Name: 미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 라이브 셀 이미징을 통해 미토틱 스핀들 역학과 세포 분열 과정을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 항미토틱 약물 효과 평가와 분열 결함 분석에 활용됩니다.

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DLM은 NSF GRFP에서 지원됩니다. ALM은 생물 의학 연구에 있는 우수성을 위한 스미스 가족 상에서 자금조달에 의해 지원됩니다.

1. 안정적으로 발현RFP-히스톤 2B (RFP-H2B) 및 α-tubulin-EGFP (욕조-EGFP)를 발현하는 hTERT-RPE-1 세포의 생성
참고: 모든 단계는 무균 기술을 따르고 생체 안전 수준 II+(BSL2+) 안전 캐비닛에서 진행됩니다.
<ol><li>지질계 형혈 전달 시스템의 제조사의 지시에 따라 적절한 렌티바이러스 플라스미드를 가진 293T 세포의 형질감염에 의해 관심 있는 유전자(α-tubulin-EGFP 및 RFP-H2B)를 운반하는 레트로바이러스를 생성한다.<ol>
<li>1일차: 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 서브 콘소293T 세포의 플레이트로부터 세포 배양 배지를 흡인하고 PBS의 5 mL를 첨가하여 인산완충식염수(PBS)로 잔류 배지를 씻어낸다. 소용돌이로 플레이트 바닥에 PBS를 분배한 다음 멸균 일회용 유리 파스테르 피펫으로 PBS를 흡인합니다.</li>
		<li>37°C로 미리 온온 0.05% 트립신 2 mL를 추가하고 37°C에서 가습된 인큐베이터로 플레이트를 2 내지 5분 동안 5%CO2로 돌려보내 서착 세포가 세포 배양 접시 표면에서 방출될 수 있도록 한다.</li>
		<li>트립신을 함유한 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 신선한 덜베코의 수정된 독수리 미디엄(DMEM) 8 mL을 첨가하세요.</li>
		<li>부드럽게 파이펫팅하여 세포를 다시 중단하고 멸균 된 15 mL 원엽 튜브로 현탁액을 옮김을 옮김. 원원수 튜브를 균형 잡힌 원심분리기에 놓고 실온에서 5분 동안 161 x g으로 회전하여 세포를 부드럽게 펠렛합니다.</li>
		<li>펠릿 세포로부터 배지/트립신 용액을 흡인하고 DMEM 10 mL에서 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충했습니다. 혈세포계를 사용하여 293T 셀 서스펜션 과 플레이트 2 x 106 293T 셀을 6 웰 플레이트의 웰당 계산합니다.</li>
		<li>배양 세포는 총 2 mL의 덜베코 변형 독수리 배지(DMEM)의 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하고 37°C에서 가습된 인큐베이터에서 5%CO2로유지한다.</li>
		<li>2일차: 피펫 7 μL의 지질계 형질감염 전달 시약 및 1.5 mL 마이크로원지소 튜브로 감소된 혈청 배지의 100 μL및 5분 동안 실온에서 배양할 수 있도록(튜브 #1).</li>
		<li>별도의 1.5 mL 마이크로원지 튜브에서 RFP-H2B 발현 벡터(또는 α-tubulin-EGFP 발현 벡터의 1 μg)의 피펫 1 μg(또는 α-tubulin-EGFP 발현 벡터 1 μg)과 함께 5 μL 인핸서 시약(제조업체의 지침에 따라 필요), 0.5 μg pMD2.G 및 1 μg 의 psPAX2 및 1000l 감소 혈청 매체 (튜브 #2).</li>
		<li>튜브 #2 조심스럽게 파이프 #1 20 분 동안 배양하여 1.1.7 단계 및 1.1.8 단계의 내용을 결합합니다. 참고 : 추가 우물에서 세포의 형질 감염에 필요에 따라 반응을 확장 할 수 있습니다.</li>
		<li>피펫형 형질전환 반응은 2 mL의 배지에서 293T 세포를 함유하는 원하는 웰에 하강하고 5%CO2로37°C에서 가습된 인큐베이터로 접시를 반환한다. 참고: RFP-H2B 및 α-tubulin-EGFP를 모두 발현하는 세포를 생성하려면 각 발현 구문에 대해 별도의 바이러스를 생성합니다(단계 1.1.7- 1.1.9).</li>
		<li>3일차: 배지를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 신선한 DMEM 2 mL로 배지를 흡인하고 교체하십시오. 접시를 37°C에서 5%CO2로가습된 인큐베이터로 되돌려 보입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4일차: 발현된 바이러스 입자를 함유하는 배지를 수집하여 293T 세포를 방해하거나 제거하지 않도록 주의한다. 바이러스 입자를 함유하는 배지를 5 mL 주사기에 부착된 0.45 μM 필터를 통과시킴으로써 필터링한다. 4°C에서 단기 저장을 위한 Aliquot 바이러스, 또는 -80°C에서 장기 저장. 참고: 이러한 방식으로 얻어진 바이러스 입자는 ~1 x 107 ~ 1 x 108 트랜스듀싱 유닛/mL 의 범위에 존재할 것이다. 감염되는 바이러스 생성 세포와 세포가 모두 동일한 배지에서 배양됨에 따라, 배지를 대체하기 위한 바이러스 농도는 필요하지 않으며 여과된 바이러스 입자는 세포를 감염시키기 위해 직접 사용될 수 있다.</li>
	<li>종자 2 x 105 hTERT-RPE-1 세포는 바이러스 감염에 대비하여 6-웰 접시의 웰당. DMEM의 2 mL에서 배양 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충하고 5%CO2로37°C에서 가습된 인큐베이터에서 유지한다.</li>
	<li>일 5: 헥사디메트린 브로마이드 (예를 들어, 폴리브레인)를 hTERT-RPE-1 세포에 8 μg/mL의 최종 농도에 첨가한다. 500 μL의 세포 배양 배지에서 희석된 바이러스의 혼합물로 세포를 감염시다. 참고: 헥사디메트린 브롬화물 스톡 용액은 멸균 증류수로 제조된 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과됩니다.</li>
	<li>일 6: 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 바이러스 감염 세포를 포함하는 우물에서 배지를 흡인. 세포 배양 배지를 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM의 2 mL로 대체하고, 플라스미드 통합 및 발현을 위해 선택할 항생제의 적절한 농도를 선택한다. 참고: 기재된 실험에서 사용된 α-tubulin-EGFP 발현 플라스미드는 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하고 RFP-H2B 발현 플라스미드는 블라스키딘 내성 유전자를 운반한다. 따라서, 10 μg/mL의 푸로마이신과 2 μg/mL의 블라스티신은 hTERT RPE-1 세포를 발현하는 α-tubulin-EGFP, RFP-H2B의 선택에 사용된다. 선택에 사용되는 항생제의 농도는 사용되는 다양한 세포주에 대해 다를 수 있다.</li>
	<li>5-7 일 동안 항생제 선택하에 세포를 유지하고 3 일마다 배지를 적절한 선택 시약을 포함하는 신선한 배지로 대체하십시오. 참고: 셀은 선택 중에 하위 합류 지점에서 유지되어야 하며 1.1.1단계에서 1.1.4단계로 설명된 대로 필요에 따라 확장되어야 합니다.</li>
	<li>면역형광 이미징을 사용하여 태그가 지정된 구문의 발현을 확인합니다. 참고: 원하는 경우, 단일 세포 클론은 세포 집단 내에서 균일한 발현 수준을 얻기 위해 유도될 수 있다. 일단 안정한 클론이 확인되면, 세포는 항생제 선택의 부재하에 표준 배양 조건 하에서 유지될 수 있다.</li>
</ol>2. 유사분열 스핀들 교란에 따른 라이브 세포 이미징용 세포 준비
참고: 무균 기술을 사용하고 BSL2 안전 캐비닛에서 단계를 수행합니다.
<ol><li>멸균 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, 발현 구도를 운반하는 세포주를 포함하는 배양 플레이트로부터 배지를 흡인(단계 1.7). 멸균 PBS 10 mL로 세포를 간략하게 씻으소서. 소용돌이로 플레이트 바닥에 PBS를 분배한 다음 멸균 일회용 유리 파스테르 피펫으로 PBS를 흡인합니다.</li>
	<li>10cm 플레이트에 0.05% 트립신 2mL를 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 2-5분 동안 또는 세포가 플레이트 표면에서 분리될 때까지 배양합니다.</li>
	<li>트립신이 들어있는 접시에 신선한 배지 8 mL를 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 다시 중단하고 멸균 된 15 mL 원엽 튜브로 현탁액을 옮김을 옮김. 원원수 튜브를 균형 잡힌 원심분리기에 놓고 실온에서 5분 동안 161 x g으로 회전하여 세포를 부드럽게 펠렛합니다.</li>
	<li>10 mL의 혈청학적 파이펫으로 부드럽게 파이펫팅하여 상류를 조심스럽게 흡인하고 PBS의 10 mL에서 다시 일시 중단하십시오. 원원수 튜브를 균형 잡힌 원심분리기에 놓고 실온에서 5분 동안 161 x g으로 회전하여 세포를 부드럽게 펠렛합니다.</li>
	<li>10 mL의 세레학적인 파이펫으로 부드럽게 파이펫팅하여 신선한 배지의 10 mL에서 상류를 조심스럽게 흡인하고 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>세포를 카운트한 다음, 혈정계를 사용하여 세포 번호를 계산하고 세포 배양 배지에서 1-2 x 105 세포/mL의 농도로 희석한다. 종자 500 μL의 세포 현탁액을 멸균된 12웰 이미징 바닥판의 각각의 웰에. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓고 세포가 플레이트 표면에 부착되도록 합니다. 참고: 살아있는 세포 화상 진찰은 심상 취득 도중 화상 진찰 면과 연관되는 남아 있기 위하여 세포를 잘 부착할 것을 요구합니다. 도금 다음 을 준수하는 세포에 필요한 시간의 기간은 다음에 하나의 세포주에서 다를 수 있으며, 연구하에 세포주에 최적화되어야한다.</li>
	<li>시간 경과 이미징을 시작되기 전에 최대 30 분, 세포로 시드 된 우물 중 하나 이상에 유사 분열 약물의 관련 농도를 추가하십시오. 유기 용매가 세포 거동에 미치는 잠재적 영향을 고려하려면 억제제희석제의 동일한 부피를 대조군으로 세포에 추가합니다. 예를 들어, 유사분열 키나제 오로라 A(예를 들어, alisertib)의 특이적 억제제의 100 nM의 첨가가 세포의 대조군 웰에서 이 약물에 대한 희석제인 DMSO의 동일한 부피와 평행화되도록 한다. 참고: 유사분열 진행의 동적 변화에 대한 비교 분석은 실험 조건과 병행하여 정상적인 유사토의 이미징을 가능하게 하기 위해 섭동이 없는 상태에서 세포의 우물을 준비해야 합니다.</li>
</ol>3. RFP-H2B, α-tubulin-GFP 발현 세포의 시간 경과 이미징을 위해 설정된 현미경(그림 1, 그림 2)
<ol><li>RFP-H2B를 함유하는 세포 배양판, α-tubulin-GFP 발현 hTERT RPE-1 세포를 고해상도 카메라(20x에서 0.67 μm의 픽셀 크기)가 장착된 반전 된 에피플루넌스 현미경에 적절한 단계 삽입으로 이미지화되도록 배치하고, 환경 챔버는 37 °C로 예열되고, 가습5%CO2를위한 전달 시스템. 참고: 밀폐된 환경 챔버 또는 온도 제어 스테이지 인서트가 가습된 5%CO2를 전달하여 안정된 온도 제어를 얻을 수 있는 경우에 적합할 수 있습니다.</li>
	<li>0.5의 수치 조리개와 함께 20x 공기 조개를 사용하고 고대비 형광 및 위상 대비 또는 밝은 시야 이미징을 위해 장착됩니다. 위상 대비 또는 밝은 필드를 가진 세포를 보고 현미경에 과정 및 정밀한 초점을 조정하여 세포를 초점으로 가져옵니다.</li>
	<li>이미지화될 형광단에 대한 적절한 여기 및 방출이 있는 각 필터 큐브를 선택하여 브라이트필드, GFP 및 RFP 이미지 수집을 위한 최적의 노출 시간을 식별하고 설정합니다. 또는 자동 노출 버튼을 클릭하여 미리 정해진 노출 시간을 입력합니다. 신호가 충분히 강렬하지 않은 경우 비닝 탭을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 2 x 2 픽셀 비닝을 선택하여 노출 시간을 단축하려면 픽셀 비닝을 선택합니다. 참고: 광독성은 유사분열 진행과 세포 생존력을 손상시킬 수 있습니다. 정상 유사점을 완료하기 위해 대조군에서 유사분열 세포의 실패는 노출 시간 및/또는 화상 진찰 기간이 더 최적화될 필요가 있다는 표시일지도 모릅니다.</li>
	<li>다중 좌표, 다중 웰 이미징을 동시에 획득하고 이미지 수집을 위한 매개 변수를 정의할 수 있는 수집 및 분석 소프트웨어를 사용합니다.<ol>
<li>제조업체의 지침에 따라 현미경 스테이지를 멀티 웰 접시로 선택하고 보정합니다. 이미지 수집 소프트웨어를 사용하여 사용 중인 플레이트 형식다이어그램에서 관련 웰을 클릭하여 이미지화할 웰을 강조 표시하거나 선택합니다.</li>
		<li>생성된 점 제어판(그림2)에서 포인트 배치 탭을 클릭하고 미리 정의된 또는 임의 좌표 배치를 선택하여 이미지화할 각 웰 내의 좌표를 정의합니다. 드롭다운 메뉴입니다. 작업 영역 탭을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 제한을 선택하여 좌표 선택 영역을 제한하여 웰의 경계를 제외합니다. 개수 및 분포 탭을 클릭하여 웰당 캡처할 포인트의 수와 분포를 각각 선택합니다. 참고: 5분 시간 분 단위로 웰당 이미지화할 수 있는 좌표 수는 이미지화할 웰 수와 각 채널의 노출 시간에 따라 제한됩니다. 전형적으로, 웰당 5-8좌표는 4시간 내에 유사분열을 통해 진행되는 각 조건에서 적어도 50개의 세포를 관찰하기에 충분하다.</li>
		<li>TimeSequence 제어판에서 값을 클릭하고 입력하여 이미지를 수집하는 시간 간격과 기간을 선택하고 입력합니다. 참고: 1~5분마다 이미지를 수집하여 유사분열 진행의 역학을 모니터링하는 것이 적절합니다. 이미징의 전반적인 지속 기간은 세포주및 원하는 종점 및 증식 속도를 반영해야 한다. 예를 들어, 4시간은 유사분열을 통해 많은 세포가 진행되는 것을 보기에 충분하며, 16시간은 유사분열을 통한 비동기 집단 진행에서 대부분의 RPE-1 세포를 보기에 충분하다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 유사분열 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 유사분열 세포 운명을 결정하는 타임랩스 이미지 분석
참고: 이미지 수집소프트웨어(재료 표),ImageJ 또는 비교 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행합니다.
<ol><li>RFP 필터 큐브로 캡처한 이미지를 선택하여 크로마틴으로 분류된 RFP-H2B를 시각화합니다. 초기 크로마틴다짐(그림2C,파란색 화살촉)과 핵 봉투가 분해된 것처럼 유사분열에 들어가는 세포를 식별합니다(α-tubulin-EGFP가 더 이상 핵 경계에 의해 배제되지 않는 경우).</li>
	<li>개별 세포에서 메타페이즈 정렬 및 anaphase 발병의 유사분열 타이밍 결정: 획득한 동영상에서 연속된 타임포인트를 통해 세포를 추적하여 유사분열 항목에서 RFP-H2B 라벨이 붙은 크로마틴까지의 시간 포인트/분 수를 결정합니다. 메타페이즈 동안 세포 적도에서 정렬을완료합니다(그림 2C,노란색 화살촉).</li>
	<li>유사분열 타이밍, 유사분열 성 충실도 및 세포 운명을 모니터링하기 위해 연속적인 타임포인트를 통해 세포를 추적하여 아나페이즈 염색체 분리가 명백한 시간 좌표를 식별합니다(그림2C,흰색 화살촉) 및/또는 염색질 디콤질 과 핵 봉투 개혁 (핵에서 tubulin 배제에 의해 표시된 대로) 발생한 곳. 참고: 스핀들 어셈블리 또는 유사분열 진행의 교란은 양극성 유사분열 스핀들을 획득하고 완전한 염색체 정렬을 달성하거나 아나페이즈 염색체 분리를 완료하는 데 필요한 시간의 함수로 평가될 수 있습니다.</li>
	<li>RFP-H2B를 시각화하여 아나페이즈 염색체 분리 동안 지연되는 염색체 및 염색질 다리를 포함하여 유사분열 결함을 나타내는 각 집단의 세포를 식별합니다. 참고: 손상된 유사분열 성 충실도는 또한 다중 핵화 또는 미세 핵화 된 딸 세포를 초래할 수 있으며 그림 3에서와같이 유사분열 출구 후 세포에서 시각화 될 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다.

타임랩스 이미징에 의해 제공되는 시간적 해상도는 단일 세포 내에서 순차적 세포 이벤트의 시각화 및 평가를 가능하게 합니다. 순차적 시점에서 세포의 수집 및 고정에 이어 세포 동기화를 사용하는 접근법은 궁극적으로 세포의 집단 간에 비교가 이루어진다는 점에서 제한적입니다. 섭동에 대한 세포 반응이 균일하지 않거나 시각화되는 프로세스가 동적인 상황에서, 라이브 셀 타임랩스 이미징은 단일 세포의 역학뿐만 아니라 이질성을 따르고 분석하는 데 더 적합합니다. 세포 집단 내에서. 이런 식으로, 시간 경과 화상 진찰은 유사분열의 동적인 단계를 통해세포 진행을 감시하고 이 진행에 교란이 궁극적으로 유사분열 세포 분열 및 후속 세포 운명의 충실도에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 특히 유용합니다.
살아있는 세포 화상 진찰에 많은 이점이 있는 동안, 중요한 도전은 가능한 한 고려하고 완화되어야 하는 연관됩니다. 한 가지 과제는 이미징 중에 세포 생존력과 증식을 보장하기 위해 적절한 환경 조건을 ...

고정 된 세포의 이미지 기반 분석은 일반적으로 다양한 섭동에 반응하여 세포 집단 수준 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 세포 동기화와 결합된 다음 직렬 시간 포인트의 수집 및 이미징을 수행하면 이러한 접근법을 사용하여 이벤트의 셀룰러 서열을 제안할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 고정된 세포 화상 진찰은 시간적인 관계가 인구를 위해 암시되고 개별 적인 세포의 수준에서 설명되지 않는다는 점에서 제한됩니다. 이런 식으로 고정 된 세포 이미징 및 분석은 강력한 표현형 및 정상 상태 변화를 관찰하기에 충분하지만 시간이 지남에 따라 일시적인 변화를 감지하고 세포의 하위 모집단에만 영향을 미치는 변화는 불완전합니다. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 단 하나 세포 내의 세포 및 세포 소 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있는 웅변 공구, 또는 셀 방식 인구, 시간이 지남에 따라 그리고 그 자체가 세포 행동에 영향을 미칠 수 있는 동기화 접근의 원조 없이 1개 , 2개 , 3개 , 4개 , 5개 , 6.
양극성 유사분열 스핀들의 형성은 세포 분열 동안 적절한 염색체 분리에 필수적이며, 그 결과 두 개의 유전적으로 동일한 딸 세포가 생성됩니다. 유사분열 성 진행을 손상시키고 염색체 분리의 충실도를 손상시키는 유사분열 스핀들 구조의 결함은 치명적인 세포 분열과 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다. 이러한 이유로, 스핀들 형성을 변화시키는 유사분열 독은암세포의급속한 증식을 제한하는 유망한 치료법7,8,9. 그럼에도 불구하고, 유사분열 독의 첨가에 따른 스핀들 구조의 고정 세포 분석은 스핀들 형성의 동적 과정을 평가하는 능력에 제한이 있으며, 스핀들 구조의 관찰된 변화가 영구적인지 또는 대신 일시적이며 성공적인 세포 분열을 허용하기 위해 극복 될 수있다.
이 프로토콜에서는, 우리는 살아있는 세포 화상 진찰에 의하여 스핀들 섭동을 따르는 유사분열의 역학을 평가하기 위하여 접근을 기술합니다. RFP 태그가 달린 히스톤 2B를 발현하기 위해 설계된 hTERT 불멸형 RPE-1 세포주를 사용하여 염색질을 시각화하고, EGFP 태그가 달린 α-tubulin과 함께 미세관을 시각화하고, 메타페이즈 염색체 정렬, 아나페이즈 발병의 타이밍을 시각화하고, 궁극적으로 유사분열 세포 운명은 염색체 운동, 다짐 및 핵 형태학의 시각적 단서를 사용하여 평가됩니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>25-510</td><td>배양 접시에서 부착 세포를 방출하는 세린 프로테아제</td></tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Fluor objective&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>밝은 필드와 형광을 모두 시각화하기 위한 Live-cell 이미징에 사용하기 위한</td></tr><tr><td>293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>레트로바이러스 트랜스펙션에 사용; 단계 1.1에서 사용</td></tr><tr><td>a-tubulin-EGFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>다양한 숫자</td><td>녹색 형광 단백질 태그에 융합된 알파 튜불린에 대한 발현 벡터; 생세포 이미징에서 튜불린의 시각화에 사용: Addgene 및 기타 공급업체를 통해 상업적으로 이용 가능</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>유사분열 키나아제 Aurora A의 소분자 억제제. 스톡 농도는 DMSO에서 10mM에서 준비되고 100nM의 최종 농도에서 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03</td><td>항생제 선택제; a-tub-EGFP 발현 세포</td></tr><tr><td>C02</td><td>Airgas</td><td></td>를 선택하는 데 사용됩니다. <td>세포 배양 및 라이브 셀 이미징에 사용됩니다</td></tr><tr><td>. Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>단일 대역 필터 세트; 여기 파장 545nm, 25nm 대역폭 및 605nm 파장에서 방출, 70nm 대역폭; H2B-RFP 시각화</td></tr><tr><td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>단일 밴드 필터 세트; 여기 파장 470nm는 40nm 대역폭과 525nm 파장에서 방출은 50nm 대역폭; GFP-튜불린</td></tr><tr><td>일회용 유리 Pastuer 피펫의 시각화를 위해, 멸균&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>흡인 세포에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>11965-084</td><td>RPE-1 및 293T 세포 성장을 위한 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>10438-026</td><td>세포 배양 배지 보충제</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 및 p3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>플라스미드 transfection을 위한 지질 기반 transfection 시약; 1.1.4</td></tr><tr><td>Multi well Tissue Culture Dish</td>에 사용됨<td></td><td>세포 배양, transfection/infection, 그리고 라이브 셀 이미징에 사용하기 위한</td> <td>다양한 Corning</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell</td></tr><tr><td>imaging NIS Elements HC&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>버전 4.51</td><td>이미지 수집 및 분석 소프트웨어; 섹션 3 & 4</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>31985-070</td><td>세포 형질 주입을 위한 감소된 혈청 배지에서 사용; 단계 1.1.3에서 사용</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>세포 배양 배지</td>인산염 완충 식염수(PBS)에 사용되는 <td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td> 항생제</tr><tr><td></td><td>Caisson labs</td><td>PBP06-10X1LT</td> 세포 배양 pMD2.G<td>와 함께 사용하기 위한 멸균 식염수</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>렌티바이러스 VSV-G 외피 발현 구조체, 1.1.4 단계에서 사용</td></tr><tr>폴리<td>브렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>바이러스 감염 효율을 향상시키는 데 사용되는 양이온 성 폴리머; 1.1.10 단계에서</td></tr><tr><td>사용 psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>2세대 렌티바이러스 패키징 플라스미드; 1.1.4 단계에서</td></tr><tr><td>사용 Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>Antibiotic selection agent; RFP-H2B 발현 세포</td></tr><tr><td>RFP-Histone 2B (H2B)</td><td>Addgene</td><td>다양한 번호를</td> <td>선택하는 데 사용적색 형광 단백질 표지 히스톤 2B에 대한 발현 벡터; 생세포 이미징에서 크로마틴의 시각화에 사용: Addgene 및 기타 공급업체를 통해 상업적으로 이용 가능</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td> SiRNA 구조 RPE-1 세포<td>의 지질 기반 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td>인간 망막 색소 상피 세포주</td></tr><tr><td>조직 배양 접시 100x20mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td>부착 세포 배양에 사용하기 위한</td></tr><tr><td>353003 Zyla sCMOS 카메라&nbsp;</td><td>세포의 이미지를 캡처하는 데 사용되는 마이크스코프에 부착된</td> <td>Nikon</td><td></td> 카메라</tr></tbody></table>

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰은 그렇지 않으면 간과될 지도 모르다 세포 프로세스에 통찰력을 제공하는 세포 생물학에 있는 중요한 공구, 오해, 또는 고정세포 분석에 의해 오해될 수 있습니다. 고정 된 세포 이미징 및 분석은 세포 정상 상태를 관찰하기에 강력하고 충분하지만 세포 수준에서 이벤트의 시간적 순서를 정의하는 데 제한 될 수 있으며 다음과 같은 동적 프로세스의 일시적인 특성을 평가하기에 적합하지 않습니다. 유사 분열. 대조적으로, 살아있는 세포 화상 진찰은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 셀 방식 프로세스를 관찰하기 위하여 이용될 수 있고 그렇지 않으면 고정된 세포 화상 진찰에서 제대로 표현될 프로세스의 역학을 붙잡기 위하여 능력을 가지고 있는 웅변공구입니다. 여기에서 우리는 염색체와 microtubules의 형광표지마커및 살아있는 세포 화상 진찰 접근에 있는 그들의 사용을 운반하는 세포를 생성하는 접근을 메타페이즈 염색체 정렬 및 유사분열 출구를 감시하기 위하여 기술합니다. 우리는 유사분열의 다양한 단계에서 세포의 식별, 유사분열 결함의 식별 및 추적, 스핀들 역학의 분석을 포함하여 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 이미징 기반 기술을 설명하고, 유사분열 억제제로 치료 한 후 유사 분열 세포 운명.

스핀들 교란이 있는 유사분열 진행평가 스핀들 폴 포커싱의 조절은 적절한 양극성 스핀들 형성에 필수적인 단계입니다. 이러한 과정에서 단백질 고갈, 약물 억제, 또는 중추의 변화로 인한 변형이 손상된 스핀들 구조및 미토화 진행을 지연 또는중단(10,11,12,13)등으로 한다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 섭동은 세포가 궁극적으로 anaphase 염색체 분리를 완료하기 위하여 유사체를 통해서 진행되는 스핀들 형성을 일시적으로지연시킵니다 14. 세포 동기화 접근법이 없는 경우, 이는 그 자체가 유사분열 과정에간접적으로 영향을 미칠 수...

여기에서 우리는 스핀들 형성 및 유사분열 진행의 역학을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 타임랩스 이미징을 적용하면 사용자가 유사분열의 다양한 단계에서 세포를 식별하고, 유사분열 결함을 추적 및 식별하며, 항 유사분열 약물에 노출될 때 스핀들 역학 및 유사분열 세포 운명을 분석할 수 있습니다.

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

라이브 세포 이미징은 단일 세포 내에서 시간이 지남에 따라 동적 세포 프로세스를 관찰할 수 있습니다. 이 접근은 세포 분열의 동적 프로세스에 영향을 미치는 조건을 평가하고 미토시스에 있는 결점이 딸 세포 증식 및 생존에 미치는 충격을 밝히기 위한 강력합니다. 이미징 중 광 노출로 인한 광독성은 이 프로토콜과 관련된 중요한 과제를 나타냅니다.따라서 노출 시간과 이미징 간격 및 지속 시간을 최적화해야 합니다. 무균 기술과 생물안전 수준 2안전 캐비닛을 사용하여, 멸균 일회용 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 발현 구조를 운반하는 세포줄을 포함하는 배양판으로부터 배지를 흡습한다. 간략하게 소용돌이와 멸균 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척하고 0.05 %의 트립신의 두 밀리리터로 세포를 치료.섭씨 37도에서 2~5분 후, 8밀리리터의 신선한 배지를 접시에 추가하여 반응을 멈추고 부드러운 파이펫팅으로 분리된 세포를 다시 중단합니다. 세포 용액을 멸균 15 밀리리터 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. PBS의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 원심분리합니다.셀 배양 배지 농도의 밀리리터 당 1~2회 10회 세포에 세포를 1~2회 희석시키기 위한 배지의 10밀리리터에서 펠릿을 재중단한다. 그런 다음 멸균 12웰 이미징 바닥 플레이트의 각 웰에 세포의 500 마이크로리터를 시드하고 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치하여 세포가 플레이트 표면에 부착할 수 있도록 합니다. 이미징 하기 전에 30 분 이상, 하나 이상의 우물에 미토 틱 약물의 관련 농도를 추가 하 고 컨트롤과 같은 수의 우물에 희석제희석제의 동일한 볼륨을 추가.이미징용 현미경을 준비하기 위해 고해상도 카메라가 장착된 반전 된 상피 성화 현미경의 단계에 플레이트를 배치하고, 섭씨 37도에 예열된 환경 챔버및 가습 5 % 이산화탄소를위한 전달 시스템. 0.5의 수치 조리개와 높은 대비 형광 및 위상 대비를 위해 장착된 20배의 공기 목표를 선택하거나, 밝은 필드 이미징을 장착하고 세포를 바라보며 과정을 조정하고 세포를 초점으로 데 초점을 맞출 수 있습니다. 밝은 필드, GFP 및 RFP 이미지 수집에 대한 최적의 노출 시간을 설정하려면 이미지화될 형광에 대해 적절한 여기및 방출이 있는 각 필터 큐브를 선택하고 재생을 클릭합니다.신호가 충분히 강렬하지 않은 경우 자동 노출을 조정하고 각 플루오로포어 채널에서 포맷 드롭다운 메뉴에서 적절한

live-cell-imaging-to-assess-dynamics-metaphase-timing-cell-fate

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

SAC는 자매 chromatids의 mitotic의 분리를 모니터링의 신호를 시작하는 곳이 kinetochore입니다. 방법으로 염색체 운동과 함께 kinetochore 단백질과 그 조정 중 하나의 모집 및 매출을 시각화하기 위해 설명되어...

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신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

선물이 HeLa 세포 분석 고해상도 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다음의 더블 티 미 딘 동기화에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 동기적으로 S 단계에서 또한 interphase 기능을 소유 하는 다기능 단백질의 mitotic 역할에 대 한 연구를 활성화 하는 유사 분열을 진행 하는 셀의 많은 수를 얻기에 키.

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라이브 셀 이미징 고정된 셀 이미징 혼자 여 달성 하지 않은 단일 셀 이나 전체 인구에 풍부한을 정보를 제공 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 프로토콜 안티 mitotic 마약 paclitaxel와 치료 다음과 세포 운명 결정을 평가 하는 설명 합니다.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

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여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

세포 분열은 형광성 으로 태그된 단백질 및 시간 경과 현미경 검사법을 사용하여 실시간으로 구상될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 사용자는 세포 분열 타이밍 역학, 유사분열 스핀들 어셈블리 및 염색체 의회 및 분리를 분석할 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi)-매개 유전자 녹다운 다음 이 사건에 있는 결점은 평가되고 정량화될 수 있습니다.

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단극성 미토틱 스핀들에서 디스크 현미경 검사법에 의한 미세소관 역학 측정

의 선택, microinjection, 그리고 영상은 형광을 통해 F - 굴지 찬란 - 라벨 (FSM) 현미경을 작은 반점을 찍다.

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

배우세요 라이브 셀 이미징을 통해 미토틱 스핀들 역학과 세포 분열 과정을 실시간으로 관찰하는 방법을. 이 기술은 항미토틱 약물 효과 평가와 분열 결함 분석에 활용됩니다.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

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