Name: 물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 확장 병리학(ExPath)을 활용한 인간 조직 섹션의 나노스케일 이미징 기법을. 수소겔 주입과 물리적 확장으로 형광 표지 생체분자를 분리 관찰하여 암 및 자가면역 질환 등 복잡한 질병의 병인 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 카네기 멜론 대학에서 학부 창업 기금에 의해 지원되었다 (YZ) 및 NIH 이사의 새로운 혁신 상 (DP2 OD025926-01 YZ에).

1. 주식 시약 및 솔루션 준비
<ol><li>
겔화 용액 성분을 준비합니다. 참고: 용액 농도는 g/mL(w/v%)으로 제공됩니다.<ol>
<li>다음 재고 솔루션을 확인: 38% (w/v) 나트륨 아크릴산염 (SA), 50% (w/v) 아크릴아미드 (AA), 2% (w/v) N,N′,N′-메틸렌네비사크릴라미드 (비스), 그리고 29.2% (w/v) 염화나트륨 (NaCl). 이중 탈이온수(ddH 2O)에화합물을 용해시켰다. 표 1의 양을 참조로 사용합니다. 준비된 솔루션은 필요에 따라 볼륨을 확장 하거나 축소할 수 있습니다. 예를 들어 38%(v) SA 용액의 10mL를 만들려면 1.9gSA를 그라디드 10mL 실린더에 추가하고 5mL의 부피에 ddH2O를추가합니다.</li>
		<li>표 1에나타낸 바와 같이 1.06x 농도로 9.4 mL의 단량액을 준비한다. 참고: 이는 이니시에이터, 가속기 및 억제제의 첨가 후 1배 농도를 초래할 것이다. 단량체 스톡은 최대 3개월 동안 4°C또는 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 주식 용액을 ddH2O에서 별도로 준비: 억제제 4-하이드록시-2,2,6,6-테트라메틸피리딘-1-옥실(4HT)의 0.5% (w/v) 개시자 tetramethylethylenediamine (TEMED), 이는 암모늄 persulfate에 의해 급진적 인 생성을 가속화 (APS), 및 10 % (w / v) 겔화 과정을 시작하는 APS. 참고: 4HT 및 TEMED의 스톡 솔루션은 1 mL aliquots로 제조되고 -20°C에서 적어도 6개월 동안 보관될 수 있다. APS는 장기간 보관 후 효능을 상실하는 것으로 밝혀졌으며 겔화 직전에 소량(&0.1 mL)으로 가장 잘 준비됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 버퍼 (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] 난비계면활성제, 0.8 M NaCl)을 결합하여 1 M Tris pH 8 (3.03 g의 트리스 베이스 25 mL의 ddH2O), 25 mL 의 EDH (5MH 5MA) , 2.25 g의 난오계면활성제, 23.38 g의 NaCl. 총 부피 500mL에 ddH2O를 추가합니다. 참고: 이 용액은 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있으며 4°C에서 보관할 수 있습니다. 단백질분해제 K(ProK)는 소화 단계 직전에 첨가됩니다.</li>
	<li>구연산나트륨 2.941 g과 ddH2O500 mL를 결합하고 실온(RT)에서 pH를 8.0으로 조정하여 구연산나트륨 용액 20mM을 준비합니다. 필요에 따라 재고량을 조정합니다.</li>
	<li>육수 용액을 6-(아크릴로일)아미노)헥사노산, 수치니미딜 에스테르(아크릴로일-X, SE) AcX), 앵커링 화합물. 10 mg/mL의 최종 농도를 위해 무수 디메틸 설폭화물(DMSO)의 500 μL에 AcX를 용해시. 참고: 용액은 20 μL aliquots에서 -20°C에서 건조된 환경에 저장될 수 있다.</li>
	<li>면역 염색을 위해 시판가능한 버퍼를 사용하지 않는 경우 차단 버퍼를 준비합니다. 1x 인산완충식염수(PBS)에서 5% (v/v) 정상 동물 혈청 및 0.1% (v)의 난오계면활성제의 차단 완충제를 사용하고 이차 항체의 숙주 동물에 기초하여 혈청을 선택한다. 예를 들어, 염소에서 제기된 항체에 대해 500 mL 차단 완충제를 제조하려면 염소 혈청 25 mL, 요온 계면 활성제 0.45 g, 1x PBS를 500 mL의 부피로 결합합니다.</li>
</ol>2. ExPath를 위해 보관되고 갓 준비된 임상 조직 슬라이드 준비
<ol><li>조직을 ExPath 호환 형식으로 변환합니다. 시편이 어떻게 준비되었는지에 따라 다음 네 단계 중 하나를 선택하십시오: FFPE 슬라이드, 스테인드 FFPE 슬라이드 또는 최적 절삭 온도(OCT) 용액에서 고정되지 않거나 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드. 참고: 이들은 병리학 견본을 위한 표준 복구 단계를 기반으로 하고 ExPath 프로토콜에 특정하지 않습니다.<ol>
<li>FFPE 임상 샘플<ol>
<li>95% 에탄올, 70% 에탄올 및 50% 에탄올30 mL을 준비합니다. 자일렌 30 mL, 100% 에탄올 및 ddH2O를 측정합니다.</li>
			<li>포셉을 사용하여 50 mL 원추형의 샘플로 슬라이드를 놓고 자일렌 15 mL를 추가합니다. 튜브를 캡하고 궤도 셰이커에 수평으로 놓고 약 60rpm으로 놓고 각 용액에 대해 RT에서 3 분 동안 배양하십시오. 나머지 15 mL 자일렌을 반복합니다.</li>
			<li>100% 에탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 50% 에탄올 및 ddH 2O를 자일렌 대신에 반복단계2.1.2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>스테인드 및 마운트 영구 슬라이드<ol>
<li>슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 자일렌으로 덮습니다. 면도날을 사용하여 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 커버슬립을 쉽게 제거하지 않으면 커버슬립이 풀릴 때까지 슬라이드를 자일렌으로 되돌려 주세요.</li>
			<li>FFPE 샘플에 대한 단계를 사용하여 프로세스 (단계 2.1.1.1-2.1.1.3). 참고: H&E 스테인드 슬라이드의 경우 확장 과정에서 얼룩이 제거됩니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>OCT 용액의 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드<ol>
<li>조직을 -20 °C에서 10 분 동안 아세톤으로 고정하십시오.</li>
			<li>RT에서 각각 10분 동안 1x PBS 용액으로 샘플을 3회 세척합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이전에 고정, 냉동 임상 조직 슬라이드<ol>
<li>RT에서 2분 동안 슬라이드를 인큐베이션하여 OCT 용액을 녹입니다.</li>
			<li>RT에서 각각 5분 동안 1x PBS 용액으로 샘플을 3회 세척합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>포맷 변환 후 모든 샘플에서 항원 검색을 위한 열처리를 수행합니다.
	<ol>
<li>슬라이드 염색 용기와 같은 내열 용기에 20mMM 구연산액(RT의 pH 8)을 넣습니다. 참고: 슬라이드에 장착 된 조직을 덮을 수있는 충분한 해결책이 있어야합니다 (표준 슬라이드 염색 항아리의 경우 50 mL).</li>
		<li>구연산액을 전자레인지에서 100°C로 가열하고 슬라이드를 용액에 놓습니다. 용기를 즉시 인큐베이션 챔버로 옮기고 60°C에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 페트리 접시에 넣고 1x PBS로 덮고 4 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>표준 면역 형광 (IF)/면역 성 화학 (IHC) 염색 프로토콜을 사용 하 여 샘플을 염색. 참고: 특정 1차 및 2차 항체 농도 및 염색 기간은 제조업체가 제안한 농도 또는 특정 실험에 대한 최적화에 따라 달라집니다.<ol>
<li>소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위에 경계를 그려 조직을 덮는 데 필요한 용액의 부피를 최소화하십시오. 슬라이드를 슬라이드에 맞을 만큼 충분히 큰 접시에 놓습니다. 표준 3인치 슬라이드의 경우 100mm 페트리 접시를 사용하십시오. 참고: 소수성 펜은 샘플의 중합이나 소화 과정을 방해하지 않습니다.</li>
		<li>비특이적 결합을 줄이기 위해 37°C에서 1시간, RT에서 2시간 또는 4°C로 밤새 차단 완충액으로 조직을 배양합니다.</li>
		<li>준비된 차단 완충제(또는 다른 바람직한 염색 완충제)의 적당한 양에서 원하는 농도로 1차 항체를 희석한다. 1차 항체 용액으로 조직을 RT 또는 37°C에서 3시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 참고: 시료는 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해 가습 용기(예: 젖은 물티슈가 있는 페트리 접시)에 보관해야 합니다. 전형적으로, 항체는 사용된 조직 크기 및 항체에 따라 완충액의 200-500 μL에서 1:100-1:500으로 희석되었다.</li>
		<li>준비된 차단 완충제(또는 기타 바람직한 세척 완충제)로 티슈를 RT에서 10분 동안 3회 세척한다.</li>
		<li>희석 보조 항체 (및 300 nM 4′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] 원하는 경우), 준비 된 차단 버퍼 (또는 다른 바람직한 염색 완충제) 약 10 μg/mL의 농도로. 이차 항체 용액에서 조직을 RT 또는 37°C에서 적어도 1시간 동안 배양한다. 참고: 타이밍은 사용되는 항체 및 조직의 두께에 따라 조절될 수 있다. 시안 염료를 함유하는 이차 항체(Cy3, Cy5, Alexa 647)는 사전 중합을 적용했을 때 ExM 프로토콜과 호환되지 않는다. 제안된 염료로는 알렉사 488(녹색), 알렉사 546(주황색/빨간색), Atto 647N 또는 CF633(원색)이 있습니다. DAPI는 확장 프로세스 중에 세척되기 때문에 확장 후 다시 적용해야 합니다.</li>
		<li>준비된 차단 완충제(또는 기타 바람직한 세척 완충제)로 조직을 RT에서 각각 10분 동안 3회 세척한다. 참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드는 페트리 접시에 넣고 1x PBS로 덮고 4 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>기존의 광시야 현미경, 공초점 현미경 또는 기타 선택 된 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다. 참고: 이 단계는 확장 전 및 후 이미지를 비교하여 확장 계수를 사용하여 생물학적 길이를 결정하는 데 필요합니다. 확장 후 이미징을 용이하게 하기 위해 쉽게 식별할 수 있는 관심 영역을 선택하고 저배율과 높은 배율모두에서 이미지를 수집해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 시편의 시투 중합
<ol><li>
고정 용액에 시편을 배양합니다.
	<ol>
<li>알데히드 고정제로 고정된 시료의 경우 1x PBS로 AcX 스톡 솔루션을 0.03 mg/mL로 희석하거나 알데히드 고정제로 고정된 시료의 경우 0.1 mg/mL의 농도로 고정 용액을 준비합니다(일반적으로 250 μL은 조직 부분을 덮기에 충분합니다). , AcX와 반응할 수 있는 자유 아민이 적습니다.</li>
		<li>슬라이드를 100mm 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직 위에 파이펫합니다. RT에서 3시간 이상 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
겔화 용액에서 샘플을 배양합니다.
	<ol>
<li>겔화 용액의 적어도 100 배 과잉 볼륨을 준비하십시오. 200 μL당, 다음을 결합하여, 단량제 용액 188 μL, 0.5% 4HT 스톡 용액 4 μL(1:50 희석, 최종 농도: 0.01%), 10% TEMED 스톡 솔루션 4μL(1:50 희석, 최종 농도 0.2%), 10% APS 스톡 솔루션 4 μL(1:50 APS 스톡 솔루션) 희석, 최종 농도 0.2%). 참고: 겔화 용액은 사용하기 직전에 만들어야합니다. 용액은 4 °C에서 유지되어야하며 APS 용액은 조기 겔링을 방지하기 위해 마지막으로 첨가해야합니다.</li>
		<li>조직 섹션에서 여분의 용액을 제거하고 100mm 페트리 접시에 슬라이드를 놓습니다. 시료에 신선하고 차가운 겔화 용액을 추가하고 4 °C에서 30 분 동안 조직에 혼합물을 배양하여 용액을 조직으로 확산시도록하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
겔화 용액을 방해하지 않고 샘플 주위의슬라이드(그림 2A)에 챔버를 시공합니다.
	<ol>
<li>다이아몬드 나이프를 사용하여 커버 유리의 조각을 얇게 절단하여 겔링 챔버용 스페이서를 만듭니다. 참고: 이미징 포스트 확장을 용이하게하기 위해, 스페이서는 조직 위의 빈 젤의 양을 줄이기 위해 조직 표본에 두께에 근접해야합니다. 번호 1.5 유리는 표준 임상 샘플 (5−10 μm)에 사용할 수 있습니다. 두꺼운 샘플을 위해 커버 유리 조각을 적층 할 수 있습니다.</li>
		<li>물방울(~10 μL)을 사용하여 조직의 양쪽에 스페이서를 고정합니다.</li>
		<li>뚜껑 유리 뚜껑을 슬라이드 위에 조심스럽게 놓고 기포가 조직에 끼지 않도록하십시오(그림 2B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>습한 환경(예: 젖은 물티슈로 닫힌 페트리 접시)에서 37°C에서 시료를 2시간 동안 배양합니다. 참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 슬라이드 챔버는 4°C에서 밀봉된 페트리 접시 내부에 보관될 수 있다.</li>
</ol>4. 샘플 소화
<ol><li>
커버슬립 아래에 면도날을 부드럽게 밀어 내고 커버슬립을 젤 표면에서 천천히 들어 올려 겔링 챔버의 뚜껑을 제거합니다. 부피를 최소화하기 위해 티슈 주위에 빈 젤을 다듬습니다. 균질화 후 겔의 배향을 추적하기 위해 젤을 비대칭으로 자르고, 샘플이 투명해지기 때문에.
	<ol>
<li>사용 전에 소화 완충제(최종 농도 4 U/mL)에서 ProK를 1:200씩 희석하십시오. 젤을 완전히 잠글 수있는 충분한 용액을 준비하십시오. 4웰 플라스틱 세포 배양 플레이트의 단일 웰은 웰당 적어도 3 mL을 필요로 합니다.</li>
		<li>60°C에서 3시간 동안 소화 완충액을 포함하는 밀폐용기에 샘플을 인큐베이션한다. 시료가 소화 중에 슬라이드에서 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 샘플을 부드럽게 제거합니다. 참고: 시편은 시료가 건조되는 것을 방지하기 위해 소화 버퍼에 완전히 잠겨 필름으로 밀봉 할 수있는 덮인 용기 (작은 슬라이드 상자, 플라스틱 우물, 페트리 접시 등)에 놓아야합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 견본 확장 및 화상 진찰
<ol><li>부드러운 페인트 브러시를 사용하여 원하는 이미징 시스템과 호환되는 용기에 시편을 1x PBS로 옮기고 완전히 확장된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽합니다. 조직이 뒤집힌 시스템에 이미징하는 경우 또는 업라이트 시스템에 이미징하는 경우 시료 측을 아래로 배치하여 이미징 목표에서 샘플까지의 거리를 최소화해야 합니다. 필요한 경우 부드러운 페인트 브러시로 젤을 뒤집습니다. 참고: LED의 측면 조명을 사용하여 액체에 표시할 수 있습니다. 표준 6웰 플레이트는 직경이 0.6cm 미만인 시료를 수용할 수 있습니다. 유리 바닥 우물 플레이트는 반전 된 시스템에서 이미징에 사용해야합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서 1x PBS로 10분 동안 세척합니다. 원하는 경우, 소화 과정이 DAPI 얼룩을 씻어 내면서 300 nM DAPI로 샘플을 다시 염색하십시오. 300 nM DAPI로 PBS를 제거하고 RT에서 20 분 동안 1x PBS로 희석 한 다음 RT에서 1x PBS로 10 분 세척하십시오. 참고: 시료는 1x PBS로 덮고 다음 단계로 진행하기 전에 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플을 확장하려면 PBS를 교체하고 RT에서 각각 10 분 동안 ddH2O (최종 젤 부피의 최소 10 배)의 초과 부피로 3-5 회 세척하십시오. 참고: 3rd 또는 4세척 후, 표본의 확장은 고원에 시작해야합니다. 저장을 위해, 세균 성장을 방지하기 위해, ddH2O는 0.002%-0.01% 나트륨 아지드(NaN3)로보충될 수 있다. 이 경우 최종 확장 계수는 가역적으로 10% 감소합니다.</li>
	<li>기존의 광시야 현미경, 공초점 현미경 또는 기타 선택 된 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다. 참고: 젤이 표류하는 것을 방지하기 위해, 과잉 액체는 우물에서 제거 될 수있다. 젤은 또한 1.5-2% 저용융 아가로즈로 고정화될 수 있습니다. 용액의 부피의 2-4배인 용기에 물에 1.5-2%(v) 저용융 아가로스를 준비합니다. 용액을 용액을 용액을 녹이려면 40°C 수조 또는 전자레인지에서 10-20s로 데우면 됩니다. 젤의 가장자리 주위에 녹은 아가로오스를 피펫. 아가로즈가 RT 또는 4°C에서 경화하도록 허용한 후, 시료에 물을 추가하여 탈수를 방지합니다.</li>
</ol>

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</ol>

YZ 및 OB는 여기에 기재된 기술의 하위 집합에 대해 특허 보호를 출원하고 획득한 발명자 중 2명입니다(미국 특허 US20190064037A1, WO2018157074A1 및 WO201815704A1 및 WO201815704A1).

여기에서는 FFPE, H&E 스테인드 및 유리 슬라이드에 새로 얼어붙은 시편을 포함하여 병리학에 사용되는 가장 일반적인 유형의 임상 생검 샘플에 적용할 수 있는 proExM5의 변형인 ExPath 프로토콜16을제시합니다. 견본의 포맷 변환, 항원 회수 및 면역 염색은 ExPath에 특이적이지 않은 일반적으로 사용되는 프로토콜을 따릅니다. 원래 proExM 프로토콜9와는 달리, ExPath는 원래 ExPath 연구16에서입증 된 바와 같이, 포르말린 고정 조직의 확장을 향상 소화 버퍼에 EDTA의 높은 농도에 의존한다. 이 프로토콜은 5-10 μm 두께의 임상 시편16에서검증되었지만, 일부 변형을 통해 두꺼운 조직 샘플에도 적용될 수 있었다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 겔화 단계의 타이밍...

3차원(3D) 맥락에서 조직의 분자 조직을 조사하면 생물학적 기능과 질병 발달에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이러한 나노 스케일 환경은 최소 한용화 거리, dα/λ NA에 의해 정의되는 종래의 회절 제한 현미경(200−300 nm)의 분해 능을 넘어서는  것이다. 여기서 λ는 빛의 파장이고 NA는 이미징 시스템의 수치 개구부(NA)이다. 최근에는 형광 표지된 분자의 직접 시각화가 새롭게 개발된 초고해상도 이미징 기술1,2,3,자극방출 고갈(STED)을 포함하여 가능해졌으며, 사진 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM), 연속 광학 재건 현미경 검사법 (STORM), 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM). 이러한 이미징 기술은 나노 스케일에서 생물학적 기능에 대한 이해에 혁명을 일으켰지만 실제로는 고가의 및 /또는 특수 장비 및 이미지 처리 단계에 의존하는 경우가 많으며, 광 이미징과 같은 특정 특성을 가진 형광단이 필요합니다(예: 광 스위칭 기능 및/또는 높은 광 안정성). 또한, 조직 시편에서 3D 초고해상도 이미징을 수행하는 것은 여전히 과제입니다.
2015년4월에처음 도입된 확장 현미경 검사법(ExM)은 팽창성 폴리전해질 하이드로겔에 내장된 보존된 샘플을 물리적으로 확장하여 나노스케일 기능(&70 nm)을 이미징하는 대체 수단을 제공합니다. 여기서 주요 생체 분자 및/또는 라벨은 화학 처리 후 동위원소로 확장될 수 있는 폴리머 네트워크에 자리에 고정됩니다. 물리적 팽창은 총 유효 해상도를 증가하기 때문에, 관심 있는 분자는 기존의 회절 제한 이미징 시스템을 사용하여 해결될 수 있다. 사용자 정의 합성 형광 라벨이 폴리머 네트워크에 고정 된 원래 프로토콜의 출판 이후4,새로운 전략은 직접 단백질을 고정하는 데 사용되었습니다 (단백질 보존 ExM, 또는 proExM)5, 6,7,8,9 및 RNA9, 10,11,12를 하이드로겔로, 반복을 통해 물리적 배율을 증가시다. 확장13 또는 적응 젤 화학8,14,15.
여기에서 우리는 임상 병리학 형식에 최적화된 확장 병리학 (ExPath)16에게불린 proExM의 적응된 버전을 제시합니다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE), 헤마톡신 및 에오신(H&E) 스테인드, 유리 슬라이드에 장착된 신선 냉동 인간 조직 표본을 포함한 임상 샘플을 ExM과 호환되는 상태로 변환합니다. 단백질은 하이드로겔에 고정되고 기계적 균질화가 수행된다(도1)16. 시료의 4배 선형 팽창을 통해~ ~300 nm 해상도만을 갖는 기존의 공초점 현미경을 사용하여 다중 컬러 초고해상도(~70nm) 이미지를 얻을 수 있으며 다른 초고해상도 이미징 기술과도 결합될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td>억제제</td></tr><tr><td>6-well 유리 바닥 플레이트 (#1.5 커버 유리)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>피셔 Scientifc</td><td>A18-500</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl-X, SE (AcX)</td><td>Invitrogen</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄 (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Initiatior</td></tr><tr><td>Anti-ACTN4 항체 토끼에서 생산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HPA001873</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen IV 항체 마우스</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-59814</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin 항체 닭고기에서 생산</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Hold II 소수성 펜</td><td>Scientific Device</td><td>980402</td><td></td></tr><tr><td>Breast Common Disease Tissue Array</td><td>Abcam</td><td>ab178113</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (1 mg/mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>다이아몬드 나이프 No. 88 CM</td><td>일반 도구</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 산(EDTA) 0.5M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>FFPE 신장 샘플</td><td>USBiomax</td><td>HuFPT072</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 닭 IgY(H+L), 고도의 교차 흡착 CF488A</td><td>비오티움</td><td>20020</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 치킨 IgY(H+L), 고도의 교차 흡착 CF633</td><td>비오티움</td><td>20121</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsosbed Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>MAXbind 염색 매체</td><td>Active Motif</td><td>15253</td><td>선택한 비상업적 staning buffer로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MAXblock 차단 매체</td><td>활성 모티프</td><td>15252</td>는 <td>선택한 비상업적 차단 버퍼로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MAXwash 세척 매체</td><td>액티브 모티프</td><td>15254</td><td>선택한 비상업적 세척 버퍼로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 #1 (24 mm x 60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 #1.5 (24 mm x 60 mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>가속기</td></tr><tr><td>N,N&prime;-메틸렌비스아크릴아미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td>블로킹 버퍼를 제조하기 위해. 2차 항체의 동물 숙주에 의존합니다.</td></tr><tr><td>Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish 세포 배양 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td>167063</td><td>Multi-well 플라스틱 문화 접시</td></tr><tr><td>Nunclon 6-Well 세포 배양 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL&nbsp; 원뿔형</td><td>써모 피셔</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL&nbsp; 원뿔형</td><td>Thermo Fisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS), 10x 용액</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시(100mm)</td><td>Fischer Scientifc</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K ( 분자 생물학 등급)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Safelock 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>소듐 아크릴레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>408220</td><td></td></tr><tr><td>소듐 클로라이드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨 삼염기성 이수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientifc</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>CF640R</td><td>Biotium</td><td>29026</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td>로 표지된 밀 배아 응집소</td></tr></tbody></table>

물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징

Nanoscopic Imaging of Human Tissue Sections via Physical and Isotropic Expansion

현대 병리학에서 광학 현미경 검사는 임상 표본의 현미경 구조를 밝혀 질병 진단에 중요한 역할을합니다. 그러나, 근본적인 물리적 회절 한계는 기존의 광학 화상 진찰 접근을 사용할 때 나노 규모 해부학 및 미묘한 병리학 적인 변경의 심문을 방지합니다. 여기에서, 우리는 임상 1 차 조직 견본의 일반적인 모형의 나노 규모 광학 화상 진찰을 위한 확장 병리에게 불린 간단하고 저렴한 프로토콜을 기술합니다, 둘 다 고정 된 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직을 포함하 섹션. 이 방법은 조직 샘플을 화학적으로 조직 하이드로겔 하이브리드로 변환하고 순수한 물의 여러 비늘에서 등열대로 물리적으로 확장하여 광학 회절 한계를 우회합니다. 확장으로 인해 이전에는 해결할 수 없는 분자가 분리되어 기존의 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.

프로토콜이 성공적으로 수행된경우(그림 1),샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 겔로 나타나며(그림3A)물 속에서 3−4.5배의 비율로 확장할 수 있음(그림3B) ~70nm의 유효 분해능을 제공하는 최종 팽창계수 및 이미징 시스템은5,16을사용한다. 도 4는 ExPath 프로토콜을 사용하여 처리된 5 μm 두께의 FFPE 신장 샘플의 예시를 나타낸다. 겔화 된 샘플의 전체 팽창은 물에서 4.5 배 확장 인자를 초래하여 0.95 NA 목표를 사용하여 이미지 화 할 때 ~ 63 nm의 효과적인 분해능을 제공합니다. 조직은 먼저 파라핀을 제거하고 재수화(섹...

임상 조직 견본의 나노 규모 화상 진찰은 질병 병인의 이해를 향상할 수 있습니다. 확장 병리학 (ExPath)은 표준 임상 조직 샘플과의 호환성을 위해 변형 된 확장 현미경 검사법 (ExM)의 버전으로, 기존의 회절 제한된 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 스케일 구성을 탐구합니다.

In modern pathology, optical microscopy plays an important role in disease diagnosis by revealing microscopic structures of clinical specimens. However, ...

우리는 나노 스케일 정밀도로 표준 임상 조직 섹션에 대한 관심의 이미지 생체 분자에 대한 저렴한 비용 측정, 확장 병리학, 또는 ExPath를 제시하고 있습니다. ExPath는 기존의 광 현미경으로 분리되고 관찰할 수 있도록 화학적으로 물 팽창 하이드로겔로 임상 조직 섹션을 주입한 다음 처리된 샘플을 약 100배 정도 물리적으로 균등하게 확장함으로써 종래의 광 현미경검사의 회절 한계를 우회한다. ExPath를 사용하면 새로운 이미징 하드웨어에 투자할 필요 없이 조직 샘플에서 질병 관련 생체 분자의 나노 스케일 구성을 연구할 수 있습니다.따라서 질병의 새로운 통찰력을 가능하게하고 새로운 진단을 육성합니다. 이 방법은 광범위한 조직 유형에 적용될 수 있으며 암, 뇌 질환, 자가 면역 질환 등과 같은 다양한 복잡한 질병의 발병기유발에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 시각 데모는 겔화 챔버의 생성 과 단백질 제 K 소화 전후의 겔화 시료를 처리하는 등 중요한 단계를 제대로 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다.먼저 관심 있는 조직을 ExPath 호환 형식으로 변환합니다. FFPE 임상 샘플로 작업하는 경우 50ml 원문 튜브에 샘플과 함께 슬라이드를 배치하고 15ml의 Zylene을 추가하십시오. 튜브를 캡하고 약 60rpm에 궤도 셰이커에 수평으로 3 분 동안 놓습니다.다른 15ml의 질렌으로 씻는 것을 반복합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 일련의 에탄올 희석제로 슬라이드를 씻으십시오. 스테인드 및 마운트 영구 슬라이드로 작업하는 경우 각 슬라이드를 50ml 원식 튜브에 넣고 Zylene으로 덮습니다.면도날로 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이어서, FFPE 임상 샘플과 동일한 방식으로 슬라이드를 처리한다. OCT 용액에서 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드로 작업하는 경우, 10 분 동안 20섭씨20도에서 아세톤으로 조직을 수정한 다음 세척 당 10 분 동안 1X PBS 용액으로 샘플을 세 번 씻으십시오.이전에 고정 및 냉동 임상 샘플을 처리하는 경우, OTC 용액을 녹일 실온에서 2 분 동안 슬라이드를 두고, 세척 당 5 분 동안 1X PBS로 샘플을 세 번 세척하십시오. 포맷 변환 후 모든 샘플에서 항원 검색을 수행합니다. 20 밀리머 구연산용액을 전자레인지에 섭씨 100도로 가열하고 슬라이드를 용액에 놓습니다.즉시 용기를 인큐베이션 챔버로 옮기고 섭씨 60도에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 시료를 염색하려면 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위의 경계를 그립니다. 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 30°C에서 1시간 동안 버퍼를 차단하여 조직을 배양합니다.이어서, 실온 또는 섭씨 37도에서 적어도 3시간 동안 1차 항체 용액으로 조직을 배양한다. 인큐베이션 후, 차단 완충제로 조직을 세 번 세척하고 실온또는 섭씨 37도에서 적어도 1시간 동안 이차 항체 용액에 배양한다. 차단 버퍼로 세척을 반복한 다음 기존의 광시야 현미경 또는 기타 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.원고 지침에 따라 앵커링 솔루션을 준비합니다. 슬라이드를 100ml 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직에 파이프로 고정하고 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 원고 의 방향에 따라 젤링 솔루션을 준비합니다.티슈 섹션에서 과도한 고정 용액을 제거하고 슬라이드를 다시 페트리 접시에 넣습니다. 신선한 차가운 젤링 용액을 샘플에 추가하고 4섭씨에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 샘플 주위슬라이드에 챔버를 구성하려면 다이아몬드 나이프로 커버 글래스 조각을 얇게 절단하여 스페이서를 만듭니다.티슈 양쪽의 스페이서를 물로 고정하고 조심스럽게 슬라이드 위에 커버글래스 뚜껑을 배치하여 조직에 기포가 포획되는 것을 피하십시오. 그런 다음 가습 환경에서 섭씨 37도에서 샘플을 2시간 동안 배양합니다. 커버슬립 아래에 면도날을 부드럽게 슬라이딩하고 천천히 젤 표면에서 들어 올려 겔 챔버의 뚜껑을 제거합니다.부피를 최소화하기 위해 조직 주위의 빈 젤을 다듬어 방향을 추적하기 위해 비대칭으로 젤을 잘라내십시오. 단백질을 희석 한 1 ~ 200 개의 소화 버퍼를 희석하여 젤을 완전히 잠수할 수있는 충분한 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 60°C에서 3시간 동안 밀폐용기에 용액으로 샘플을 배양한다.소화 중에 샘플이 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 부드럽게 제거하십시오. 소프트 페인트 브러시를 사용하여 시편을 원하는 이미징 시스템과 호환되는 용기에 1X PBS로 옮기고 완전히 확장된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽좋습니다. PBS에서 샘플을 10분 동안 세척하고 원하는 경우 300 밀리머 DAPI로 샘플을 세척하십시오.세척당 10분 동안 3~5회 이중 증류수의 과잉 부피로 샘플을 세척하여 시료를 확장합니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행합니다. 이 프로토콜이 성공적으로 수행되면, 샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 젤로 나타나며 물에서 3 ~ 4.5의 비율로 확장 할 수 있습니다.5 마이크로미터 두께의 FFPE 신장 샘플은 4.5배 확장되어 0.95 NA 목표를 사용하여 63나노미터의 해상도를 생성했습니다. 조직은 그 때 확장 병리학 호환 형식으로 변환되고 알파 액틴 4및 Vimentin를 위한 항체로 염색되었습니다, 핵 DNA를 시각화하기 위하여 DAPI, 및 밀 게르마 글루텐in는 탄수화물을 표지하기 위하여. 회전 디스크 공초점 현미경 검사는 시편을 이미지하는 데 사용되었다.신장 조직은 그 때 완전히 물에서 확장하고 다시 심상화되었습니다. 표지된 대상의 균열, 왜곡 및 손실은 부적절한 앵커링 또는 균질화의 결과일 수 있습니다. Hematoxylin 및 eosined 정상 유방 조직은 FFPE 샘플로 취급되었다, 확장, DAPI로 표시, 회전 디스크 공초점 현미경에 이미지.고정되지 않은 신장 조각도 이 프로토콜을 사용하여 처리되었습니다. 조직은 차가운 아세톤에 고정되고 알파 액틴 4, 비멘틴, DAPI 및 밀 게르마 글루텐로 얼룩졌습니다. 이 기술을 수행할 때, 겔화 단계의 타이밍이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.조기 겔화는 왜곡을 일으킬 수 있으며 확장을 제한하며 표적 분자의 손실을 초래할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 형광 화상 진찰은 샘플의 소화 및 확장 후에 현미경에 수행될 수 있습니다. ExPath는 병리학 과 그 너머 모두에서 광범위하게 적용할 수 있습니다.그것은 연구원이 관심있는 조직 견본에 있는 미묘한 세부사항을 시각화하는 가능하게 합니다. 따라서, 그것은 질병 또는 생물학적 과정의 메커니즘의 병기에서 새로운 통찰력을 얻기 위해 연구원을 도울 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 나노 단위 구조의 현미경 검사를 위해 폴리머 네트워크를 사용하여 임상 조직 표본을 화학적으로 확장하는 확장 현미경 검사의 변형인 확장 병리학이라는 방법에 대해 설명합니다.

확장 병리학: 임상 조직 샘플의 고해상도 광학 이미징 방법

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

여기, 우리는 프로토콜 사용 하 여 3 차원 (3D) 이미지 인간의 췌 섹션을 최적화 수동 삭제 방법 제시. 이 원고에서는 수동 광 비운 뒤에 여러 면역 형광 인간의 독도 innervating 자율 고 감각 신경 네트워크의 핵심 요소를 식별 하기 위해 얼룩에 대 한이 절차를 보여 줍니다.

인간의 췌 장 신경 섬 네트워크의 고해상도 3D 이미징

이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇...

큰 볼륨 내에서 특정 세포 목표를 찾아내기를 위한 직렬 섹션의 복합 계층적 이미징

X선 컴퓨터 단층 촬영을 위해 설계된 X선 특이적 염색 방법을 사용하여 현미경 조직 구조의 3D 시각화프로토콜이 제시된다.

X선 특이적 염색 방법 및 나노스코픽 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 연조직 시료의 3D 이미징

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

암 면역 요법 시대에, 종양 미세 환경 역학을 밝히는 것에 대한 관심이 눈에 띄게 증가했습니다. 이 프로토콜은 염색 및 이미징 단계와 관련하여 질량 분광법 이미징 기술을 자세히 설명하므로 고도로 다중화 된 공간 분석이 가능합니다.

포르말린 고정 및 파라핀 임베디드 조직 샘플의 질량 분광법 이미징을 사용하여 종양 미세 환경에 대한 이해 확대

여기에 제시된 확장 현미경(ExM)의 새로운 버전인 Magnify는 최대 11배 확장을 위해 수정되어 포괄적인 생체 분자 클래스 배열을 보존하고 광범위한 조직 유형과 호환됩니다. 이를 통해 기존의 회절 제한 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 크기 구성을 조사할 수 있습니다.

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy(11배 팽창 현미경을 통한 범용 분자 유지)

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

여기서는 냉동 고정 및 확장 현미경 기법(Cryo-ExM)을 결합한 상세 프로토콜을 제시하여, 다양한 생물학적 샘플에 적응된 구조 보존과 고해상도 영상을 가능하게 합니다. 생물학적 샘플은 냉동되어 팽창성 폴리머에 삽입되고, 변성, 팽창, 면역표지되어 표준 광학 현미경으로 초해상도 영상을 가능하게 합니다.

확장 현미경: 기존 현미경을 이용한 고해상도 형광 영상

우리는 광학 다층 간섭 단층촬영(OMLIT)이라는 새로운 영상 기술을 도입했는데, 이는 뇌 표본의 모든 세포를 중간 규모에서 편향 없이 촬영할 수 있게 하며, 동일한 샘플에 대한 테이프 기반 직렬 주사 전자현미경의 영상 워크플로우에 원활하게 통합할 수 있게 합니다.

중간경적 전세포 뇌 지도화를 위한 주사 전자현미경 호환 광학 영상 방법

배우세요 확장 병리학(ExPath)을 활용한 인간 조직 섹션의 나노스케일 이미징 기법을. 수소겔 주입과 물리적 확장으로 형광 표지 생체분자를 분리 관찰하여 암 및 자가면역 질환 등 복잡한 질병의 병인 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징

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