물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징

우리는 나노 스케일 정밀도로 표준 임상 조직 섹션에 대한 관심의 이미지 생체 분자에 대한 저렴한 비용 측정, 확장 병리학, 또는 ExPath를 제시하고 있습니다. ExPath는 기존의 광 현미경으로 분리되고 관찰할 수 있도록 화학적으로 물 팽창 하이드로겔로 임상 조직 섹션을 주입한 다음 처리된 샘플을 약 100배 정도 물리적으로 균등하게 확장함으로써 종래의 광 현미경검사의 회절 한계를 우회한다. ExPath를 사용하면 새로운 이미징 하드웨어에 투자할 필요 없이 조직 샘플에서 질병 관련 생체 분자의 나노 스케일 구성을 연구할 수 있습니다.

따라서 질병의 새로운 통찰력을 가능하게하고 새로운 진단을 육성합니다. 이 방법은 광범위한 조직 유형에 적용될 수 있으며 암, 뇌 질환, 자가 면역 질환 등과 같은 다양한 복잡한 질병의 발병기유발에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 시각 데모는 겔화 챔버의 생성 과 단백질 제 K 소화 전후의 겔화 시료를 처리하는 등 중요한 단계를 제대로 수행하는 방법을 설명하는 것이 중요합니다.

먼저 관심 있는 조직을 ExPath 호환 형식으로 변환합니다. FFPE 임상 샘플로 작업하는 경우 50ml 원문 튜브에 샘플과 함께 슬라이드를 배치하고 15ml의 Zylene을 추가하십시오. 튜브를 캡하고 약 60rpm에 궤도 셰이커에 수평으로 3 분 동안 놓습니다.

다른 15ml의 질렌으로 씻는 것을 반복합니다. 그런 다음 원고 방향에 따라 일련의 에탄올 희석제로 슬라이드를 씻으십시오. 스테인드 및 마운트 영구 슬라이드로 작업하는 경우 각 슬라이드를 50ml 원식 튜브에 넣고 Zylene으로 덮습니다.

면도날로 커버 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 이어서, FFPE 임상 샘플과 동일한 방식으로 슬라이드를 처리한다. OCT 용액에서 고정되지 않은 냉동 조직 슬라이드로 작업하는 경우, 10 분 동안 20섭씨20도에서 아세톤으로 조직을 수정한 다음 세척 당 10 분 동안 1X PBS 용액으로 샘플을 세 번 씻으십시오.

이전에 고정 및 냉동 임상 샘플을 처리하는 경우, OTC 용액을 녹일 실온에서 2 분 동안 슬라이드를 두고, 세척 당 5 분 동안 1X PBS로 샘플을 세 번 세척하십시오. 포맷 변환 후 모든 샘플에서 항원 검색을 수행합니다. 20 밀리머 구연산용액을 전자레인지에 섭씨 100도로 가열하고 슬라이드를 용액에 놓습니다.

즉시 용기를 인큐베이션 챔버로 옮기고 섭씨 60도에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 시료를 염색하려면 소수성 펜을 사용하여 슬라이드의 조직 섹션 주위의 경계를 그립니다. 슬라이드를 페트리 접시에 넣고 30°C에서 1시간 동안 버퍼를 차단하여 조직을 배양합니다.

이어서, 실온 또는 섭씨 37도에서 적어도 3시간 동안 1차 항체 용액으로 조직을 배양한다. 인큐베이션 후, 차단 완충제로 조직을 세 번 세척하고 실온또는 섭씨 37도에서 적어도 1시간 동안 이차 항체 용액에 배양한다. 차단 버퍼로 세척을 반복한 다음 기존의 광시야 현미경 또는 기타 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징을 수행합니다.

원고 지침에 따라 앵커링 솔루션을 준비합니다. 슬라이드를 100ml 페트리 접시에 놓고 고정 용액을 조직에 파이프로 고정하고 실온에서 최소 3시간 동안 배양합니다. 그런 다음 원고 의 방향에 따라 젤링 솔루션을 준비합니다.

티슈 섹션에서 과도한 고정 용액을 제거하고 슬라이드를 다시 페트리 접시에 넣습니다. 신선한 차가운 젤링 용액을 샘플에 추가하고 4섭씨에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 샘플 주위슬라이드에 챔버를 구성하려면 다이아몬드 나이프로 커버 글래스 조각을 얇게 절단하여 스페이서를 만듭니다.

티슈 양쪽의 스페이서를 물로 고정하고 조심스럽게 슬라이드 위에 커버글래스 뚜껑을 배치하여 조직에 기포가 포획되는 것을 피하십시오. 그런 다음 가습 환경에서 섭씨 37도에서 샘플을 2시간 동안 배양합니다. 커버슬립 아래에 면도날을 부드럽게 슬라이딩하고 천천히 젤 표면에서 들어 올려 겔 챔버의 뚜껑을 제거합니다.

부피를 최소화하기 위해 조직 주위의 빈 젤을 다듬어 방향을 추적하기 위해 비대칭으로 젤을 잘라내십시오. 단백질을 희석 한 1 ~ 200 개의 소화 버퍼를 희석하여 젤을 완전히 잠수할 수있는 충분한 솔루션을 준비하십시오. 그런 다음 60°C에서 3시간 동안 밀폐용기에 용액으로 샘플을 배양한다.

소화 중에 샘플이 분리되지 않으면 면도날을 사용하여 부드럽게 제거하십시오. 소프트 페인트 브러시를 사용하여 시편을 원하는 이미징 시스템과 호환되는 용기에 1X PBS로 옮기고 완전히 확장된 젤을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큽좋습니다. PBS에서 샘플을 10분 동안 세척하고 원하는 경우 300 밀리머 DAPI로 샘플을 세척하십시오.

세척당 10분 동안 3~5회 이중 증류수의 과잉 부피로 샘플을 세척하여 시료를 확장합니다. 그런 다음 형광 이미징을 수행합니다. 이 프로토콜이 성공적으로 수행되면, 샘플은 기계적 균질화 후 평평하고 투명한 젤로 나타나며 물에서 3 ~ 4.5의 비율로 확장 할 수 있습니다.

5 마이크로미터 두께의 FFPE 신장 샘플은 4.5배 확장되어 0.95 NA 목표를 사용하여 63나노미터의 해상도를 생성했습니다. 조직은 그 때 확장 병리학 호환 형식으로 변환되고 알파 액틴 4및 Vimentin를 위한 항체로 염색되었습니다, 핵 DNA를 시각화하기 위하여 DAPI, 및 밀 게르마 글루텐in는 탄수화물을 표지하기 위하여. 회전 디스크 공초점 현미경 검사는 시편을 이미지하는 데 사용되었다.

신장 조직은 그 때 완전히 물에서 확장하고 다시 심상화되었습니다. 표지된 대상의 균열, 왜곡 및 손실은 부적절한 앵커링 또는 균질화의 결과일 수 있습니다. Hematoxylin 및 eosined 정상 유방 조직은 FFPE 샘플로 취급되었다, 확장, DAPI로 표시, 회전 디스크 공초점 현미경에 이미지.

고정되지 않은 신장 조각도 이 프로토콜을 사용하여 처리되었습니다. 조직은 차가운 아세톤에 고정되고 알파 액틴 4, 비멘틴, DAPI 및 밀 게르마 글루텐로 얼룩졌습니다. 이 기술을 수행할 때, 겔화 단계의 타이밍이 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

조기 겔화는 왜곡을 일으킬 수 있으며 확장을 제한하며 표적 분자의 손실을 초래할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 형광 화상 진찰은 샘플의 소화 및 확장 후에 현미경에 수행될 수 있습니다. ExPath는 병리학 과 그 너머 모두에서 광범위하게 적용할 수 있습니다.

그것은 연구원이 관심있는 조직 견본에 있는 미묘한 세부사항을 시각화하는 가능하게 합니다. 따라서, 그것은 질병 또는 생물학적 과정의 메커니즘의 병기에서 새로운 통찰력을 얻기 위해 연구원을 도울 수 있습니다.