Name: 1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 배우세요 대량 물방울 유리화를 이용한 쥐 1차 간세포 보존 방법을. 저농도 동결보호제와 급속 삼투 탈수로 세포 생존율과 대사 활성을 유지하여 간세포 이식 및 생체인공 간 장치 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

미국 국립 보건원(R01DK096075, R01DK107875 및 R01DK114506)과 미국 국방부(DoD RTRP W81XWH-17-1-0680)의 자금 지원이 크게 인정받고 있습니다.

이 프로토콜에 대한 기본 간세포 격리는 미국 매사추세츠 주 보스턴의 종합 병원에서 세포 자원 코어(CRC)에 의해 수행되었습니다. 동물 프로토콜 (#2011N000111)은 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 대량 물방울 유리화
<ol><li>유리화 솔루션을 준비합니다.
	<ol>
<li>40 mg의 소 혈청 알부민(BSA)을 위스콘신 대학교 용액(UW)의 17.0 mL에 첨가하여 유리화 용액 1(V1)을 만듭니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 V1 용액을 멸균 필터하고 4°C에서 보관합니다. 참고 : UW는 일반적으로 사용되는 장기 보존 솔루션입니다. 50g/L 하이드록세틸전분, 35.83 g/L 락토바이오닉산, 3.4 g/L 칼륨 인산모노베이직, 1.23 g/L 황산 마그네슘, 17.83 g/L 라피노스 펜타하이드레이트, 1.34 g/L 아데노신, 0.136 g/L 알로푸리놀, 0.992 g/L 총 글루타티온 6.1 /L 수산화칼륨, 및 수산화나트륨은 pH를 7.4로 조절한다.</li>
		<li>7.0 mL의 UW, 6.5 mL의 DMSO, 6.5 mL의 에틸렌 글리콜 (EG), 40 mg의 BSA 및 5.48 g의 자당을 결합하여 유리화 용액 2 (V2)를 만듭니다. 0.22 μm 필터를 사용하여 V2 용액을 멸균 필터. 3mL 주사기에 멸균 여과된 V2 용액 3.5 mL를 적재하고 4°C에서 보관하십시오. 참고: CPA의 용해를 용이하게 하기 위해 솔루션은 필요한 것보다 더 많은 양으로 준비됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>벌크 액적 유리화 장치를 준비한다.
	<ol>
<li>혼합 바늘을 준비하려면 먼저 혼합 바늘의 외부 회색 슬리브의 한쪽을 따라 자른 다음 슬리브를 열어 혼합 바늘에서 제거합니다.</li>
		<li>혼합 바늘의 입구 위에 2개의 25mm 실리콘 튜브 섹션을 밀어 붙이고 접착제로 위치를 고정합니다(그림1A).</li>
		<li>도 1A에도시된 바와 같이 바늘을 20 mm 길이(즉, 내부 혼합 나선의 길이)로 자른다. 참고 : 혼합 바늘 길이는 바늘 내부의 부피에 비례하므로 높은 CPA 농도 용액에 대한 간세포의 노출 시간을 제어하도록 변경할 수 있습니다.</li>
		<li>혼합 바늘의 컷오프 출구를 20G 주사 바늘에 삽입합니다(그림1B). 참고 : 주사 바늘 크기는 액적 크기에 영향을 미칩니다.</li>
		<li>오토클레이브에 의해 혼합 바늘 어셈블리를 살균.</li>
		<li>멸균 된 드와르를 액체 질소로 채웁니다. 이소프로판올로 드와르의 외부를 살균한 후 멸균 된 층류 세포 배양 후드에 Dewar를 배치하십시오. 참고: 액체 질소에 액적을 직접 노출하는 동안 오염은 중요한 고려 사항입니다. 현재 프로토콜에서 비멸균 액체 질소를 사용한 오염은 없었지만, 액체 질소는 필요한 경우 멸균을 보장하기 위해 여과 또는 조사될 수 있다16.</li>
		<li>액상 질소 Dewar의 내직경과 동일한 외부 직경을 가진 깔때기를 50 mL 원추형 튜브에 삽입하여 액적 수집 장치를 생성한다(도1C-E).</li>
		<li>큰 집게를 사용하여 최종 수직 위치에서 천천히 눌러 액적 수집 장치를 액체 질소에 담급합니다. 원유 관이 Dewar의 하단에 수직 위치에 달려 있는지 확인하십시오(그림 1D-E). 참고: 깔때기는 원유관에 삽입되고 쉬어야 합니다. 그림 1D와같이 액체 질소 수준은 깔때기의 입구 높이보다 1cm 낮아야 합니다.</li>
		<li>주사기 펌프의 발에서 세포 배양 후드 벽에서 돌출된 나사에 끈을 묶어 세포 배양 후드의 벽에 수직 위치에 주사기 펌프를 장착합니다.</li>
		<li>액체 질소 Dewar를 수직으로 장착된 주사기 펌프 아래에 액적 수집 장치와 함께 놓습니다(그림1E).</li>
	</ol></li>
	<li>CPA로 사전 인큐베이션.
	<ol>
<li>갓 분리된 쥐 간세포를 얻은 후, Trypan blue 배제에 의한 재고 농도를 계산하고 4천만 개의 생존 가능한 간세포를 취합니다. 참고: 현탁액에서 간세포를 부드럽게 취급하는 것은 세포 사멸을 방지하는 데 중요합니다.</li>
		<li>브레이크없이 5 분 동안 50 x g의 원심 분리기.</li>
		<li>상월체를 흡인하고 V1 용액의 3.4 mL에서 간세포를 재중단한다.</li>
		<li>얼음에 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>간세포에 DMSO 150 μL과 EG 150 μL을 넣고 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>얼음에 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>다시, 간세포에 DMSO 150 μL과 EG 150 μL을 넣고 부드럽게 섞습니다.</li>
		<li>3mL 주사기에 3.5mL를 적재하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>유리화를 수행합니다.
	<ol>
<li>미리 배양된 간세포와 V2 용액 주사기를 주사기 펌프 어댑터에 삽입합니다.</li>
		<li>주사기에 두 개의 여성 루어 잠금 호스 바브 어댑터를 부착하고 바브 피팅 위에 혼합 바늘 어셈블리의 실리콘 튜브를 밀어 넣습니다(그림 1F).</li>
		<li>전체 어셈블리를 주사기 펌프에 놓습니다(그림1E).</li>
		<li>간세포에 DMSO와 EG를 마지막으로 추가한 후 3분 후, 2 mL/min에서 펌프를 시작합니다.</li>
		<li>액체 질소에 모든 간세포가 첨가된 후 펌프를 중지하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 극저온 저장
<ol><li>도 1B와같이 20 G 바늘을 사용하여 50 mL 원추형 튜브의 뚜껑에 10 개의 작은 구멍을 뚫고 뚜껑의 외부를 유연한 필름으로 감쌉니다. 이것은 남은 액체 질소를 증발시키는 탈출을 가능하게하는 밸브를 만듭니다.</li>
	<li>유리화된 간세포 방울을 수집하려면 먼저 액체 질소 Dewar에서 깔때기를 제거합니다. 다음으로, 긴 집게를 사용하여 액체 질소에서 방울을 포함하는 원추형 튜브를 꺼내서 원추형 튜브에서 과잉 액체 질소를 천천히 부어 냅니다.</li>
	<li>구멍이 뚫린 뚜껑으로 원추형 튜브를 닫고 액체 질소 Dewar에 유리화 된 간세포 방울로 닫힌 원추형 튜브를 직접 놓습니다.</li>
	<li>액체 질소에서 원엽 튜브를 액체 질소 증기 저온 탱크로 옮김.</li>
</ol>3. 유리화된 간세포 방울의 재온난화
<ol><li>
재온난화 솔루션을 준비합니다.
	<ol>
<li>DMEM 간세포 배양 배지 100 mL에 자당 17.13 g을 용해하여 재온난화 용액을 만듭니다. 멸균 필터는 0.22 μm 필터를 사용하여 재온난화 용액을 37°C로 따뜻하게 걸다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
간세포에 다시 따뜻하게.
	<ol>
<li>저온 탱크에서 유리화 된 간세포로 원두 튜브를 가져 와서 액체 질소 Dewar로 운반하여 세포 배양 후드로 운반하십시오.</li>
		<li>뚜껑을 가볍게 풀고 원추형 튜브를 액체 질소에 다시 넣습니다.</li>
		<li>유리화된 간구 방울을 빈 비커에 넣고, 즉시 따뜻한(37°C) 재온난화 용액을 추가하고, 즉시 10s동안 저어줍니다. 참고: 재작업 중에 동결을 피하기 위해 신속하게 작업하는 것이중요합니다. 연구 요구 사항에 따라, 모든 유리방울에 몇 한 번에 다시 따뜻하게 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재웜 솔루션을 언로드합니다.
	<ol>
<li>두 개의 50 mL 원엽 튜브에 간세포로 재온난화 용액을 나눕니다.</li>
		<li>브레이크없이 4 °C에서 100 x g에서 2 분 동안 두 개의 원원튜브를 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급체는 원추형 튜브의 졸업 마크를 사용하여 총 부피를 12.5 mL남기고 원추형 튜브당 12.5 mL의 얼음 차가운 DMEM을 추가하여 재온난화 용액을 50%로 희석시다.</li>
		<li>간세포를 다시 일시 중단하고 3 분 동안 얼음에 배양하십시오.</li>
		<li>원추형 튜브당 25 mL의 얼음 차가운 DMEM을 추가하여 재온난화 용액을 25%로 희석시다.</li>
		<li>브레이크없이 4 °C에서 50 x g에서 5 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>상월체를 흡인하고 사용하기 위해 원하는 배양 배지의 2 mL에서 간세포를 재중단한다. 참고: 밀도 구배 원심분리는 원하는 경우 세포 현탁액에서 죽은 간세포를 제거하는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+and+bioartificial+liver+devices%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li>
<li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+transplantation%3A+Hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li>
<li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li>
<li>Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cryopreservation%3A+is+it+time+to+change+the+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).</li>
<li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation%3A+An+emerging+paradigm+change%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li>
<li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li>
<li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+encapsulating+droplet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).</li>
<li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li>
<li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-%CE%BCl+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li>
<li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+banking+in+living+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530(2011).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li>
<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
<li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li>
<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언합니다. Dr. de Vries, Weng, 토너, 테시에, Uygun 박사는 이 연구와 관련된 가처분 특허 출원을 가지고 있습니다. Uygun 박사는 장기 보존 기술 개발에 중점을 둔 기관인 Organ Solutions에 재정적 관심을 가지고 있습니다. 모든 연구자의 이익은 이해 상충 정책에 따라 MGH 및 파트너 건강 관리에 의해 관리됩니다.

간세포의 동결은 생존력과 신진 대사 기능을 감소시이어냅니다. Vitrification는 동결 부상이 완전히 피할 수 있기 때문에 고전적인 냉동 보존을위한 유망한 대안을 제공합니다9. 그러나, CPA를 가진 사전 인큐베이션은 임계 냉각 속도8을낮추기 위하여 요구됩니다. 따라서, 유리화는 CPA 독성17에 의해 방해되고 작은 샘플 부피에 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위한 노력의 일환으로 본 원고에 제시된 벌크 액적 유리화 방법은 낮은 사전 배양된 CPA농도(15)를사용하면서 다량의 세포의 유리화를 가능하게 하기 위해 개발되었다. 이러한 대량 액적 유리화는 문헌에서 가장 최적의 저속 동결 동결 보존 방법에 비해 간세포 생존율 및 대사 기능 증가로 이어집니다. 여기서, 절차의 실질적인 측면에 있는 대량 물방울 유리화및 상세한 통찰력의 포괄적인 방법이 제공된다.<...

간세포의 동결 보존 후 세포 생존력 및 대사 기능의 상실은 여전히 임상적용을제한하는 주요 문제이며1,2,3. 간세포 동결 보존의 벤치 마크 방법은 CPA (디메틸 설폭사이드 [DMSO], 포도당 및 알부민)로 간세포를 미리 배양하고 후속 제어 속도 동결 (약 1 °C / 분)에 수행되는 느린 동결입니다. 극저온4,5. 많은 보고된 최적화에도 불구하고, 얼음 형성의 동결 및 기계적 응력 동안 해로운 삼투성 불균형과 함께 CPA 독성은 느린 동결6,7의근본적인 단점으로 남아 있다.
Vitrification은 얼음 형성으로 인한 부상이 유리 상태로물의 직접 상 전환에 의해 완전히 회피되는 것을 통해 서두르는 이점을 제공한다6. 그러나 순수한 물(-137°C)의 유리 전이 온도에 도달하려면 유리 전이 온도 8 을 초과하는 얼음 형성을 피하기 위해 물은 초당 섭씨 100만 도(즉, 임계 냉각 속도)의 속도로 냉각되어야합니다. . CPA를 추가하면 임계 냉각 속도를 낮추고 수성 솔루션의 유리 전이 온도를 높일 수있습니다 9. 그러나 CPA 농도가 높은 경우에도(예: 40% v/v DMSO 이상) 빠른 냉각 속도는 그럼에도 불구하고 성공적인 유리화8,9에필요합니다.
필요한 냉각 속도와 높은 CPA 농도는 유리화의 두 가지 주요 단점을 초래합니다. 첫째, 빠른 냉각을 가능하게 하려면 시료의 열 질량이 낮아야 합니다. 둘째, 삼투성 손상을 피하면서 높은 CPA 농도에 도달하려면 CPA가 천천히 도입되어야하며 세포 내 구획과 세포 외 구획 사이에 완전히 균형을 이루어야합니다6. 이것은 유독한 CPA에 세포의 노출 시간을 증가시킵니다. 함께, 이것은 유리화한 번에 몇몇 작은 크기의 견본 (마이크로 리터)로 제한되는 성가신 프로세스를 만듭니다. 물방울 유리화는 이러한 제한에 대한 잠재적인 해결책으로서 제안되었다. 액체 질소에 최소 세포-라덴 방울(nanoliters)을 노출시킴으로써 냉각 속도가 현저히 증가하여 CPA농도10,11,12의 상당한 감소를 허용합니다. ,13,14. 다중 고주파 액적 발생 노즐을 동시에 사용할 수 있지만, 매우 작은 액적 크기는 분당마이크로리터10으로처리량을 제한하여 대형 셀의 효율적인 유리화를 배제합니다. 분당 밀리리터 의 순서에 더 높은 처리 속도볼륨.
최근에는 이러한 고유의 유리화한계를 벌크 액적유리화(15)에의해 극복할 수 있음을 입증했다. 이 새로운 방법은 신속한 삼투성 탈수를 활용하여 유리화 직전에 7.5% v/v 에틸렌 글리콜 및 DMSO의 세포내 CPA 농도를 집중하여 독성 CPA 농도의 완전한 평형화의 필요성을 제거합니다. 세포 탈수는 높은 세포외 CPA 농도에 간세포의 짧은 노출에 의해 유체 장치에서 수행된다. 이 노출은 급속한 삼투성 탈수를 일으키는 원인이 더라도, 세포로 확산하기 위하여 높은 CPA 사격량이 너무 짧습니다. 탈수 직후, 세포는 액체 질소에서 직접 유리화되는 액적에 로드됩니다. 이 방법은 높은 세포외 CPA 농도가 큰 액적의 유리화를 가능하게하여 CPA 독성을 최소화하면서 높은 처리량 볼륨을 생성하면서 높은 CPA 농도의 전체 세포 내 섭취의 필요성을 제거합니다.
물방울 유리화는 보존 후 직접 및 장기 생존력을 향상시키고, 1차 쥐 간세포의 형태및 대사 기능을 느리게 동결시킴으로써 고전적 냉동 보존에 비해향상된다. 이 원고는 1차 쥐 간세포의 대량 액적 유리화에 대한 방법론적 세부사항을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>BD 일회용 3mL 주사기, Luer-Lok 팁</td><td>포함, Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>비커</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr>, <tr><td>Belzer UW 냉장 보관 솔루션</td>, <td>Bridge to Life</td><td>BUW-001</td><td></td></tr>, <tr><td>소 혈청 알부민</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr>, <tr><td>Cole-Parmer 암컷 Luer-1/16" 로우 프로파일 반강성 튜브 미늘, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>극저온 스트로지 탱크 / Cryotank</td><td>차트 산업</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 분말, 고 포도당, 피루브 산</td> Life <td>Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>매우 긴 집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 고속 이지 리더 플라스틱 원심분리기 튜브 - 플랫 탑 클로저</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>낚싯줄</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 백금 경화 실리콘 튜빙, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>믹스 팁, 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 폴리프로필렌 파우더 퍼넬 ThermoFisher</td><td></td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>바늘 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - 유연한 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>스파튤라</td><td>콜-파머</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Steriflip 멸균 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (Crystalline/Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>온도 플라스크 탁상용 액체 질소 용기</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Vitrification은 생물학적 시료의 고전 저감 동결(약 1°C/min)의 냉동 보존을 위한 유망한 얼음 없는 대안입니다. 유리화는 해로운 얼음 형성을 피하면서 유리 상으로 물의 전환을 달성하기 위해 매우 빠른 냉각 속도를 필요로한다. 냉동 보호제(CPA)를 사용한 사전 인큐베이션은 생물학적 시료의 중요한 냉각 속도를 감소시킬 수 있지만, 유리화에 의한 얼음 없는 냉동 보존을 위해서는 일반적으로 고농도가 필요합니다. 그 결과, 유리화는 CPA 독성에 의해 방해되고 빠르게 냉각될 수 있는 작은 샘플로 제한됩니다. 최근에는 이러한 고유의 한계가 대량 액적 유리화에 의해 극복될 수 있음을 입증되었다. 이 새로운 방법을 사용하여, 세포는 먼저 낮은 세포 내 CPA 농도로 미리 배양된다. 급속한 삼투성 탈수를 활용하는 세포내 CPA는 독성 CPA 농도를 완전히 평형화할 필요 없이 유리화 바로 전에 농축됩니다. 세포 탈수는 유체 장치에서 수행되며 액체 질소에서 유리화되는 대형 액적의 연속높은 처리량 생성과 통합됩니다. 최소한의 CPA 독성을 가진 이 얼음 없는 동결 보존 방법은 대량의 세포 양에 적합하며, 기존의 느린 동결 동결 보존에 비해 간세포 생존력과 대사 기능이 증가합니다. 이 원고는 성공적인 대량 물방울 유리화에 대한 방법을 자세히 설명합니다.

5개의 상이한 쥐 간으로부터 갓 단리된 1차 간세포는문헌4에보고된 저명한 저속 동결 프로토콜을 이용하여 고전적인 동결보존에 대한 대량 액적 유리화의 직접적인 비교를 위해 사용되었다4, 5. 요컨대, 간세포는 BSA (2.2 mg / mL), 포도당 (333 mM), 및 DMSO (10 % v / v)로 보충된 UW에서 부유하고 제어 된 속도 냉동고를 사용하여 냉동하였다. -196°C에서 저장한 후, 샘플을 따뜻한 수조에서 해동하였다. 모든 얼음이 녹은 후, DMSO는 직접 희석되었고, 포도당 농도는 삼투성 손상을 감소시키기 위해 여러 단계 동안 점차적으로 낮아졌다. 정확한 프로토콜은 다른 곳에서 자세히 찾을 수 있습니다15. 보존 기간은 2 일에서 8 일까지 다양하고 동등한 비교를 보장하기 위해 각 생물학적 복제에 대한 대량 액적 유리화 및 동결 냉동 보존 사이에서 일치시켰습니다....

이 원고는 1 차 세포가 낮은 농도에서 저온 보호 제로 미리 배양되고 큰 물방울에서 유리화되는 다량의 쥐 간세포를 위한 얼음없는 동결 보존 방법을 기술합니다.

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

유리화는 전형적으로 극저온보호제의 독성에 의해 처리된다. 그리고 빠르게 냉각 할 수있는 작은 샘플에 다시 삽입. 이 프로토콜은 배양 전 동안 낮은 CPA 농도를 사용하는 동안 대량의 진동을 가능하게 합니다.빠른 삼투탈수를 사용하여, 낮은 지하실 간 CPA는 유리화바로 앞에 유체 장치에 집중됩니다. 이것은 완전히 독성 CPA 농도를 평형의 필요성을 제거합니다. 대량 물방울 진동은 간세포 이식 및 현재 냉동 보존 후 부적절한 결과에 의해 방해되는 생체 인공 간 장치를 사용하기위한 실행 가능하고 대사활성 간장을 제공 할 수 있습니다.이 방법은 잠재적으로 다량에서 저온 보존될 필요가 있는 그밖 세포 모형의 유리화를 위해 적응될 수 있습니다;혈액 제품 또는 줄기 세포 와 같은 그 외의 사이에서. 시작하려면, 위스콘신 대학 솔루션의 17.0 밀리리터에 BSA의 40 밀리그램을 추가하여 바이트로피케이션 1을 확인하십시오. 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 용액을 멸균하고 섭씨 4도에 보관하십시오.프로토콜에 설명된 대로 진동 솔루션 2를 만듭니다. 그리고 멸균 필터는 0.22 마이크로미터 필터를 통해 필터. 멸균 여과 된 V2 용액3.5 밀리리터를 3 밀리리터 주사기에 적재하고 섭씨 4도에 보관하십시오.벌크 액적 진동 장치를 준비하려면 먼저 혼합 바늘의 한쪽을 따라 잘라 외부 회색 슬리브. 슬리브를 열어 믹싱 바늘에서 제거합니다. 그런 다음 혼합 바늘을 길이 20mm로 자르고 컷오프 콘센트를 20 게이지 주입 바늘에 삽입합니다.혼합 바늘의 입구 위에 두 개의 25 밀리미터 실리콘 튜브 섹션을 밀어 넣습니다. 그리고 접착제로 자신의 위치를 확보. 자동 분해하여 이 어셈블리를 소독합니다.멸균 드워 플라스크를 액체 질소로 채웁니다. 그리고 멸균 라미너 플로우 세포 배양 후드에 배치하기 전에 이소 프로파놀로 외부를 살균. 액체 질소가 심각한 화상을 입을 수 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.액적 수집 장치를 만들려면 Dewar의 내지름과 동일한 외부 직경의 깔때기를 50 밀리리터 원추형 튜브에 삽입합니다. 큰 집게를 사용하여 최종 수직 위치에서 액체 질소에서 방울 수집 장치를 천천히 누릅니다. 원문 튜브가 드와르 바닥의 수직 위치에 있는지 확인합니다.그리고 액체 질소 수준은 깔때기의 가장자리보다 1 센티미터 낮습니다. 셀 배양 후드의 벽에 수직 위치에 주사기 펌프를 장착하려면 주사기 펌프의 발에서 세포 배양 후드 벽에서 튀어나온 나사에 끈을 묶습니다. 그런 다음, 수직으로 장착된 주사기 펌프 아래에 액상 질소 드와르를 액적 수집 장치로 놓습니다.갓 고립 된 쥐 간세포를 얻은 후, 삼판 파랑 배제에 의해 재고 농도를 계산합니다. 그리고 4천만 개의 가능한 간세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기습니다. 간세포는 50회 G로 분리하지 않고 5분간 원심분리합니다.상체를 흡인합니다. V1 솔루션의 3.4 밀리리터에서 간구를 다시 중단합니다. 그리고 3 분 동안 얼음에 배양.그런 다음 DMSO 150 마이크로리터와 150마이크로리터의 EG를 추가합니다.부드럽게 혼합하고 얼음에 다시 3분 동안 배양합니다. DMSO 150 마이크로리터와 150마이크로리터의 EG를 다시 간세포에 넣고 부드럽게 섞습니다. 3 밀리리터 주사기에 이 혼합물의 3.5 밀리리터를 적재합니다.미리 배양된 간구체와 주사기를 V2 용액으로 주사기에 주사기 펌프 어댑터에 삽입합니다. 두 개의 여성 루어 록 호스-바브 어댑터를 주사기에 부착합니다. 그리고 바브 피팅 위에 혼합 바늘 어셈블리의 실리콘 튜브를 밀어.이 전체 어셈블리를 주사기 펌프에 놓습니다. DMSO 및 EG의 마지막 버전이 간세포에 대한 3 분 후 분당 2 밀리리터로 펌프를 시작합니다. 결국 간세포가 액체 질소에 첨가되어 펌프를 중지합니다.20 게이지 바늘을 사용하여 50 밀리리터 원추형 튜브의 뚜껑에 10 개의 작은 구멍을 뚫습니다. 그리고 뚜껑의 외부를 유연한 필름으로 감싸서 왼쪽 위에 액체 질소를 증발시키는 밸브를 만듭니다. 유리화 간세포 물방울을 수집하려면 먼저 액체 질소로 드와르에서 깔때기를 제거하십시오.다음으로, 긴 집게로 액체 질소의 액적을 포함하는 원추형 튜브를 꺼내서 원추형 튜브에서 과도한 액체 질소를 천천히 부어 냅니다. 천공 된 뚜껑으로 원추형 튜브를 닫은 다음 액체 질소로 데와르에 유리화 된 간구 방울로 닫힌 원추형 튜브를 직접 배치하십시오. 마지막으로, 액체 질소에서 원물 튜브를 액체 질소 냉동탱크로 옮킨다.자당 및 DMEM 간세포 배양 배지로 재웜 용액을 만든 후 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다. 그런 다음 섭씨 37도까지 데우겠습니다. 간세포가 냉동 탱크에서 유리화 된 간세포로 원물 튜브를 제거하고 액체 질소 드와르에서 하위 배양 후드로 운반합니다.뚜껑을 가볍게 풀고 원추형 튜브를 액체 질소에 다시 놓습니다. 신속하게 작업하면 모든 유리화 된 간세포 방울을 빈 비커에 추가 한 다음 10 초 동안 교반하면서 섭씨 37도의 따뜻한 재집용 100 밀리리터를 신속하게 추가합니다. 액적들이 액체 질소 에서 제거되면 액적이 빠르게 다시 떼지 않으면 몇 초 이내에 동결이 발생합니다.따라서 교반하는 동안 다시 웜 미디어를 물방울에 직접 추가하는 것이 중요합니다. 재웜 용액을 간세포로 두 개의 50 밀리리터 원내 튜브로 나눕니다. 튜브를 섭씨 4도에서 100회 G로 2분간 원심분리합니다.슈퍼네이넌트는 튜브의 졸업 표시를 참조로 사용하여 총 12.5 밀리리터를 남길 수 있습니다. 재온 용액을 50%로 희석하려면 원추형 튜브당 12.5 밀리리터의 얼음 차가운 DMEM을 추가합니다. 3 분 동안 얼음에 다시 일시 중단하고 인큐베이션합니다.재온 용액을 25%로 희석하려면 원추형 튜브당 25밀리리터의 얼음 차가운 DMEM을 추가합니다. 섭씨 4도에서 50회 G에서 5분간 원심분리한 후, 상퍼를 흡인하고 원하는 배양 배지의 2밀리리터로 간구를 다시 중단한다. 멤브레인 무결성을 결정하는 트라이 팬 블루 배제 테스트로 측정하면 벌크 방울 이질로 인해 직접 보존 후 간세포 생존 가능성이 79 %이 고전 최적화 된 냉동 보존 후 68 %의 생존력보다 현저히 높았습니다.대량 물방울 진동의 수율은 56 %였는데 이는 고전적인 냉동 보존보다 10 % 높고 일관성이 있었습니다. 장기 대학 및 샌드위치 배양에서 프레스토 접착제 대사 분석 분석서를 사용하여, 간세포에서의 대사 활동은 고전적인 냉동 보존 후 대량 물방울 진동 후 상당히 높은 것으로 측정되었다. 알부민 합성, 간 세포의 합성 기능의 가장 널리 사용되는 매개 변수로, 대량 물방울 진동 후 거의 두 배에 의해 더 컸다, 다음 고전적인 냉동 보존 후.우레아 생산은 1주일 배양에서 간세포 해독 기능을 측정하는 데 사용되었습니다. 대량 물방울에서 상종 간세포에서, 우레아 생산은 고전적인 냉동 보존 간세포에서보다 상당히 높았다. 대량 물방울 진동 후 일관된 결과를 위해 CPA의 사전 인큐베이션 동안 타이밍을 정확하게 따르고이 프로토콜에 자세히 설명된 대로 다시 데우는 것이 중요합니다.유리화 된 간세포 물방울을 다시 데우면 더 나은 크기 조정 서스펜션으로 끝나므로 갓 고립 된 것처럼 모든 방식으로 사용할 수 있습니다. 개선된 보존 방법으로, 벌크 액적 진동은 연구 및 임상 응용을 위한 가용성 프리마를 증가시킬 수 있다.

bulk-droplet-vitrification-for-primary-hepatocyte-preservation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

동일한 공여자로부터 인간 간세포와 비실질 간 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 다양한 간 세포 유형은 기능적 간 모델 및 조직 공학의 기초를 구축합니다. 이 새로운 방법은 높은 수율과 생존력으로 간 세포를 분리하는 것을 목표로 합니다.

차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 대량 물방울 유리화를 이용한 쥐 1차 간세포 보존 방법을. 저농도 동결보호제와 급속 삼투 탈수로 세포 생존율과 대사 활성을 유지하여 간세포 이식 및 생체인공 간 장치 연구에 활용할 수 있습니다.

1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화

더 많은 동영상 탐색