Name: 루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 루시퍼 황색 이온토포레시스를 이용한 성상세포 형태 시각화 기법으로, 쥐 뇌 조직에서 미세한 세포 돌기와 신경세포 상호작용을 정밀 분석하는 방법입니다.

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저자는 소토 씨, 유 박사, 옥토 박사에게 지도와 텍스트에 대한 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NS060677에서 지원됩니다.

이 연구에서 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하 고 캘리포니아 대학에서 총리의 동물 연구 위원회에 의해 승인 되었다, 로스 앤젤레스. 성인 마우스(6-8주령)의 혼성 성생을 모든 실험에서 사용하였다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>
인공 뇌척수액 (ACSF) 용액
	<ol>
<li>각 실험 전에 신선한 ACSF 용액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,14.7 mM NaHCO3,11 mM D-glucose, 1.25 mMNa2HPO4,및 2 mM CaCl2)을준비한다. 마지막 단계에서 MgCl2와 CaCl2를 추가합니다. 성분을 고품질 탈이온수에 용해시면 됩니다.</li>
		<li>ACSF 용액을 수조및 기포에서 35°C에서 배양하고 실험 전 30분 동안 95%O2/5%CO2를 배양하였다.</li>
		<li>ACSF (100 mL)에서 0.02 %의 최종 농도에 도달하기 위해 2 % 리도카인 염산염을 추가하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
픽서솔루션
	<ol>
<li>10% 포르말린 완충 인산염을 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LY 염료 용액
	<ol>
<li>5 mM KCl. 소용돌이에 LY CH 딜리튬 염 또는 LY CH 디포타슘 염을 용해시켜 1.5% LY 염료 용액을 준비합니다. 1 mL의 부피는 여러 실험에 충분합니다.</li>
		<li>16,800 x g에서10 분 동안 원심 분리기 . 그런 다음 0.2 μm 주사기 필터로 상구체를 새 튜브로 필터링합니다. 알리쿼트는 최대 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 참고: 전극을 막을 수 있는 염료 입자의 응집을 방지하기 위해 염료 용액을 원심분리하고 여과하는 것이 중요합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 심낭 관류 및 뇌 해부
<ol><li>
수페리어 관류용 장비 및 마우스 준비 참고: C57/BL6 마우스중 어느 쪽도 사용할 수 있습니다. 이 방법이 안정적으로 작동하기 위해, 마우스가 3 개월 이상 오래되지 않는 것이 중요하다는 것을 경험적으로 관찰되었습니다 (6-8 주 이상적이다). 관류 프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다. 자세한 내용은14.<ol>
<li>ACSF 솔루션으로 투명 관류 튜브를 사용하여 라인의 기포를 제거합니다. 사용 순서대로 수술 도구를 설정하십시오 (핀셋, 곡선, 무딘 가위, 홍채 가위).</li>
		<li>이소플루란 유도 챔버에 마우스를 넣고 2−3 mL의 이소플루란을 챔버에 추가한 후 마우스를 깊이 마취시다. 마취가 효력을 발휘할 수 있도록 1-2분 간 두세요. 호흡이 멈추지 않도록 하십시오.</li>
		<li>발가락 핀치 반사를 테스트합니다. 마우스가 통증 자극에 반응하지 않고 반사가 없을 때 진행합니다. 산소에 5 %의 이소플루란을 공급하고 팔다리와 꼬리가 화학 연기 후드 내부에 테이프로 고정된 채로 머리를 호흡 콘에 넣은 채 척추 위치에 동물을 고정시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랜스카다이얼 관류
	<ol>
<li>핀셋을 사용하여 흉곽 아래 피부를 들어 올립니다. 복강을 노출하기 위해 피부를 통해 구부러진 무딘 가위로 5-6cm 절개를 합니다. 간과 횡격막이 보일 때까지 복벽을 통해 위쪽으로 자릅니다.</li>
		<li>간을 다이어그램에서 부드럽게 멀리 이동합니다. 홍채 가위로, 다이어프램에 3−4cm 측면 절개를합니다.</li>
		<li>가슴 구멍을 노출하기 위해 몸의 양쪽을 따라 늑골 케이지를 잘라. 심장을 손상시키고 폐를 피하지 않도록주의하십시오. 흉골을 들어 올려 심장을 노출시하십시오.</li>
		<li>심장이 보이면, 0.05 mL의 헤파린 나트륨 용액 (mL 당 1,000 USP)을 항응고제로 좌심실로 주입하십시오. 그런 다음 관류 바늘을 좌심실로 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘이 심실에 남아 있고 다른 심장 챔버로 관통하지 않도록하십시오. 홍채 가위로 오른쪽 심방에서 작은 절개를합니다.</li>
		<li>ACSF 용액을 기존 체액이 혈액을 지울 때까지 약 10 mL / min의 속도로 주입하십시오 (1-2 분).</li>
		<li>기포를 도입하지 않고 ACSF 솔루션에서 고정 솔루션으로 전환하십시오. 10-20 mL /min에서 10 분 동안 고정 용액으로 퍼퓨즈하십시오. 주의 사항: 코에서 고정식 이 배수되지 않도록 주의하십시오. 이것은 바늘이 우심실에 도달하고 고정식이 전신 회로를 통해서 보다는 폐로 바디의 나머지 부분에 여행한다는 것을 표시합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뇌의 해부
	<ol>
<li>가위로 마우스의 머리를 제거하고 조심스럽게 두개골에서 마우스 뇌를 해부. 짧은 후 고정 기간 동안 실온에서 1.5 시간 동안 고정 용액에 놓습니다. 참고: 성공적인 LY 이온 토포레아증을 위해서는 좋은 관류가 필요합니다. 뇌는 흰색이어야하며 뇌 혈관 구조에 혈액이 없어야합니다. 몸과 팔다리가 뻣뻣하게 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 슬라이스 준비
<ol><li>
해마 조각의 준비
	<ol>
<li>실온에서 0.1M 인산완충식염수(PBS)로 뇌를 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 필터 종이로 뇌를 건조시키고 날카로운 면도날로 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오.</li>
		<li>시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 진동 트레이에 뇌를 장착하고 실온에서 PBS로 트레이를 채웁니다. 110 μm 두께의 해마 관상 섹션을 잘라. 참고: 진동의 설정을 조정하여 슬라이스의 두께와 표면이 균일한지 확인합니다. 이 실험에서는 계측기의 임의 설정인 4.5 의 속도 설정과 8의주파수 설정이 사용되었습니다. 사용자는 다른 장치의 설정을 실험해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>트레이에서 섹션을 수집하고 얼음에 PBS의 접시에 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전극 준비
<ol><li>
적절한 저항으로 날카로운 전극을 준비합니다.
	<ol>
<li>필라멘트 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm)와 보로 실리 케이트 유리 단일 배럴 전극을 사용합니다. 마이크로파이펫풀러(재료 표)에전극을 당깁니다. 5 mM KCl에서 1.5 % LY로 채워진 이상적인 전극은 PBS의 욕조에 배치 할 때 200 MΩ의 저항을 가져야합니다. 참고: 풀러 설정은 장치(사용된 기계 유형 및 풀러 필라멘트)에 따라 다릅니다. 더 높은 열 설정은 일반적으로 더 길고 미세한 팁을 제공합니다. 이 실험에 사용된 마이크로파이펫 풀러의 경우, 열: 317, 당기기: 90, 속도: 70, 및 지연: 70이었다. 쓰루형 필라멘트가 사용되었다.</li>
		<li>먼지가 팁에 들어가지 않도록 밀폐 용기에 전극을 보관하십시오. 팁이 끊어지지 않도록 전극을 상자 바닥에서 높이 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LY 염료 용액으로 전극을 채웁니다.
	<ol>
<li>전극을 아래쪽을 향하여 수직 위치에 놓습니다. LY 용액의 파이펫 1-2 μL은 전극의 뒤쪽에 넣고 해가 모세관 작용을 통해 팁으로 이동될 때까지 5-10분 동안 기다린다.</li>
		<li>조작기에 연결된 전극 홀더의 충전 된 전극을 부드럽게 고정하십시오. 참고: 전극 홀더의 실버 와이어는 전극 내부의 LY와 접촉해야 합니다. 와이어 길이에 따라 필요한 경우 LY 솔루션의 볼륨을 조정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 이온 토포레시스로 성상 세포 채우기
<ol><li>전극을 테스트합니다.
	<ol>
<li>실온에서 0.1M PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 뇌 슬라이스를 부드럽게 놓습니다. 나일론 끈이 있는 플래티넘 하프로 슬라이스를 제자리에 고정합니다.</li>
		<li>전극이 전압 소스에 연결되어 있는지 확인하고 접지 전극을 뇌 슬라이스가 들어있는 욕조에 넣습니다.</li>
		<li>목표를 관심 있는 뇌 영역으로 이동합니다.</li>
		<li>전극을 용액으로 내립니다. 밝은 들판 아래에서 시야의 중심으로 이동한 다음 40x 수지 렌즈로 주의 깊게 검토하여 이물질이나 거품이 없는 것처럼 보이는지 확인합니다. 전극 팁을 막는 것이 있으면 새 것으로 교체하십시오. 참고: 막히는 것은 200 MΩ 전극의 문제입니다. 모든 실험 전에 염료 용액의 원심 분리 및 여과로, 이것은 빈번한 문제가 되어서는 안됩니다. 그러나 전극의 끝이 작기 때문에 조직이 때때로 개구부에 끼일 수 있습니다. 저자는 이를 방지할 방법을 찾지 못했지만 새로운 전극을 사용하여 쉽게 처리 할 수 있습니다.</li>
		<li>488 nm 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 전극의 끝을 관찰하십시오. 그런 다음, 12 V. 12V. 자극기에서 자극자를 켜서 염료 배출을 시험하고 자극자가 켜져 있는 동안 전극 끝 주위에 큰 형광 염료 구름을 주의하십시오. 전압 자극 시 염료가 전혀 배출되지 않거나 적으면 전극을 교체하십시오.</li>
		<li>밝은 필드 아래에서 전극을 천천히 낮추어 표면 바로 위에 멈춥스로 향합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이온토포레시스로 성상세포를 채웁니다.
	<ol>
<li>적외선 차동 간섭 콘트라스트(IR-DIC)를 통해 슬라이스 표면 아래 40-50 μm의 성상 세포를 식별합니다. 직경약 10 μm의 길쭉한 타원형 소마타가 있는 세포를 찾아보십시오. 성상 세포가 선택되면 시야의 중심으로 이동합니다. 참고: 이온 토포레시스에 대한 좋은 세포는 그 주위에 명확하고 정의 된 테두리를 가지고 있습니다. 완전히 채워질 수 없으므로 슬라이스 표면에 너무 가깝게 셀을 선택하지 마십시오. 염료 충진을 위해 성상 세포들을 일상적으로 식별할 수 있도록 며칠 동안 몇 가지 연습이 필요합니다. 실험에 사용되는 뇌 영역에 따라 성상 세포의 수가 다를 수 있습니다. 이것은 충전하기 전에 성상 세포체를 식별하는 데 필요한 시간에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
		<li>전극 팁을 슬라이스로 천천히 내리고 조직을 탐색하여 세포체와 동일한 평면에 있습니다. 참고: 조직을 손상시키지 않도록 전극을 천천히 움직입니다.</li>
		<li>성상 세포의 세포 체가 명확하게 표시되고 윤곽이 잡히면 천천히 부드럽게 전극을 앞으로 진행합니다. 팁이 세포의 소마를 찔러 줄 때까지 전극을 이동합니다. 전극이 소마 내부에 있는지 주의하기 위해 목표의 초점을 천천히 위아래로 이동합니다. 참고: 전극 팁은 세포 체 내부에 있어야하며 소마에 대한 작은 들여 쓰기를 관찰해야합니다. 전극을 더 이상 움직이지 말고 전지를 통과하는 팁을 피하십시오.</li>
		<li>전극 팁이 셀 내부에 들어가면 자극기 (~0.5-1 V)를 켜고 지속적으로 전류를 세포로 내보합니다. 공초점 현미경을 사용하여 세포 가 채워지는 것을 지켜보십시오. 디지털 줌을 늘려 셀의 세부 정보를 확인하고 전극의 끝이 셀 내부에 보이는지 확인합니다. 참고: 염료가 셀 밖으로 새기거나 주변의 다른 셀을 채우는 것으로 나타나면 전압을 낮춥니다. 염료가 여전히 세포밖으로 새는 것처럼 보이는 경우, 천천히 전극을 꺼내 다른 세포를 찾으십시오. 염료가 누출되지 않는 것이 최종 이미지에서 높은 신호/배경 비율을 가지는 것이 중요합니다.</li>
		<li>미세한 가지와 프로세스가 정의 될 때까지 약 15 분 동안 기다렸다가 전압을 끄고 전극 팁을 셀에서 부드럽게 인출하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>채워진 셀을 이미지화합니다. 참고 : 이미징은 면역 성 화학으로 염색을 채우거나 염색 한 직후에 수행 할 수 있습니다. 숫자 조리개(NA)가 높은 목표는 더 나은 해상도를 제공합니다.<ol>
<li>세포가 40배 의 목표치로 이미징(15-20분)하기 전에 원래 형태로 돌아올 때까지 기다립니다. 셀을 이미지화하려면 공초점의 설정을 조정하여 더 미세한 분기와 프로세스가 정의된 것처럼 보이도록 합니다.</li>
		<li>단계 크기가 0.3 μm인 z 스택을 설정합니다. 이미징하는 동안 셀에서 신호가 없을 때까지 목표를 이동하고 이를 맨 위로 설정합니다. 그런 다음 신호가 없을 때까지 목표를 아래로 이동 (셀을 통해 초점)을 아래로 이동하고 바닥으로 설정합니다.</li>
		<li>이미징이 완료된 후 전극에 염료 배출이 있는지 확인합니다. 큰 염료 구름이 나타나면 다음 슬라이스에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 새 전극으로 교체하십시오. 참고: 단일 성상 세포 및 이미징의 염료 충전은 약 45 분에서 1 시간 정도 걸립니다. 이러한 특정 실험을 위해, 마우스당 약 3-6 세포를 얻을 수 있었다. 필요한 경우 동일한 슬라이스에 여러 셀을 레이블을 지정할 수 있습니다. 그러나 개별 성상 세포를 구별하려면 세포 간에 약 200 μm의 거리를 유지해야합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>6. 면역 항화학염색 (선택 사항)
<ol><li>이미징이 완료되면 즉시 10 % 포르말린을 얼음에 놓아 면역 화학을 보존하십시오. 뇌 조각을 어둠 속에서 유지하고 4 °C에서 하룻밤 보관하십시오.</li>
	<li>0.1 M PBS에서 3x를 세척하여 0.5% 난오계면활성제(즉, 트리톤 X 100)를 각각 5분동안 세척한다. 그런 다음 0.5% 난오계면활성제와 10% 정상 염소 혈청(NGS)으로 0.1 M PBS의 차단 용액을 실온에서 1시간 동안 부드러운 교반으로 배양한다.</li>
	<li>0.1 M PBS에서 희석된 1차 항체에서 교반된 부분을 0.5% 난오계면활성제와 5% NGS로 4°C에서 2일간 배양하였다. 참고: 뇌 슬라이스의 두께 때문에, 1 차 항체의 잠복기는 더 나은 침투를 위해 연장될 필요가 있고 항체 사격량은 증가될 수 있습니다. 본 실험에서, 항 GFAP 항체에 1:500 희석을 사용하고 항 아쿠아포린-4 항체에 1:500 희석을 사용하였다.</li>
	<li>0.1 M PBS에서 3x 섹션을 각각 0.5 % nonionic 계면활성제로 10 분 동안 세척 한 다음 0.1 M PBS로 희석 된 이차 항체로 배양하고 실온에서 0.5 % nonionic 계면 활성제 및 10 % NGS를 실온에서 6 시간 동안 배양합니다. 참고: 488 nm에 의해 흥분된 이차 항체를 선택하지 마십시오, 이는 LY 염료를 가시화하는 데 사용되는 파장이다. 본 실험에서, 1:1,000 희석은 알렉사 플루어 546 염소 안티-닭 IgG (H+L) 및 알렉사 플루어 647 염소 안티-토끼 IgG (H+L)에 사용되었다.</li>
	<li>섹션 3x를 0.1 M PBS로 각각 10분 동안 헹구어 냅니다. 그런 다음 형광에 적합한 장착 매체에 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 밀봉 슬라이드. 0.3 μm의 단계 크기로 이미지 셀.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 백서에 설명된 방법은 가볍게 고정된 두뇌 조각에 있는 LY 염료의 세포내 이온 백공증을 사용하여 성상 세포 형태를 구상하는 쪽을 기술합니다. 세포의 성공적인 LY 이온 토포레시스 및 형태학적 재건에 기여하는 이 프로토콜에서 강조된 몇몇 중요한 요인이 있습니다. 한 가지 요인은 이미지의 품질과 재현성이며, 이는 주로 마우스의 나이와 관류의 결과에 의해 결정됩니다. 이 연구에서는, 우리는 C57/BL6N 마우스 6-8 주 를 사용했습니다. 성공적인 관류 (정중한 바늘의 적절한 배치에 크게 의존하고 백색 색의 뇌와 뇌 혈관에 혈액이 없는 것으로 지적)는 가장 상세하고 명확하게 채워진 세포에 필요합니다. 전극에 의한 탈백 후, 세포막은 전극의 끝 주위에 단단한 밀봉을 유지하고 염료가 새는 것을 방지해야 합니다. 최선의 노력에도 불구하고, 때때로 세포 외부의 다른 구조는 피펫이 뇌 조직을 통해 진행됨에 따라 채워질 것입니다 : 우리는 분석에서이 세포를 제외. 전극의 저항은 추가적인 핵심 요소입니다. 높은 저항은 전압 자극시 전극 팁에...

성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다 (CNS). 그들은 이온 항상성, 혈류 조절, 시냅스 형성뿐만 아니라 제거 및 신경 전달 물질 섭취 량1. 성상 세포 함수의 넓은 범위는 복잡한 형태 구조2,3에반영됩니다. 성상 세포는 시냅스, 모수석, 축사, 혈관 및 기타 신경교 세포와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지와 전단지로 나누는 여러 가지 기본 및 이차 가지를 포함합니다. 성상 세포 형태는 신경 회로4에서 그들의 기능을 차별적으로 수행하는 그들의 기능에 암시할 수 있는 다른 두뇌 지구에 걸쳐변화합니다. 더욱이, 성상 세포는 발달 도중, 생리적인 조건 도중, 및 다중 질병 상태3,5,6에서그들의 형태를 바꾸기 위하여 알려지고 있습니다.
성상 세포 형태학의 복잡성을 정확하게 해결하기 위해서는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 전통적으로, 면역히스토화학은 성상세포 특이적 또는 성상세포 농축 단백질 마커를 사용하여 성상세포를 시각화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 성상 세포의 구조보다는 단백질 발현의 패턴을 드러낸다. 신경교 섬유산성 단백질(GFAP) 및 S100 칼슘 결합 단백질 β(S100β)와 같은 일반적으로 사용되는 마커는 전체 세포 부피에서 발현되지 않으며 따라서 완전한 형태론7을해결하지 못한다. 성상 세포 (바이러스 주사 또는 형질 전환 마우스 기자 라인)에서 유비쿼터스형형 단백질을 발현하는 유전 적 접근법은 미세한 가지 및 전체 영역을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 개별 성상세포를 구별하기 어렵고, 분석은 특정 프로모터8에의해 표적화된 성상세포 집단에 의해 편향될 수 있다. 직렬 섹션 전자 현미경 검사법은 시냅스와 성상 세포 프로세스의 상호 작용의 상세한 그림을 밝히기 위하여 이용되었습니다. 시냅스와 접촉하는 수천 개의 성상 세포 프로세스로 인해 현재이 기술9로전체 세포를 재구성 할 수는 없지만 데이터 분석을위한 기계 학습 접근 법을 사용하여 변경 될 것으로 예상됩니다.
이 보고서에서는 CA1 지층 라디덤을 예로 사용하여 루시퍼 옐로우(LY) 염료로 세포내 이온포레시스를 사용하여 마우스 성상세포를 특성화하는 절차에 중점을 둡니다. 이 방법은 에릭 부송과 마크 엘리스만10,11의선구적인 과거 작품을 기반으로합니다. 가볍게 고정 된 뇌 조각에서 성상 세포는 그들의 독특한 소마 모양에 의해 확인 되 고 LY로 가득. 세포는 공초점 현미경 검사법으로 그 때 심상됩니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 개별 성상 세포들을 재구성하고 그들의 프로세스 및 영토의 상세한 형태학적 분석을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 또한,이 방법은 성상 세포와 뉴런, 다른 신경교 세포, 뇌 혈관 사이의 공간 관계와 상호 작용을 식별하기 위해 면역 조직 화학과 함께 적용 할 수 있습니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 건강 또는 질병 상태의 다른 뇌 영역 및 마우스 모델에서 형태를 분석하는 매우 적합한 도구라고 생각7,12,13.

<table><tbody><tr><td>10% 완충 포르말린 인산</td>염 <td>Fisher</td><td>SF 100-20</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr>Supor <td>Membrane Pall</td><td>4692</td><td>와 함께 Acrodisc 주사기 필터를</td> 사용할 수 있습니다. 동일한 <td>대안을 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>Ag/AgCl 접지 펠릿</td>, <td>WPI</td>, <td>EP2</td>, <td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>Alexa Fluor 546, 염소 항닭 IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11040</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 : <tr><td>Alexa Fluor 647 염소 anti-rabbit IgG (H + L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A27040</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Anti Aquaporin-4 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-87679</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>Anti GFAP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>필라멘트</td><td>와 함께 붕규산 유리 피펫을 사용할 수 있습니다.세계 정밀 기기</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NTac 마우스</td><td>Taconic Stock</td><td>B6</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Calcium</td><td>Chloride Sigma</td><td>21108</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr> : <tr><td>Disodium Phosphate</td>, <td>Sigma</td><td>255793</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>: 전극 풀러 - 모델 P-97</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>: Heparin sodium injection (1,000 USP per mL)</td> <td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>400-10</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>: Imaris software (Version 7.6.5)</td><td>Bitplane Inc.</td><td></td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>: Isofluorane</td>, <td>Henry Schein, Animal Health</td><td>29404</td><td>동일한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>: Lidocaine Hydrochloride Injectable (2 %)</td> <td>Clipper</td><td>1050035</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>: Lucifer Yellow CH dilithium salt</td><td>Sigma</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH dipotassium salt</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>동일한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Thermo Scientific</td><td>24X60-1</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-544-2</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>대물 렌즈 (40x)</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN 40XW</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>대물 렌즈 (60x)</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 60X</td><td>유사한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>PBS 정제, 100 mL</td><td>VWR</td><td>VWRVE404</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>피펫 미세 조작기 - 모델 ROE-200</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td>유사한 대안이 될 수 있습니다 사용</td></tr> 된 <tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P3911</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761</td><td>동일한 대안을 사용할 수</td></tr> 있습니다 염화<tr><td>나트륨</td><td>시그마</td><td>S5886</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>자극기 - 모델 Omnical 2010</td><td>세계 정밀 기기</td><td>Omnical 2010</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>동일한 대안을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Vibratome- Model #3000</td><td>Pelco</td><td>100-S</td><td>유사한 대안을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis

성상 세포는 신경 회로의 필수 구성 요소입니다. 그(것)들은 전체 중추 신경계 (CNS)를 타일하고 신경 전달 물질 정리, 이온 규칙, 시냅스 변조, 뉴런에 대한 신진 대사 지원 및 혈류 조절을 포함하는 다양한 기능에 관여합니다. 성상 세포는 소마, 여러 가지, 그리고 neuropil 내의 다양한 세포 요소에 접촉하는 수많은 미세 한 과정이 복잡한 세포입니다. 성상 세포의 형태를 평가하기 위해서는 구조를 시각화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 우리는 성인 마우스에서 가볍게 고정 된 뇌 조직에서 형광 루시퍼 노란색 (LY) 염료를 사용하여 성상 세포의 세포 내 이온 토포레스를 수행하는 신뢰할 수있는 프로토콜을보고합니다. 이 방법에는 성상 세포 형태를 특성화하는 데 유용한 몇 가지 기능이 있습니다. 그것은 개별 성상 세포의 3 차원 재건을 허용, 이는 구조의 다른 측면에 형태 학적 분석을 수행하는 데 유용합니다. LY 이온 토포레시스와 함께 면역 조직 화학은 또한 신경계의 다른 구성 요소와 성상 세포의 상호 작용을 이해하고 표지 된 성상 세포 내에서 단백질의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 경검사법으로 성상세포 형태를 엄격하게 검사하기 위해 CNS 장애의 다양한 마우스 모델에서 구현될 수 있다. LY 이온 토포레시스는 성상 세포 구조를 평가하기 위한 실험적 접근법을 제공하며, 특히 이러한 세포가 중요한 형태학적 변화를 겪도록 제안된 부상이나 질병의 맥락에서.

본 연구에서 보고된 데이터는 각 실험에서 4개의 마우스로부터 7-12개의 세포로부터 의입니다. 평균 데이터는 적절한 경우 그림 패널에 보고됩니다.
성상 세포 형태를 평가하기 위해, 우리는 그림 1에요약된 CA1 지층 라디에움에 성상 세포를 채우기 위해 LY 염료를 사용하여 세포 내 이온 토포레증을 수행했습니다. 그림 2는 대표적인 성상 세포와 정교한 형태학적 구조를 묘사합니다. 셀은 488 nm 레이저 라인 (0.3 μm 및 3.0-3.5 배 디지털 줌의 단계 크기)을 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 60 x 오일 침지 렌즈로 후 고정을 이미지화했습니다. 공초점 현미경의 광증배관(PMT), 오프셋 및 게인 기능을 조정하여 최종 이미지에서 높은 신호/배경 비율을 생성하였다. 그림 2A에서서로 다른 z-단계의 단일 광학 평면 이미지(...

성상 세포는 형태학적으로 복잡한 세포이며, 여러 과정과 덤불 영토에 의해 예시됩니다. 그들의 정교한 형태를 분석하기 위하여는, 우리는 가볍게 고정한 조직에서 세포내 Lucifer 황색 이온 포레시스를 능력을 발휘하기 위하여 믿을 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

Astrocytes are essential components of neural circuits. They tile the entire central nervous system (CNS) and are involved in a variety of functions, ...

이 방법은 질병 및 꾸준한 상태 동안 시냅스에서 성상 세포 상호 작용의 평가를 위한 매우 미세한 성상세포 과정의 시각화를 용이하게 하는 데 사용할 수 있다. 이 기술은 또한 어떤 마우스 모형, 세포 인구, 또는 두뇌 지구에 적용될 수 있습니다. 적절한 저항으로 날카로운 전극을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 단일 배럴 전극을 당깁니다.먼지가 팁에 들어가는 것을 방지하고 팁이 파손되지 않도록 상자 의 바닥에서 높은 전극을 유지하기 위해 밀폐 된 용기에 당겨진 전극을 저장합니다. 루시퍼 옐로우 염료 용액으로 전극을 채우기 위해 팁이 아래쪽으로 향하는 수직 위치에 전극을 배치하고, 파이펫 1~2개의 마이크로리터의 피펫을 전극 의 뒷면에 넣습니다. 용액이 모세관 작용을 통해 팁으로 이동하기 까지 5~10분 정도 기다린 후 전극 내부의 용화물 노란색과 접촉하는 전극 홀더의 은색 와이어와 연결된 전극 홀더에 채워진 전극을 부드럽게 고정하십시오.염료 배출 테스트를 위해 가볍게 고정된 뇌 슬라이스를 실온에서 0.1 대구 PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 부드럽게 놓고 나일론 끈이 달린 백금 하프로 슬라이스를 제자리에 고정시십시오. 전극을 전압 소스에 연결하고 접지 전극을 뇌 슬라이스를 포함하는 욕조에 배치합니다. 공초점 현미경의 목표를 관심 있는 뇌 영역으로 이동하고 전극을 10X 수질 침지 렌즈를 사용하여 용액으로 낮추고 전극을 시야의 중심으로 이동시합니다.밝은 필드 조명 아래에서 40X 수질 침수 렌즈로 전극을 주의 깊게 검사하여 전극이 투명하고 파편이나 거품없이 나타나도록 하십시오. 488 나노미터 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법으로 전환합니다. 12볼트에서 자극기를 켜서 염료 배출을 테스트합니다.대형 형광염염분 구름은 전극 의 끝 주위에 표시되어야 합니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에서 천천히 전극을 슬라이스쪽으로 낮추고 표면 바로 위에 멈춥춥시다. 이온토포레시스로 관심 있는 성상세포를 채우려면 적외선 차동 간섭 대비를 사용하여 길쭉한 타원형 소마타가 있는 성상세포에 직경 약 10마이크로미터, 슬라이스 표면 아래 40~50마이크로미터를 식별합니다.이것은 피라미드 세포 층 바로 아래 해마의 지층 방사체입니다. 우리가 조직을 통해 이동할 때, 우리는 혈관, 신경 세포, 성상 세포 및 그밖 세포 모형을 볼 수 있습니다. 성상세포가 선택되면, 세포를 시야 의 중심으로 이동하고 천천히 전극 팁을 슬라이스로 낮추고 전극이 세포 몸과 동일한 평원에 될 때까지 조직을 탐색합니다.성상세포의 세포 본체가 명확하게 보이고 윤곽을 드러내면, 천천히 부드럽게 전극을 앞으로 전진시키고, 팁이 세포의 소마를 뚫을 때까지 전극을 움직입니다. 전극이 소마 내부에 있는지 주의하기 위해 목표의 초점을 천천히 위아래로 이동합니다. 전극 끝이 세포 내부에 있으면 0.5 ~1볼트의 자극기를 켜서 전류를 지속적으로 셀로 배출합니다.공초점 현미경을 사용하여, 세포 필름을 보고, 디지털 줌을 증가시켜 세포의 세부 사항을 시각화하고 전극의 끝이 필요에 따라 셀 내부에 보이는지 확인합니다. 전압을 끄고 셀에서 전극 끝을 부드럽게 철회하기 전에 미세한 가지와 프로세스가 정의 될 때까지 약 15 분 동안 기다립니다. 채워진 셀을 이미지하기 위해, 세포가 원래 의 형태로 돌아갈 때까지 15~20분 기다린 후 공초점 현미경의 설정을 조정하여 40X 목표에 따라 미세한 분기와 프로세스가 정의된지 확인합니다.0.3 마이크로미터의 스텝 크기로 Z 스택을 설정하고, 세포에서 신호가 없을 때까지 이미징하는 동안 목표를 이동하고 해당 단계를 정상으로 설정합니다. 그런 다음 신호를 볼 때까지 셀을 통해 초점을 맞추고 목표를 아래로 이동하고 해당 단계를 바닥으로 설정합니다. 이미징이 완료되면 전극에서 염색 배출을 확인합니다.큰 염료 구름이 나타나면 전극을 다음 슬라이스에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 전극을 교체하십시오. 최대 강도 투영을 생성함으로써 해당 도메인의 성상세포 구조에 대한 자세한 뷰를 관찰할 수 있습니다.성상세포로 4X 크기 확대하면 하나의 주요 분기, 여러 보조 분기 및 주변 분기 및 전단지의 분포의 최대 강도 투영을 알 수 있습니다. 여기서CA1 성상세포의 원본 이미지가 표시됩니다. 세포 체, 주요 분기, 프로세스 및 성상세포에 의해 동봉된 영토 부피는 이러한 후속 이미지에서 재구성됩니다.재건이 만들어진 후, 소마, 전체 세포 및 영토의 양이 정량화되었다. 그리고 주요 지점의 수는 계산되었다. 중간 성상 세포 필라멘트를 라벨세포 켈레탈 단백질로 세포 소마, 주요 분기 및 일부 이차 성상세포 가지에서 발현되지만 미세한 가지 및 공정에서는 발현되지 않습니다.이 대표적인 분석에서는, 신경교 세동산 단백질에 의해 표지된 1 차적인 분기의 수및 그 루시퍼 노란색에 의해 그 시각화에서 중요한 다름이 발견되지 않았습니다. 또한, 글리아 세동 산성 단백질에 의해 표지된 성상세포의 세포 면적 및 부피는 루시퍼 옐로우로 시각화된 면적 및 부피보다 현저히 작었으며, 글리아 세동 산성 단백질은 주요 분기를 표지하는 신뢰할 수 있는 마커이지만 세포의 전체 영역 또는 부피를 결정하는 데 유용하지 않다는 것을 입증하였다. 전극 끝에서 방출되는 염료의 양은 염료의 꾸준한 스트림이 배출될 수 있을 만큼 충분히 높아야 하는 전극 저항에 달려 있다.향후 연구는 초분해성 광 현미경 검사법에 의해 또는 성상세포 구조 내의 특정 단백질의 발현의 면역조직화학적 분석에 의해 성상세포 구조의 다른 성분을 검사할 수 있다.

visualizing-astrocyte-morphology-using-lucifer-yellow-iontophoresis

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Yellow Iontophoresis를 사용한 성상세포 형태 시각화. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 고정된 뇌 절편에서 성상세포 형태를 연구하기 위해 형광 염료 이온 영동을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저전압 전류 하에서 음이온성, 친수성 염료를 세포질로 전달하기 위해 전극으로 성상세포체(astrocyte soma)를 뚫는 방법을 자세히 설명하여 염료가 체세포(soma)와 가지를 확산시키고 표지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 표지된 성상세포를 시각화하여 형태학적 통찰력을 제공합니다.

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

선조체에서 성상교세포 세포 내 Ca2+ 신호의 특성과 기능은 불완전하게 탐구된 상태로 남아 있습니다. 혈청형 2/5(AAV2/5)의 아데노 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상세포에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 방법과 선조체 성상세포 내 Ca2+ 신호를 안정적으로 이미지화하는 절차를 설명합니다.

이미징 세포 내 칼슘 2 + 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

허 혈 성 뇌졸중 공부 하기 어려운 어떤 영향을 받는 뇌 영역에 이다의 구체적인 기여 산소 포도 당 부족 (지도부)에 노출 하는 복잡 한 이벤트입니다. 이 문서는 고립 된 이다 그들의 반응성 및 확산 지도부 조건 하에서 연구 하는 방법론을 소개 합니다.

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여기에 설명 된 AWESAM 프로토콜은 빠르고, 단순 하 고 저렴 한 방식으로 다른 뇌 세포 분리에서 murine 이다 경작에 최적입니다. AWESAM 이다 자발적인 캘리포니아2 + 신호, 형태학, 및 유전자 식 프로필 이다에서 vivo에서유사한 전시.

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이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

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여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

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우리는 hSOD1G93A 쥐 모델에서 근 위축성 측삭 경화증의 병태 생리학에 대한 연구를 위해 세포 내Ca 2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 위해 쥐 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.

쥐 성상 세포와 미세 아교 세포의 1 차 배양과 근 위축성 측삭 경화증 연구에서의 사용

학습하세요 루시퍼 황색 이온토포레시스를 이용한 성상세포 형태 시각화 기법으로, 쥐 뇌 조직에서 미세한 세포 돌기와 신경세포 상호작용을 정밀 분석하는 방법입니다.

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

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