Name: 분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 배우세요 분할 각막 단추를 이용한 돼지 각막 내피 세포의 장기 배양 방법을 안과학 연구에 적용하세요. 이 기법은 15일 이상 세포 손실을 최소화하며 안과용 약물 효과 평가에 활용됩니다.

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제시 된 연구 모델의 설립은 교육 및 연구 독일의 연방 정부의 KMU-innovativ (FKZ : 13GW0037F)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 우리 기관의 윤리적 지침을 따릅니다. 우리 기관의 윤리 검토 위원회의 법령에 따라 모든 돼지 각막이 지역 도축장에서 얻어졌기 때문에 실험 전에 윤리적 승인을 받아야했습니다.
1. 장기 문화
<ol><li>돼지 눈을 준비합니다.<ol>
<li>지역 도축장에서, 곧 사후 하지만 열 처리 하기 전에 제거 된 돼지 눈을 얻을. 실험실로 눈을 운반하고 몇 시간 이내에 처리합니다. 운반 중에는 가공 하기 전에 실온 (약 21 °C)에서 눈을 유지 하십시오.</li>
		<li>눈 가위와 대장균 집게를 사용하여 소독하기 전에 모든 궤도 부속기 (눈 근육, 결막, 지방 조직)를 제거하십시오. 명백한 외상, 외부 손상 (예 : 칼 절단) 또는 눈에 보이는 각막 불투명도가있는 모든 눈을 분리하고 폐기하십시오.</li>
		<li>인산완식염수(PBS) 용액의 57 mL에 7.5% 포비돈의 요오드 3 mL을 첨가하여 멸균 컵에 5% 요오드-PBS 용액(1:20)을 준비한다. 또한 60 mL 순수 PBS를 포함하는 별도의 멸균 컵을 준비합니다. 참고 : 사용되는 요오드 - PBS 용액의 총 량과 컵의 크기는 해부 할 각막의 수에 따라 달라집니다. 5~6개의 눈은 5%-요오드-PBS-용액의 약 60 mL가 제대로 비장되어야 합니다.</li>
		<li>5%-요오드-PBS 용액에 5-6개의 눈을 넣고 총 5분 동안 눈의 표면을 적절하게 소독합니다. 눈의 표면이 완전히 물에 잠기고 요오드 용액에 완전히 소독되도록 매 분마다 조심스럽게 저어줍니다.</li>
		<li>5 분 후, 순수한 PBS로 채워진 준비 된 컵에 감염된 눈을 옮긴다. 요오드-PBS 용액이 눈의 표면에서 멀리 씻어내도록 조심스럽게 저어줍니다. 참고: 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행하여 감염된 눈의 오염을 방지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 배양 판을 준비합니다. 참고: 일정한 층류 공기 흐름이 있는 깨끗한 벤치에서 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>태아 송아지 혈청 (FCS)의 2 mL을 해동. 무딘 캐뉼라를 사용하여 FCS로 주사기(5mL)를 채웁니다. 주사기 필터(0.22 μm)를 통해 주사기를 비우면 FCS의 세균 오염을 80 mL의 덱스트란 없는 배양 배지 I(최소 필수 배지 [MEM]과 얼염, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민[200 mM]으로 비우십시오. 암포테리신 B [250 μg/mL], 헤페스 버퍼 [1 M] [50x], NaHCO3, 및 증류수). 혼합물을 교반하여 기판 분포를 균일하게 유지합니다.</li>
		<li>기판 혼합물의 3 mL로 12 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰을 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>해부 및 배양을 수행합니다. 참고: 깨끗한 벤치에서 이 단계를 수행합니다. 모든 악기로 각막 내피를 만지지 마십시오.<ol>
<li>PBS를 가진 컵에서 눈 전구를 각막을 위로 향하여 눈 전구 홀더로 옮기고 안과 수술 현미경 아래에 놓습니다. 0.9% NaCl이 채워진 주사기를 사용하여 눈전구 홀더 위에 흡입을 약간 적용하여 해부를 위한 자세로 눈을 고정시다.</li>
		<li>트레핀(ø 7.5 mm)을 표준화된 인레이가 함유된 트레핀(ø 7.5 mm)을 사용하여 트레핀 깊이가 300 μm를 초과하지 않도록 하여 표면적으로 중앙 각막으로 절단합니다(그림1A).</li>
		<li>대장균 집게와 삼각형 블레이드가 있는 일회용 메스를 사용하여 각막의 부분적으로 트레핀된 부분을 기질을 통해 수평으로 자르고 제거합니다. 각막 상피, 보우맨 층 및 기질의 일부로 구성된 분리 된 각막 부분을 폐기하십시오. 참고 : 엄격하게 나머지 기의 균일 한 두께를 얻기 위해 수평 절단 방향을 유지합니다.</li>
		<li>피상적으로 10-0 봉합사(10-0 폴리아미드 6)를 기질 내로 배치하여 실험 동안 기질 측으로부터 내피를 분화할 수 있도록하였다(도 1B). 각막 내피의 침투를 방지합니다. 내피가 침투하면 눈전구를 버리십시오. 참고 : 봉합 바늘로 각막 내피의 침투가 볼 수 있습니다, 전방 눈 챔버에서 유체가 봉합사 채널을 통해 누출로.</li>
		<li>인레이 없이 트레핀을 사용하여 전방 안구 챔버에 도달할 때까지 트레핀 컷을 최대 깊이로 진행합니다(도1C). 전방 안구 챔버에서 누출 저항과 유체에 뚜렷한 드롭은 각막의 완전한 침투 후 인식 될 수있다. 참고 : 분할 각막 버튼이 trephination 후 분할 각막 버튼의 한쪽에 부착 남아있는 경우 하키 칼을 사용합니다.</li>
		<li>얻어진 분할 각막 버튼을, 이제 기질의 일부로 구성된(그림 2),Descemet의 막, 및 각막 내피, 배양 배지 (배양 배지 I + FCS, 참조 섹션 1.2)를 가진 12 웰 세포 배양 판으로 각막 내피가 위를 향할 수 있도록 아래를 향한 태그가 지정됩니다. 참고: 내피 측이 아래로 향하고 있는 경우에, 내피는 손상될 수 있습니다.</li>
		<li>후속 조치 동안 식별을 위해 모든 분할 각막 버튼에 개별 번호를 할당하고 그에 따라 세포 배양 판에 우물을 레이블.</li>
		<li>37°C, 5%CO2 및 95%의 상대적인 공기 수분에서 표준 조건 하에서 채워진 세포 배양 판을 인큐베이터에 배양한다. 배양배지(배양배지 I + FCS)를 8일째인 경우 7일간의 배양기간을 초과한다. 참고 : 분할 각막 버튼을 사용하여 인큐베이션 절차는 최대 15 일 동안 검증되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60171/60171fig1.jpg"> 그림 1: 분할 각막 단추를 얻기 위하여 돼지 각막의 해부. (A)각막의 트레핀을 인레이로 300 μm의 깊이로 자르고 기질 조직의 상피와 부분을 제거한 후,(B)봉합사가 각막의 침투 없이 기질에 표면적으로 배치된다. 기질 측의 나중에 식별을위한 내피. (C)남은 각막의 전체 탈질은(D)눈 전구에서 얻어진 분할 각막 버튼을 제거한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60171/60171fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 현미경 검사 및 내피의 검사
<ol><li>얼룩이 없는 검사를 수행합니다. 참고 : 얼룩이없는 검사는 여러 번 수행 할 수 있습니다 (예 : 1, 8 및 15일의 주간 후속 조치). 그러나, 비염색 계수는 형태학적 파라미터가 아닌 내피 세포 밀도의 평가만허용한다.<ol>
<li>저혈압 균형 염 용액 3 mL을 채우기 (hBSS, 재료의 표에서조성물 참조)를 12 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에. 조심스럽게 각막 내피 세포의 붓기를 유도하고 세포 계산을위한 세포의 가시성을 개선하기 위해 hBSS에 하나의 분할 각막 버튼을 배치합니다. 참고 : 내피 측이 현미경의 방향을 향하고 있는지 확인하십시오. 반전된 상 대조 현미경이 이용되는 경우에, 내피 측은 아래쪽을 향할 필요가 있습니다. 제자리에 있는 동안, 배양 판은 내피 세포 손상을 방지하기 위하여 이동해서는 안됩니다.</li>
		<li>현미경에 부착 된 카메라로 내피 사진을 찍기 전에 세포가 1-2 분 동안 팽창하게하십시오. 각막 내피의 실제 상태의 대표적인 인상을 얻기 위해 적어도 세 개의 서로 다른 영역의 적어도 세 장의 사진을 촬영. 각막 내피 세포 밀도 및 형태학적 매개 변수의 나중에 분석을 위해 100 μm의 스케일 길이에 참을 가진 스케일 막대를 추가합니다.</li>
		<li>삼투성 손상을 방지하기 위해 최대 5 분 후에 hBSS에서 분할 각막 버튼을 제거하고 배양 매체3으로다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>염색 검사를 수행합니다. 참고 : 염색은 사용되는 염색 물질이 세포 독성이기 때문에 실험을 종료합니다. 따라서, 염색은 형태학적 파라미터(개혁 수치, 로제트 형성, 알리자린 적색 염색 세포)의 평가를 위한 관찰 기간의 끝에서만 수행될 수 있다.<ol>
<li>염색 시술에 0.25% 트라이판 블루 용액과 0.2% 알리자린 레드 S 용액을 준비한다.<ol>
<li>0.25% 트라이판 블루 용액의 경우 0.9% NaCl 용액으로 0.4% 트라이판 블루 용액을 희석합니다. 참고: 예를 들어, 0.25% 트라이판 블루 용액의 20 mL을 얻으려면 0.9% NaCl 용액의 7.5 mL로 0.4% 트라이판 블루 용액의 12.5 mL를 희석합니다. 트라이판 블루 용액은 몇 주 또는 몇 달 동안 실온에서 보관될 수 있다.</li>
			<li>0.2% 알리자린 적색 S 용액을 얻기 위해 0.9% NaCl 용액의 50 mL에서 알리자린 적색 S 분말의 100 mg을 가열 기능을 가진 자석 교반 판상에 50°C로 일정한 교반 및 가열 하에 NaCl 용액을 용해한다. 가능한 침전을 제거하려면 얻은 용액을 필터링합니다. 그에 따라 수산화 나트륨 또는 염산을 첨가하여 알리자린 레드 S 용액의 pH를 pH 4.2로 조절한다. 참고 : 알리자린 적색 S 용액의 각 응용 프로그램 전에 pH가 4.2로 보정되고 용액에 침전물이 없는지 확인하십시오. 용액은 실온에서 보관될 수 있다. 4주 이상 보관하지 마십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>내피 세포를 얼룩지기 위해 내피 측이 위쪽을 향하도록 페트리 접시에 분할 각막 버튼을 놓습니다. 피펫을 사용하여 0.25% 트라이판 블루 용액을 90년대 동안 각막 내피에 떨어뜨려 서서히 떨어뜨립니다. 참고 : 트라이 판 블루는 자신의 핵을 얼룩 때문에 투과성 멤브레인 손상된 각막 세포의 식별을 할 수 있습니다.</li>
		<li>작은 유리 비커에 0.9 % NaCl에서 분할 각막 버튼을 3 배 조심스럽게 헹구세요. 다시, 피펫을 사용하여 0.2% 알리자린 레드 S 용액을 90s에 대한 각막 내피에 떨어뜨려 서서히 떨어뜨립니다. 참고: Alizarin red S는 손상되지 않은 각막 내피 세포의 세포 경계를 강조하고 기본 Descemet의 막이 보이게 되면 파괴된 세포를 강조하는 데 도움이되는 Descemet의 막을 더럽히습니다. 또한, 더 큰 파괴 된 지역을 쉽게 식별 할 수 있습니다.</li>
		<li>스테인드 각막 내피의 검사를 위해 섹션 2.1에서 얼룩이 없는 계수에 대해 설명된 단계를 따르십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 각막 내피 세포 밀도 및 형태 학적 매개 변수의 분석
<ol><li>그래픽 편집소프트웨어(재질 표)를사용하여 그림에 사각형을 계산하는 프로젝트입니다.<ol>
<li>소프트웨어를 열고 파일을 선택하여 각막 내피의 이미지를 엽니 다 | 오픈 | 을 선택합니다.</li>
		<li>이미지에 100 μm의 배율 측 길이가 있는 사각형을 투영합니다. 참고: 보기 소프트웨어가 그림에 사각형 을 계산하는 것을 허용하는 경우 섹션 3.1.2의 다음 단계를 무시할 수 있습니다. 사각형의 측면 길이는 현미경 카메라로 촬영한 이미지의 해상도에 따라 달라지며 스케일 막대로 계산할 수 있습니다.<ol>
<li>현미경으로 찍은 사진에서 배율 막대를 자르기: 도구 모음에서 직사각형 선택 윤곽 도구를 선택하거나 M을누릅니다. 자르기 또는 Ctrl + X를누릅니다.</li>
			<li>파일 | 클릭 새로운 (또는 Ctrl + N을누릅니다). 예정된 창에서 문서 유형 드롭다운 목록에서 클립보드를 선택합니다. 표시된 픽셀 수는 계수 사각형의 측면 길이입니다. 다른 사진에 해당하는 픽셀을 기록하고 확인을클릭합니다.</li>
			<li>파일 선택 | 새로운 (또는 Ctrl + N). 축척 막대의 길이에 따라 다가오는 창에 계수 사각형의 너비와 길이(픽셀)를 삽입합니다. 배경색을흰색으로 선택한 다음 확인을누릅니다.</li>
			<li>선택을 클릭합니다. 모두 (또는 Ctrl + A)를선택합니다. 편집 선택 | 복사 (또는 Ctrl + C).</li>
			<li>3.1.1단계에서 열린 각막 내피의 이미지를 선택한다. 편집 선택 | 붙여 넣기 (또는 Ctrl + V)각막 내피의 사진에 사각형을 삽입합니다.</li>
			<li>사각형의 레이어를 선택하고 투명도를 조정합니다. 레이어 선택 | 레이어 스타일 | 블렌딩 옵션 | 불투명도를 30%로 설정 | 확인 .</li>
			<li>투영된 사각형으로 이미지를 100 μm의 배율 측 길이로 저장합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>내피 세포 밀도 및 형태학적 파라미터를 평가한다.<ol>
<li>ImageJ(버전 1.50i)에서 투영된 사각형으로 이미지를 열고 CellCounter PlugIn을 사용하여 사각형 내의 셀을 계산합니다. 이미지J 열기, 파일 선택 | 열기 (또는 Ctrl + O) | 이미지 를 선택합니다. 참고 : ImageJ와 셀 카운터 플러그인은 온라인으로 다운로드 할 수있는 프리웨어입니다.</li>
		<li>플러그인 선택 | 셀_카운터 | 셀 카운터 | 초기화합니다. 내피 세포를 계산하고 결과를 기록합니다. 사각형의 양면에서 사각형 가장자리로 잘려있는 셀을 계산합니다. 다른 두 면에 잘라낸 셀을 세지 마십시오.</li>
		<li>다른 지역에서 각막 당 적어도 6 개의 사각형을 분석하고 (예를 들어, 3 개의 사진, 사진 당 2 개의 사각형) 사각형 당 평균 각막 내피 세포 밀도를 결정합니다 (100 μm2). 100 μm 당 내피 세포밀도를 100을 곱하여 2 ~ 1mm2를 곱한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형태학적 변화의 평가를 위해, 개혁 수치 (3 대신 ≥4 세포 / 세포 경계의 공동 회의), 로제트 형성 (특징 적인 장미 모양의 모양, 파괴 된 세포를 둘러싼 5 개 이상의 방사형 으로 배열 된 세포) ) 또는 알리자린 적색 영역 (파괴 된 세포) 투영 된 사각형에. 참고: 또는 잘 보존된 샘플에서 형태학적 분석을 위해 더 큰 제곱(예를 들어, 200 x 200 μm2)을사용하여 보다 대표적인 결과를 얻는 것이 유용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 연구 목적을 위해 표준화되고 저렴한 비용의 생체 내막 내피 내피 내피 모델을 나타내는 돼지 분할 각막 버튼을 제조하는 방법을 제공한다6. 돼지 분할 각막 버튼은 2 주 기간동안눈 은행에서 재배 된 인간 기증자 각막에서 관찰 된 내피 세포 손실에 필적하는 내피 세포 밀도의 감소를 보였다6,10,11, 12.
비 분할 각막 버튼뿐만 아니라 전체 돼지 코르네오스클레럴 샘플에 대한 우수성은 이전에6을나타내었다. 그 연구에서, 3 개의 그룹 일 1, 8, 그리고 15 에 비교 되었다. 모든 그룹의 각막 내피 (각막 버튼, 비 분할 각막 버튼, 분할 각막 버튼)는...

각막 이식 절차는 전 세계적으로 가장 일반적으로 수행 이식 중 하나입니다1. 인간 기증자 각막의 심각한 부족이 있기 때문에, 인간 각막에서 각막 내피 세포를 다루는 실험 연구는 수행하기 어렵다1. 그러나, 눈, 안과 점탄성 장치, 수술 기구 및 기술 (예를 들어, phacoemulsification 기기 및 기술, 초음파 에너지)에서 사용되는 관개 용액 및 기타 물질의 도입은 필요합니다. 임상 사용 전에 각막 내피에 미치는 영향에 관한 유효하고 광범위한 조사.
인간 기증자 각막에 대한 몇 가지 대안은 연구를 위해 존재합니다. 동물 연구 모델은 매우 귀중하지만 동시에 매우 자원 소비와 점점 윤리적으로 의문을 제기. 시험관 내 세포 배양의 주요 단점은 인간의 눈에 그들의 제한 된 번역. 세포 배양에서 얻은 결과는 세포가 내피 중간엽 전이 (EMT)를 겪을 수 있기 때문에 세포 극성의 손실과 세포 모양 및 유전자의 변화로 인한 섬유아세포 와 같은 형태학을 겪을 수 있기 때문에 생체 내 조건에 부합할 수 있습니다. 표현식2.
이전 생체 내 외 모델은 최대 120 h의 재배 기간을보고한 반면, 돼지 각막 내피 내피 장기 배양 모델을 확립하기 위한 새로운 준비 기법은 신선한 돼지 각막을 적어도 15 일 동안 배양하여 최근에 도입되었다3 ,4,5,6. 각막 상피와 기질의 일부가 재배 하기 전에 각막에서 제거 하는 경우 (약 300 전체에서 약 300 μm) 각막의 붓기는 덜 내 피 세포 손실 및 잘 유지 내 피 세포 손실의 결과로 분할 각막 버튼에서 감소 비 분할 각막 단추는 Descemet의 주름의 고르지 않은 기질 팽윤 그리고 대형 때문에 중요한 내피 세포 손실을 보여주기 때문에 15 일까지 후에 세포 층. 눈 은행은 일반적으로 이식 하기 전에 각 막의 붓기를 줄이기 위해 dextran 같은 삼 투 성 팽창 에이전트를 사용. 그러나, 이들 제제는 증가된 내피 세포 손실을 유도하는 것으로 나타났다7,8,9.
이 문서는 분할 각막 단추를 사용하여 각막 내피에 대한 연구를 수행 할 미래의 조사자가 할 수 있도록하기 위해 상세한 단계별 프로토콜에서이 표준화 된 생체 내 비보 연구 모델을 시각화하는 것을 목표로합니다. 이 모형은 안과 점탄성 장치, 관개 해결책 및 초음파 에너지, 또는 각막 내피가 관심있는 그밖 절차와 같은 눈 내의 이용된 물질 그리고 기술을 시험하는 간단한 방법을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>Subject</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pig eyes</td><td>local abbatoir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substances</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Medium 1, #F9016</td><td>Biochrom GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (1x)</td><td>Gibco, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Biochrom GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl) 용액</td><td>자체 생산</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H</td>2O 1 L 당 자체 <td>생산</td><td></td><td>: NaCl 4.9 g; KCl 0.75g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; 아세트산 나트륨 x 3 H 2 O 3.9 g; 구연산나트륨 x 2 H2O 1.7g</td></tr><tr><td>포비돈 요오드 7.5%, Braunol</td><td>B. Braun Melsungen AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl) 0.9%</td><td>B. Braun Melsungen AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH) 용액</td><td>자체 생산</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재료 & 기기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet pro</td><td>Brand GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker Glass 50 mL</td><td>Schott AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt cannula inclula, incl. 필터 (5 &micro; m) 18G</td><td>Becton Dickinson, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트 (12 well)</td> <td>Corning Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri junps</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>각막 가위</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 피펫</td><td>Eppendorf AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye Bulb Holder</td><td>L. Klein, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>눈 가위</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접힌 필터 &oslash; 185 mm</td><td>Whatman, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>하키 나이프</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 실험실 유리 병 100 mL</td><td>Schott AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자기 교반 막대</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MillexGV 필터 (5 & 마이크로; m)</td> <td>Merck Millopore Ltd., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>니들러 홀더</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR International, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Sarstedt AG & Co., 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스 (일회용), 삼각형 블레이드</td><td>Aesculap AG & Co. KG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫 10 mL</td><td>사르스테트 AG & Co., 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫 5 mL</td><td>Sarstedt AG & Co., 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 컵</td><td>Greiner Bio-One, &Ouml; sterreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 장갑</td><td>Paul Hartmann AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 수술 드레이프</td><td>Paul Hartmann AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스티치 가위</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>봉합사 Ethilon 10-0 폴리아미드 6</td><td>Ethicon Inc., 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기(5mL)</td><td>Becton Dickinson, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트레핀 &오슬래시; 7.5mm</td><td>자체 생산</td><td></td><td></td></tr><tr><td>타이 겸자</td><td>Geuder AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>계량 종이</td><td>NeoLab Migge GmbH<</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>강력>장비 및 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binocular surgical microscope</td><td>Carl Zeiss AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경에 장착된 카메라</td><td>Olympus, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSens Entry (software)</td><td>Olympus, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉광원</td><td>Schott AG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heraeus GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립 위상차 현미경</td><td>Olympus GmbH, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 기능이 있는 자기 교반기</td><td>IKA-Werke GmbH & Co. KG, 독일</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter pHenomenal</td><td>VWR International, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS2</td><td>Adobe Systems, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision scale</td><td>Ohaus Europe GmbH, 스위스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

각막 내피 세포에 대한 실험 연구는 여러 가지 어려움과 관련이 있습니다. 인간 기증자 각막은 부족하고 일반적으로 이식을 위해 필요로 하기 때문에 실험적인 조사를 위해 드물게 유효합니다. 내피 세포 배양은 종종 생체 내 상황에 잘 번역되지 않습니다. 비 인간 각막의 생체 구조 특성으로 인해 재배 중 기질 부종은 상당한 각막 내피 세포 손실을 유발하여 장기간 재배를 수행하기가 어렵습니다. dextran과 같은 팽창 에이전트는 이 응답을 중화하는 데 사용됩니다. 그러나, 그(것)들은 또한 중요한 내피 세포 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 분해에이전트를 필요로 하지 않는 생체본 장기 배양 모델이 확립되었다. 지역 도축장에서 돼지 눈은 분할 각막 버튼을 준비하는 데 사용되었다. 부분 각막 trephination 후, 각막의 외부 층 (상피, 보만 층, 기질의 부분)을 제거하였다. 이것은 크게 대규모 기질 붓기에 의해 유도 된 각막 내피 세포 손실을 감소시키고 더 긴 재배 기간 동안 Descemet의 막 접는 내피 세포 층의 일반적인 보존을 향상. 후속 완전한 각막 담음은 나머지 눈 전구 및 재배에서 분할 각막 버튼의 제거에 의해 뒤따랐다. 내피 세포 밀도는 경현미경을 사용하여 제제 후 최대 15일(즉, 1일, 8일, 15일)의 후속 시간에 평가하였다. 사용된 준비 기술은 인간 기증자 각막에 필적하는 분할 각막 단추에 있는 느리고 선형 쇠퇴 비율 귀착되는 더 적은 기질 조직 팽윤에 의해 가능하게 된 내피 세포 층의 더 나은 보존을 허용합니다. 이 표준화된 유기학-전형적으로 재배된 연구 모델은 적어도 2주 동안 안정적인 재배를 가능하게 하기 때문에, 인간 기증자 각막에 대한 귀중한 대안으로, 향후 다양한 외부 요인에 대한 조사를 위한 귀중한 대안이 될 수 있습니다. 각막 내피에 미치는 영향.

제시된 해부 기술은 기질 조직의 부분적인 제거를 의미하며, 이로 인해 각막 샘플이 얇아지고 기질 이붓기가줄어듭니다(그림 1 및 그림 2). 적은 기질 팽윤은 각막 내피에 부정적인 충격이 있는 더 적은 전단 및 핀치 힘을 유도합니다, 따라서 더 낮은 내피 세포 손실 비율을 일으키는 원인이되는 6. 분할 각막 단추는 더 적은 내피 세포 손실 및 개혁의 더 적은 수를 반영하는 비 분할 각막 단추 및 전체 corneoscleral 견본에 비교된 재배의 15 일 후에 현저하게 더 잘 보존된 내피 세포 층을 보여줍니다 수치 (≥ 4 세포 / 세포 테두리가 3 개가 아닌 결합), 로제트 형성 (단일 자리에서 만나는 5 개 이상의 방사형 으로 배열 된 세포), 및 알리자린 적색 (파괴) 세포 는 15 일후...

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

이 프로토콜은 분할 각막 버튼의 준비로 달성 각막 내피 세포의 장기 전형 장기 재배를 허용하는 첫 번째 연구 모델을 제시한다. 외부 각막 층을 부분적으로 제거함으로써 내피 세포 손실이 현저히 감소되어 적어도 15일 동안 각막 내피 세포의 재배를 허용합니다. 따라서, 이 모델은 각막 내시경에 관개 솔루션 또는 안과 점탄성 장치와 같은 관심있는 특정 물질 또는 기술의 효과를 조사하는 데 유용합니다.모템 직후 제거된 돼지 눈을 받은 후, 눈 가위와 대장균 집게를 사용하여 모든 궤도 사전을 제거합니다. 5~6개의 눈을 5% 요오드 PBS 용액에 넣고 총 5분 동안 눈 표면을 제대로 소독하고, 1분에 한 번주의 깊게 저어서 표면이 완전히 침수되어 완전한 소독을 달성합니다. 5분 후, 소독된 눈을 순수한 PBS 한 잔으로 옮기고, 조심스럽게 저어요오드 PBS 용액을 눈 표면에서 철저히 씻어냅니다.해부를 시작하기 전에 무딘 카테터를 사용하여 5 밀리리터 주사기를 5 밀리리터의 갓 해동한 태아 종아리 혈청 2밀리리터를 채우고 0.22 마이크로미터 필터를 통해 30밀리리터의 도민을 데센이 없는 배양 배지의 80밀리리터로 변형시니다. 혼합물을 부드럽게 교반하여 혈청의 균질 분포를 달성하고, 12웰 세포 배양판의 각 웰에 3밀리리터를 첨가한다. 플레이트가 준비되면 각막이 위향인 안과 수술 현미경으로 안구 홀더로 눈 전구를 옮기고, 0.9%의 염화나트륨으로 채워진 주사기를 사용하여 눈위에 약간의 흡입을 적용하여 눈을 고정시합니다.표준화된 인레이가 들어 있는 트레핀을 사용하여 중앙 각막으로 피상적으로 절단하고 300 마이크로미터 이하의 더 깊은 것을 방지하고, 삼각 블레이드가 있는 대장균 집게와 일회용 메스를 사용하여 각막의 부분적으로 트레핀화된 조각을 스트로마를 가로로 잘라내고 제거합니다. 표면적으로 10-0 봉합사를 스트로마에 배치하여 실험 중에 기질 측으로부터 내피의 분화를 허용하고, 각막 내피를 관통하지 않고, 전방 눈챔버에 도달할 때까지 트레핀 컷을 전체 깊이로 전진시키기 위해 인레이없이 트레핀을 사용합니다. 전방 눈 챔버에서 누출되는 저항과 유체의 뚜렷한 낙하는 각막의 완전한 침투 후에 인식될 수 있습니다.스트로마의 일부를 포함하는 획득한 분할 각막 버튼, 데스멧의 멤브레인, 각막 내막을 태그된 면이 아래로 향하여 12웰 플레이트의 한 우물에 놓습니다. 그런 다음 후속 조치 중 식별을 위해 모든 분할 각막 버튼에 대한 개별

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연구

JoVE Journal

Medicine

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각막공막 단추 분리: 돼지 눈에서 각막낭 단추를 얻기 위한 수술 절차

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Anterior Eye Segment Culturing: 돼지 눈의 전방 분절 베어링 각막을 배양하는 방법

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