직 배양 접시에 배양 배지(10mL)로 플레이트한다. 배양은 24h에 대한 37°C에서 ES-D3 세포를 도금하였다.</li>
		<li>1.5mL 마이크로센트심분리기 튜브에 2개의 플라스미드 혼합물을 준비: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, 벡터 제어) pBabe-Neo (4 μg) 및 (2) pEF1α-mGM-IRES-hrGFP (28 μg, 익스프레스 GM-CSF).. 제조업체의 프로토콜에 따라 트랜스페트 키트를 사용하여 트랜스페트를 수행합니다.</li>
		<li>플라스미드 혼합물을 함유한 각 튜브에 경질 배지(1mL) 및 형질 계약 시약(64 μL)을 넣고 실온에서 5분 동안 배양한다.</li>
		<li>ES-D3 세포의 각각 10cm 접시에 경피 혼합물을 추가합니다. 5 시간 동안 37 °C에서 인큐베이션하십시오.</li>
		<li>10cm 의 접시에 중간을 신선한 배양 매체 (10 mL)로 교체하십시오. 24 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>안정적으로 전감염된 ES-D3 세포의 대량 집단을 생성합니다.<ol>
<li>감염된 ES-D3 세포에서 배지를 제거합니다. 트립신 (2 mL; 0.05 %)으로 세포를 씻으십시오. 트립신 (2 mL)을 추가하고 5 분 동안 37 °C에서 배양하십시오. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 트립신을 중화하기 위해 신선한 배양 배지 2mL를 추가한다. 390 x g의 원심분리기는 5분 동안.</li>
		<li>신선한 배양 배지(10mL)에서 감염된 세포를 다시 중단한다. 제조업체의 프로토콜에 따라 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 사용하여 감염된 ES-D3 세포에서 GFP의 형광 강도를 평가합니다.</li>
		<li>감염된 세포를 신선한 배양 배지(10mL)를 함유한 2개의 10cm 요리로 옮는다. 비감염 된 세포를 제거 하는 네오 마이신 (0.5 mg/mL)를 추가 합니다.</li>
		<li>네오마이신을 함유하는 배양 배지에서 감염된 세포를 계속 배양한다(0.5 mg/mL). 감염된 ES-D3가 90%의 합류에 도달하면 세포를 15cm 조직 배양 접시로 다시 옮기. 2 주 동안 절차를 반복하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>안정적으로 전감염된 ES-D3 세포의 클론을 생성합니다.<ol>
<li>안정적으로 감염된 ES-D3 세포의 대량 인구가 생성되면 이전과 같이 세포를 수집하십시오. 혈종계를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 신선한 배양 배지에서 세포(1 x 107 세포/mL)를 다시 중단합니다.</li>
		<li>멸균 40 μm 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 사용하여 GFP 양성 ES-D3 세포를 정화합니다.</li>
		<li>단일 정렬 ES-D3 세포를 신미신 프리 배지(200 μL)에서 부모 ES-D3 세포(1 x103)를포함하는 젤라틴 코팅(0.1%) 96웰 조직 배양 판의 1웰에 플레이트. 감염된 ES-D3 세포를 감염되지 않은 부모 대응과 공동 배양하면 확실하게 감염된 단일 ES-D3 세포가 단일 클론으로 생존하고 증식되도록 합니다.</li>
		<li>세포를 48h에 배양한 다음, 네오마이신(0.5 mg/mL)을 96웰 플레이트에 추가하여 감염되지 않은 부모 ES-D3 세포를 제거한다.</li>
		<li>1주일 동안 네오마이신(0.5 mg/mL)을 함유한 배지를 가진 96웰 조직 배양 판에서 GFP 양성 ES-D3 세포를 계속 배양한다. 1주일 동안 네오마이신(0.5 mg/mL)을 함유한 배양 배지(5mL)를 함유한 6cm 조직 배양식에 클로날 ES-D3 세포주를 전달한다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 FACS를 사용하여 각 전자 감염된 ES-D3 세포 클론에서 GFP 형광의 강도를 결정합니다. GM-CSF 또는 높은 수준의 녹색 형광을 가진 빈 벡터를 표현하는 ES-D3 클론을 선택합니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 뮤린 GM-CSF ELISA 키트를 사용하여 ES-D3 세포에 의해 분비된 GM-CSF의 양을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 외성 농축 세포 외 소포의 격리
<ol><li>ES-D3 세포(1 x 107)를15cm 조직 배양 배양식에서 37°C에서 72h로 배양한다. 세포 배양 상체를 수집합니다. 외경 무결성을 유지하기 위해 최대 1 주일까지 4 °C에서 상체 수집 된 상점.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 60분 동안 5,000 x g에서 세포 배양 상피물을 퇴적시키기 위해 원심분리기를 사용하여 큰 세포 단편을 퇴적시한다.</li>
	<li>초원심분리기를 사용하여 4°C에서 90분 동안 100,000 x g에서 상피 및 원심분리기를 수집합니다.</li>
	<li>상부체를 제거합니다. 잔류 배양 상류체를 제거하기 위해 인산염 완충식식염수(PBS; 1 mL)로 각 펠릿을 두 번 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>PBS에서 각 펠릿을 다시 중단합니다. 그들의 단백질 함량에 의해 엑소좀 농축 된 전기를 정량화5.<ol>
<li>비신천산(BCA) 분석으로 외식이 풍부한 전기자동차의 단백질 농도를 측정합니다. ES-D3 세포로부터의 외성 농축 전기자동차의 예상 수율은 세포 배양 상류제의 약 4μg 단백질/mL이다. PBS에서 외성 농축 된 전기를 다시 중단합니다 (단백질 농도 : ~ 6 μg / μL). 엑소좀 농축 된 전기 를 -80 °C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 전염 전자 현미경 검사법에 의한 외형 농축 세포 소포의 특성화
참고: 투과 전자 현미경(TEM)5를이용하여 ESC로부터 분리된 외종 농축 전기자동차의 조성 및 구조를 조사한다.
<ol><li>2 시간 동안 실온에서 2 % EM 등급 파라 포름알데히드의 최종 농도로 엑소솜 농축 전기 자동차 (3-5 μg /μL)를 수정합니다.</li>
	<li>탄소 지원 필름을 사용하여 고정 시료(10μL)를 구리 그리드에 적재합니다. 샘플을 구리 그리드로 1분 동안 배양한 다음 필터 용지로 그리드를 배출합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 염색 솔루션으로 그리드를 얼룩지게 합니다.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 그리드를 필터 용지로 전송합니다. 전력망이 실온에서 하룻밤 사이에 건조되도록 합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 전송 전자 현미경(50,000배감)을 사용하여 전자 현미경 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>6. 서쪽 얼룩 분석에 의한 외성 농축 세포 외 소포의 평가
<ol><li>전체 셀 추출물을 준비합니다.<ol>
<li>15cm 접시에서 배양된 ES-D3 세포에서 배지를 제거합니다. 트립신 (5 mL; 0.05 %)으로 세포를 씻으십시오. 세포에 트립신(5mL)을 추가합니다. 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 수집하고 트립신을 중화하기 위해 신선한 배양 배지 (5 mL)를 추가합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. PBS에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>혈전계를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 세포를 390 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리합니다. 0.5% SDS(5,000셀/μL)를 포함하는 SDS-PAGE 로딩 버퍼에서 셀을 다시 일시 중지합니다.</li>
		<li>10% 진폭이 있는 초음파 처리기(wattage: 500W; 초음파 주파수: 20kHz)를 사용하여 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>엑소좀 농축 된 EV의 용하를 준비합니다.<ol>
<li>1.2 μg/μL 의 농도에서 0.5% SDS를 포함하는 SDS-PAGE 적재 버퍼에서 엑소솜 농축 된 전기를 다시 중단합니다.</li>
		<li>10% 진폭이 있는 초음파 처리기(wattage: 500W; 초음파 주파수: 20kHz)를 사용하여 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>서양 얼룩에 의해 단백질을 감지합니다.<ol>
<li>전세포 추출물(10μL; 5,000세포/μL) 및 외성 농축 EV 용액(10μL; 1.2 μg/μL)을 비스 트리스 PAGE 젤(4-20%)의 각 웰에 적재한다. 폴리 비닐리덴 불소 (PVDF) 막에 단백질을 전달합니다.</li>
		<li>적절한 1 차 및 이차 항체를 가진 막을 배양합니다. PBS, Tween-20 (0.2%), 비지방 건조 우유 (10 % w /v)를 포함하는 블로팅 버퍼에서 항체 (아래 표시된 농도)를 희석하십시오.<ol>
<li>다음 1차 항체사용: 항-부속서 V(200 ng/mL), 안티 CD81(50 ng/mL), 항 플로틸린-1(200 ng/mL), 항시토크롬 c(100) ng/mL), 항 단백질 이황화이소머라이저(200 ng/mL), 안티 GAPDH(33 ng/mL), 및 항옥스포스 COX IV-서브유닛 IV(600 ng/mL).</li>
			<li>다음과 같은 이차 항체를 사용하십시오: peroxidase-접주 염소 안티래빗 IgG (20 ng/mL) 및 peroxidase-접합 염소 안티 마우스 IgG (20 ng/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>향상된 화학 발광 검출 키트를 사용하여 단백질을 감지합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. ELISA에 의해 엑소좀 농축 세포 소포에서 GM-CSF 농도 결정
참고: ELISA가 엑소좀 농축 전기자동차에서 GM-CSF의 양을 평가하는데, 이는 일부 수정으로 제조업체의 프로토콜에 따라 뮤린 GM-CSF용 키트를 사용하여 사용한다.
<ol><li>ELISA 플레이트를 포획 항체로 코팅합니다. PBS단독으로 또는 PBS +0.05% Tween-20(100 μL)에서 30분 동안 외성 농축 전기자동차(0.6 μg)를 치료한다. 코팅 된 ELISA 플레이트에 처리 된 샘플을 추가하고 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오.</li>
	<li>샘플에 검출 항체를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오. 샘플에 아비딘 HRP를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오. PBS 단독으로 또는 PBS + 0.05 % Tween-20으로 접시를 씻으십시오.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기에서 450nm에서 흡광도를 측정하여 외식 농축 전기 자동차에서 GM-CSF의 농도를 결정합니다.</li>
</ol>

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카비타 야다나푸디, 치 리, 존 W. 이튼은 미국 특허 출원을 제출 "엔지니어링 배아 줄기 세포 유래 엑소좀과 그 사용 방법을 포함하는 조성물."

이 연구는 면역 자극성 단백질 GM-CSF를 운반하는 외성 농축 된 전기를 생산하는 매우 효율적인 방법을 보여줍니다, 이는 외식 농축 된 EV의 면역 변조 효과를 연구하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 엑소좀이 면역 조절 및 항종양 기능을 전시한다는 것을 건의합니다22. 따라서, GM-CSF를 표현하는 ESCs에서 엑소솜은 또한 면역 반응을 통제하는 생물학 활동을 소유할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 외인성 뮤린 GM-CSF는 형질전환에 의한 뮤린 ES-D3 세포에서 안정적으로 과발현되었다(도1). 중요하게도, GM-CSF의 상당량은 GM-CSF(도5)를과발현하는 ES-D3 세포로부터 분리된 엑소좀 농축 전기자동차에서 검출되었다.
이러한 데이터는 거의 모든 GM-CSF가 외민 농축 된 전기 자동차 내에 있음을 시사합...

ESC는 이식 전 배아1의배반성 단계에서 유래된다. 만능 줄기 세포로서, ESC는 배아 세포의 어떤 모형든지로 자기 갱신하고 분화할 수 있는 기능을 가지고 있습니다. 그들의 놀라운 발달 잠재력 및 장기 증식 능력으로 인해, ESC는 생물 의학 연구1에매우 귀중하다. 현재의 연구 노력은 주로 당뇨병, 심장 질환 및 신경 퇴행성 질환2,3,4를포함한 다양한 주요 병리학 적 질환에 대한 EsC의 치료잠재력에초점을 맞추고 있다.
ESC를 포함한 포유류 세포는 세포간 환경에 가변 크기로 소포를 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이들 EV는 세포간 통신5에서의역할로 인해 많은 생리적 및 병리학적 기능을 갖는다. 이외 용이성 중에서도, 외형은 플라즈마 멤브레인6을가진 중간 내구, 다중 혈관 체납체(MVBs)의 융합시 세포외 공간으로 다양한 세포 유형에서 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀은 세포간 통신을 중재하기 위해 보고되었으며 많은 (patho)의 생리적 과정에 비판적으로 관여하고있다7,8. 엑소좀은 단백질과 핵산을 포함한 사이토솔에서 획득한 생물학적 물질을 함유하고 있기 때문에 자신의 부모 세포로부터 일부 생물학적 기능을 상속합니다. 따라서, 주어진 질병에 특이적인 면역 반응을 자극하는 관련 항원 또는 인자는 특정 유형의 세포로부터 엑소좀에서 캡슐화된다9. 이는 항암 백신10으로종양 유래 엑소좀을 탐구하는 임상 시험을 위한 길을 열어주었다.
GM-CSF는 면역세포(11)의상이한 모형에 의해 분비되는 사이토카인이다. 새로운 증거는 GM-CSF가 면역 계통을 활성화하고 통제하고 항원 제시 프로세스12에서필수적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 임상 보고서는 GM-CSF가 백신보조제 13로서종양에 대한 면역 반응을 자극한다는 것을 시사한다. GM-CSF의 강력한 면역 자극 활성을 악용하기 위한 여러 GM-CSF 기반 암 면역 요법 전략은 임상 시험14에서조사되었다. 이들 중, 조사된 GM-CSF-분비 종양 세포로 구성된 암 백신은 전이 종양에서 세포 및 유머 항종양 반응 및 후속 괴사를 유도하여 고급 흑색종 환자에서 몇 가지 약속을 나타내고있다.
ESC에서 파생된 엑소솜은 원래 ESC와 유사한 생물학적 활동을 가지고 있기 때문에, 아마도 ESC에서 GM-CSF 운반 엑소좀은 면역 반응을 조절하기 위하여 세포 없는 소포로 작동할 수 있었습니다. 본 백서에서는 GM-CSF를 발현하는 ESC로부터 고품질 엑소좀 농축 전기자동차를 생산하는 상세한 방법이 설명되어 있다. 이 엑소좀 농축 된 전기 는 면역 반응을 조절하기 위해 면역 조절 소포역할을 할 가능성이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>알칼리성 인산염, 송아지 장</td><td>뉴 잉글랜드 Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Dephosphorylating DNA 플라스미드</td></tr><tr><td>안티 아넥신 V mAb</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>클론 H-3, sc-74438</td><td>웨스턴 블롯, RRID : AB_1118989</td></tr><tr><td>안티 CD81 mAb</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>클론 B-11, sc-166029</td><td>웨스턴 블롯, RRID : AB_2275892</td></tr><tr><td>안티 사이토크롬 c mAb</td><td>산타 크루즈 생명공학</td><td>클론 A-8, sc-13156</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_627385</td></tr><tr><td>안티-플로틸린-1 mAb</td><td>산타크루즈 바이오테크</td>놀러지 <td>클론 C-2; sc-74566</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_2106563</td></tr><tr><td>안티-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_11182910</td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG, 염소, 과산화효소-복합</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_228307</td></tr><tr><td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>클론 20E8C12 A21348</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>안티 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>안티 토끼 IgG, 염소, 과산화효소 접합</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>웨스턴 블롯, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>BCA(비신코닌산) 분석</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td><td>Genscript</td><td>M42015</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>카르베니실린, 디소듐</td><td>염 Thermo Fisher</td><td></td><td>10177012 E. coli colonies</td></tr><tr><td>원심분리기, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>저속 원심</td></tr><tr><td>분리 원심분리기 로터, JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td><td>저속 원심분리</td></tr><tr><td>원심분리기 병, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td> 탄소 지지 필름이 있는 <td>저속 원심분리</td></tr><tr><td>Cu 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>FF200-Cu</td><td>전자 현미경 이미지 획득</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>DNA 플라스미드</td></tr><tr><td>소화 향상된 화학발광 검출 시스템</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScalibur 유세포 분석기</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>ES-D3 세포의 GFP 수준 검사</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 세포 스트레이너; 메시 크기: 40&mu; m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>FACS 분류를 위한 ES-D3 세포 필터링</td></tr><tr><td>젤라틴(0.1%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>ES-D3 세포 배양</td></tr><tr><td>GM-CSF ELISA 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>88733422</td><td>GM-CSF 농도 측정</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' 의 변형된 독수리' s Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>백혈병 억제 인자</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 트랜스펙션 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>Transfecting ES-D3 세포</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>GM-CSF 농도 측정</td></tr><tr><td>MoFlo XDP 고속 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>단일 ES-D3 세포 클론 분리</td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>GM-CSF 발현 플라스미드 생성</td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-131-035</td><td>ES-D3 클론</td></tr><tr><td>선택 비필수 아미노산</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>웨스턴 블롯</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 배지</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>Transfecting ES-D3 세포</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>전자 현미경 이미지 획득</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>ES-D3 세포용 배지</td></tr><tr><td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>GM-CSF 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>생성 Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Generating GM-CSF expression plasmid</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>GM-CSF 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>생성 퀵 라이게이션 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>GM-CSF 발현 플라스미드 생성</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>전자 현미경 이미지 획득</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>ES-D3 세포 배양</td></tr><tr><td>초원심분리기, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High 고속 원심</td></tr>분리 <tr><td>초원심분리기 로터, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>고속 원심분리</td></tr><tr><td>초원심분리기 폴리카보네이트 병</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td>고속 원심분리</td></tr><tr><td>UranyLess 염색 용액</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22409</td><td>전자 현미경 이미지 획득</td></tr></tbody></table>

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포 (ESC)는 모든 유형의 배아 세포로 자가 재생 및 분화를 할 수있는 만능 줄기 세포입니다. 다른 많은 세포 유형과 마찬가지로, ESC는 외식과 같은 작은 막 소포를 세포 외 환경에 방출합니다. 엑소좀은 세포간 통신의 필수 중재자 역할을 하며 많은 (patho) 생리적 과정에 기본적인 역할을 합니다. 과립구-대식세포 식민지 자극 인자(GM-CSF)는 면역 반응을 조절하기 위해 사이토카인으로서 기능한다. 엑소좀에 GM-CSF의 존재는 면역 조절 기능을 높일 가능성이 있다. 여기서, GM-CSF는 뮤린 ESC 세포주 ES-D3에서 안정적으로 과발현되었다. 프로토콜은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포로부터 고품질 엑소좀 농축 세포 소포(EV)를 분리하기 위해 개발되었다. 고립 된 엑소좀 농축 된 전기는 다양한 실험적 접근법을 특징으로하였다. 중요한 것은, 상당한 양의 GM-CSF는 엑소좀 농축 된 전기 에 존재하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로, ESC에서 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 된 전기 는 그들의 면역 규제 활동을 발휘 하기 위해 세포 없는 소포로 작동할 수 있습니다.

GM-CSF는 뮤린 ESC에서 과발현된다. ES-D3 세포에서 GM-CSF를 안정적으로 과발적으로 표현하기 위해, 뮤린 GM-CSF cDNA는 발현 벡터 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(도1A)를생성하는 형질 벡터로 복제되었다. GM-CSF는 ES-D3 세포에서 과발현되었고, 과도적으로 과도하게 감염된 ES-D3 세포의 약 20%가 GFP 양성이었다. 세포 클론은 GM-CSF 또는 빈 벡터 제어를 안정적으로 과발현하는 FACS에 의해 획득되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, GM-CSF-발현 ES-D3 세포주 또는 빈 벡터를 발현하는 ES-D3 세포주의 GFP 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높았다. ELISA 분석은 상이한 세포주의 세포배양상수에서 GM-...

이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

우리의 프로토콜은 면역 자극 인자, GM-CSF를 표현하는 배아 줄기 세포에서 고품질 엑소좀 농축 세포 소포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. GM-CSF를 운반하는 Exosome 농축 세포 외 소포는 면역 반응을 조절할 수 있는 세포 없는 면역 조절 소포를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 기본적인 분자 및 세포 생물학 훈련을 가진 연구원은, 이 프로토콜을 할 수 있는 것처럼 쉽게 할 수 있어야 합니다, 그러나 처음으로 이 프로토콜을 능력을 발휘하는 사람은 밀접하게 지시를 따라야 합니다.우리의 프로토콜은 복잡하기 때문에 각 단계의 복잡한 세부 사항을 시각화하면 다른 연구자들이 외형 무료 FBS를 생성하고 FBS의 원하는 볼륨을 초원심 분리하고 엑소좀 무료 상신수를 수집하는 데 도움이 됩니다. ESD 3개의 세포를 도금하기 전에 실온에서 0.1%젤라틴으로 15센티미터 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅하십시오. 세포가 90%에 도달할 때까지 37°C에서 37°C에서 37°C에서 37°C에서 ESD 3세포 세포가 없는 ESD 3세포를 포부및 배양시킴으로써 젤라틴을 제거한다.요리당 0.05%의 트립신 5밀리리터로 거의 혼잡한 문화를 씻어내고, 신선한 트립신에서 섭씨 37도에서 5분간 배양을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심 분리 기 튜브에 분리 된 세포를 당기고 신선한 배양 배지의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 세포 중퇴는 15밀리리터에서 ESD 3세포의 5배에서 6분의 1을 10으로 플레이트하여 15밀리리터의 새로운 젤라틴 코팅 플레이트에 10배씩 세포배양식을 수집하여 외성 농축 외세포의 분리를 위한 세포 배양 슈퍼탄트 10배를 수집하여 10배의 세포배양식에 대한 세포배양초극을 수집하여 10배의 세포배양소에 다시 중단한다. 새로운 젤라틴 코팅 판당 세포 배양 배지의 밀리리터는 세포 배양 체계를 수집하기 3일 전에 엑소좀 농축된 엑스트라 세포 소포 절연, 72시간 배양ESD 3세포로부터 수집된 초중질 내의 큰 세포 단편을 원심분리에 의한 것으로 한다.상체를 수집한 후, 초원심분리는 샘플을 폐기하고 초월제를 폐기한다. 제조사의 지시에 따라 세척당 PBS 1밀리리터로 각 팔레트를 두 번 부드럽게 헹구어 잔류 배양 슈퍼네탄을 제거하고 비신천산 분석으로 외성 농축 세포 외 소포 단백질 함량을 정량화합니다. 그런 다음 영하 80도에서 저장하기 위해 마이크로 미터 농도당 6 마이크로 그램으로 PBS에서 외식 농축 세포 외 소포를 다시 중단합니다.투과 전자 현미경에 의해 외형 농축 외세포 소포를 시각화하려면 2시간 동안 실온에서 2%의 전자 현미경 그리드 파라포름알데히드의 최종 농도로 세포외 소포의 밀리리터당 3~5마이크로그램을 수정한다. 인큐베이션의 끝에서, 필터 종이로 그리드를 배출하기 전에 1 분 동안 탄소 지원 필름구리 그리드에 고정 된 샘플의 10 마이크로 리터를로드, 적절한 염색 솔루션그리드에 머물고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 핀셋을 사용하여 필터 용지의 조각으로 그리드를 전송, 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 전자 현미경 이미지를 획득하기 위해 50 배율, 000 배율로 전송 전자 현미경을 사용합니다. 전세포 추출물을 준비하려면, 입증된 바와 같이 배양으로부터 ESD 3개의 세포를 수집하고, 계산을 위해 PBS에서 수확된 세포를 다시 중단한다.두 번째 원심 분리 후, 0.5%SDS 농도를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼의 마이크로리터 당 5배 10에서 세 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 10%의 진폭을 가진 소닉레이터에서 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 가열합니다. 외형 농축 세포 소포에 대한 용액을 준비하기 위해, 마이크로 리터 농도 당 1.2 마이크로 그램에서 0.5 %SDS를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼에서 외성 농축 세포 외 소포를 다시 중단하고 시연 된 바와 같이 샘플을 10 초 동안 초음파 처리한 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5 분 동안 가열합니다.웨스턴 블롯 분석을 위해, 10 마이크로 리터 도매 추출물과 엑소좀 농축 세포 외 소포 리세이트 샘플을 최고의 스트레스 페이지 젤의 개별 우물에 적재하십시오. 실행의 끝에서, PVDF 막에 단백질을 전송하고 관심의 적절한 기본 및 이차 항체와 막을 배양, 다음 향상된 화학 발광 검출 키트를 사용하여 단백질 발현을 감지, 제조 업체의 지침에 따르면. 엑소좀 농축 세포 외 소포 내에서 GM-CSF의 양을 평가하기 위해 키트 Murine GM-CSF를 사용하여 ELISA 플레이트를 안티 GM-CSF 포획 항체로 코팅하고, PBS 의 마이크로리터 100마이크로리터를 단독으로 처리하거나 PBS 플러스 0.05%tween 200분 실내에서 20분 동안 0.05%tween을 치료하십시오.인큐베이션이 끝나면, 준비된 ELISA 플레이트의 개별 우물에 1시간 동안 실내 온도에서 배양한 다음 PBS단독으로 적절한 해당 웰을 세척하거나 PBS 플러스 0.05%tween 20을 첨가한다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS단독으로 세척한 다음 PBS와 0.05%tween 20을 첨가한 다음, 실온에서 30분 동안 시료에 아비딘 호스레디시어 페록시다제를 첨가한 다음, 40마이크로미터의 각 마이크로플레이트에서 각 마이크로플레이트에서 흡수를 측정한다. GFP 형광 강도는 ESD 3 세포주 또는 빈 벡터를 표현하는 ESD 3 세포주 또는 ESD 3 세포줄을 표현하는 GM-CSF의 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높습니다.ELISA는 GM-CSF를 발현하는 ESD 3개의 세포가 빈 벡터 제어 세포보다 세포 배양 상류체에서 현저하게 더 높은 수준의 GMCSF를 생성한다는 것을 밝힙니다. 더욱이, GM-CSF가 ESD 3세포를 발현하는 GM-CSF에 의해 생성된 GM-CSF의 양은 GM-CSF를 발현하는 STO 섬유아세포에 의해 생성된 것과 유사하다. 벡터 트랜스듀시 및 GM-CSF 트랜스포이크 세포 배양으로부터 분리된 세포외 소포의 전송 전자 현미경 검사는 예상 된 30 ~ 100 나노미터 직경 범위 내에 속하는 다른 크기의 소포를 나타낸다.CD81, 부속서 V 및 플로틸린-1을 포함한 외경 마커의 발현은 세포외 소포에서 현저하게 향상되며, 서구 블롯 분석에 의한 해당 도매 추출물에 비해 ESD 3세포로부터 분리된다. 중요한 것은, ESD에서 다른 세포체 구획 마커의 존재3 유래 세포 외 소포는 내시경 망상 마커, 단백질 이섬화증, 미토콘드리아 마커, 사이토크롬 C 및 옥스포스 복합 IV-서브유닛 IV 및 세포성 마커 GAPDH를 포함하였나. 0.05%tween 20으로 세척한 후, 대조군에서 검출된 배경 GM-CSF 수준이 크게 감소하였다.대조적으로, GM-CSF 발현 세포의 세포외 소포에서 GM-CSF 수준은 트위닝에 의해 현저하게 증가하였다 20. GMCSF를 운반하는 고품질 엑소좀 농축 세포 외 소포를 획득하는 것은이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계입니다. 연구원은 GM-CSF 종속 세포주 및 동물에 있는 연구 결과와 같은 추가 실험을 능력을 발휘할 수 있습니다 GM-CSF를 돌보는 외민농축 세포 세포 소포가 세포 없는 면역 규제 소포로 작동할 수 있는지 여부를 결정합니다.이러한 엑소좀 농축 세포 외 소포는 면역 반응의 변조가 다른 질병 조건에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

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이 프로토콜은 1) 성체 마우스 비복근에서 일차 섬유아세포를 분리하고 배양하는 방법과 2) 자당 밀도 구배와 웨스턴 블롯 분석을 결합한 차등 초원심분리 방법을 사용하여 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

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인간 코드 혈액 줄기 세포 (CB-SC)-유래 엑소좀으로 치료 후 페노전성 뚜렷한 대식세포로 단핵구를 분화

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

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이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.

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본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

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여기에서는 엔도솜 유래 나노소포체의 대규모 생산을 위한 자기 분리 보조 고속 균질화 방법을 생물학적 기원과 천연 세포외 소포체(EV)의 생물학적 기원과 유사한 구조, 형태 및 단백질 조성을 공유하는 새로운 유형의 엑소좀 모방체(EM)로 설명합니다.

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배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

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