Name: Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pHın izlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Keşfedin, Candida albicans ve Streptococcus mutans ile çapraz krallık biyofilmleri yetiştirme ve konfokal mikroskopi ile hücre dışı pH izleme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal metabolizmayı gerçek zamanlı analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Anette Aakjær Thomsen ve Javier E. Garcia mükemmel teknik destek için kabul edilmektedir. Yazarlar görüntü analizi üzerinde verimli tartışmalar için Rubens Spin-Neto teşekkür ederiz.

Tükürük toplama protokolü Aarhus İlçesi Etik Komitesi (M-20100032) tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.
1. Krallıklar Arası Biyofilmlerin Yetiştirilmesi
<ol><li>Aerobik koşullarda 37 °C'de kan agar plakaları üzerinde S. mutans DSM 20523 ve C. albicans NCPF 3179 yetiştirin.</li>
	<li>Her organizmanın tek kolonilerini 5 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) ile dolu test tüplerine aktarın. 37 °C'de aerobik koşullarda 18 saat büyüyün.</li>
	<li>5 dk. 1.200 x g. Bir gecede kültürleri santrifüj, fizyolojik salin hücreleri resuspend ve C. albicans (~ 107 hücreleri / mL) ve S. mutans (~ 108 hücre / mL) için 0,5 OD550 nm ayarlayın. S. mutans süspansiyon seyreltmek 1:10 steril fizyolojik salin ile (~ 107 hücreleri / mL).</li>
	<li>Pipet 50 μL steril tükürük çözeltisi, de Jong ve ark.19yöntemine göre hazırlanan, mikroskopi için optik bir alt 96-iyi plaka kuyuları içine. 37 °C'de 30 dk kuluçka. Kuyuları 100 μL steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. Kuyuları boşaltın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL C. albicans süspansiyon ekleyin. 90 dk. 3x steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın 37 °C'de kuluçka. NOT: Yıkama sırasında kuyuları tamamen boşaltmayın. Aşırı kesme kuvvetini önlemek için 20°L'lik bir rezervuar bırakın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL ısı yalıtımlı fetal sığır serumu (56 °C'de 30 dakika için inaktive) ekleyin. 37 °C'de 2 saat boyunca inkübed. Steril fizyolojik salin ile 3x yıkayın. 20 μL'lik bir rezervuar bırakarak kuyuları boşaltın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL S. mutans süspansiyon (adım 1.3'te hazırlanmış) ekleyin. % 5 sakaroz içeren BHI 150 μL ekleyin. 37 °C'de 24 saat veya daha uzun süre kuluçkaya yatırın. Eski biyofilmleri yetiştirirken, orta günlük taze BHI değiştirin. Krallıklar arası biyofilm büyüme aşamasının sonunda steril fizyolojik salinle 5kat yıkayın.</li>
</ol>2. Oranmetrik pH Görüntüleme
NOT:Biyofilm büyümesi tamamlandıktan hemen sonra oranmetrik pH görüntülemenin yapılması gerekmektedir.
<ol><li>Oranmetrik pH görüntüleme için, 63x yağ veya su daldırma lensi, 543 nm lazer hattı ve spektral görüntüleme sistemi (yani META dedektörü) ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtmak için bir kuluçka makinesi kullanın.</li>
	<li>576−608 nm'den yeşil floresan tespiti ve 629−661 nm'den kırmızı floresan'ın eş zamanlı olarak algılanmasını sağlamak için dedektörü ayarlayın. Uygun bir lazer gücü seçin ve aşırı ve az pozlama önlemek için kazanç. NOT: Görüntülerin pozlanması en iyi palet görüntülerinde yanlış boyama ile görülür.</li>
	<li>İğne deliği boyutunu 1 Havadar Ünite veya ~0,8 m'lik optik dilimolarak ayarlayın. Ortalama seçeneği kullanarak 2 satır ortalaması seçin. NOT: Bir dizi denemenin başında, seçilen mikroskop ayarlarının bakteri hücreleri, mantar hücre duvarları, biyofilm matrisi ve mantar sitoplazması arasında net bir kontrast sağlayıp sağlamadığını kontrol edin.</li>
	<li>100 μL steril fizyolojik salin içeren hazırlayın 0.4% (w / v) glikoz, pH 7 titrated. C-SNARF-4 (dimetil sülfoksit 1 mM) bir stok çözeltisi hazırlayın. Boyayı 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin. DİkKAT: Oranmetrik boyayı kullanırken nitril eldiven takın.</li>
	<li>20 μL'lik bir rezervuar bırakarak, bir çapraz krallık biyofilm ile kuyulardan birini boşaltın. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve biyofilmi görüntülemeye başlayın.</li>
	<li>Biyofilmin farklı yerlerinde tek görüntü veya Z-yığınları edinin. Zaman içinde belirli görüş alanlarındaki pH değişikliklerini izlemek için mikroskop yazılımındaki X-Y konumunu işaretleyin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.</li>
	<li>Farklı bir kuyuda yetiştirilen her biyofilmin analizi için 2.4-2.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>3. Oranmetrik Boyanın Kalibrasyonu
NOT: Boyanın kalibrasyonu ve kalibrasyon eğrisinin montajı oranmetrik pH görüntülemeden farklı bir günde yapılabilir.
<ol><li>35 °C'de 0,2 pH birim adımlarla pH 4.0−7.8'e ayarlanmış 50 mM 2-morolinoetanesülfonik asit (MES) tamponu hazırlayın. Pipet 150 μL her tampon çözeltisi bir optik alt 96-iyi plaka kuyuları içine mikroskopi için.</li>
	<li>Boyayı 96 kuyulu plakanın tampon dolu kuyularına 30 μM'lik son konsantrasyona ekleyin. 5 dakika boyunca dengeleyelim.</li>
	<li>Mikroskop aşamasını 35 °C'ye ısıtın. Oranmetrik pH görüntüleme ile aynı mikroskop ayarlarını seçin. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Kuyuların dibine odaklan. Tüm tampon çözümleri için kuyunun alt kısmından 5 μm yukarıda iki görüntü (yeşil ve kırmızı kanal) edinin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak.</li>
	<li>Kalibrasyon deneyini triplicate olarak gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm görüntüleri TIF dosyaları olarak dışa aktarın. Bunları özel görüntü analizi yazılımına (yani ImageJ20'ye)aktarın. Lazerle çekilen görüntüleri, arabellek çözümlerinin ilgili görüntülerinden kapatarak İşleme' yi tıklatarak çıkarın | Görüntü Hesaplama | Çıkar ). NOT: Gerekirse, Resim | Kırpma.</li>
	<li>Yeşil kanal görüntülerini kırmızı kanal görüntüleri ne kadar bölve analiz et ' i tıklatarak ortaya çıkan görüntülerdeki ortalama floresan yoğunluklarını hesaplayın | Histogram.</li>
	<li>Üç aylık deneylerden, ortalama yeşil/kırmızı oranları pH'a göre çizin. Bir işlevi kalibrasyon verilerine (örneğin, MyCurveFit) sığdırmak için özel yazılım kullanın.</li>
</ol>4. Dijital Görüntü Analizi
NOT:Dijital görüntü analizi boya ve oranmetrik pH görüntülemenin kalibrasyonundan sonra herhangi bir zamanda yapılabilir.
<ol><li>Yeşil ve kırmızı kanallı biyofilm görüntülerini ayrı klasörlerde saklayın ve her iki dosya serisini sıralı sayılarla yeniden adlandırın (örneğin, GREEN_0001). Görüntüleri özel görüntü analizi yazılımına (örneğin, ImageJ) aktarın. Analiz Et ' i tıklatın | Histogram lazer kapalı çekilen görüntülerde ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek ve Süreç tıklayarak biyofilm görüntüleri değerini çıkarmak için | Matematik | Çıkar.</li>
	<li>2 resim serisini özel görüntü analizi yazılımına (yani daime21)aktarın. Kırmızı kanal görüntülerinin eşiğe dayalı bölümlemesini gerçekleştirin (Segment | Otomatik segmentasyon | Özel eşik). Mantar sitoplazmasının floresan yoğunluğunun üzerindeki 'düşük' eşiği ve mantar hücre duvarlarının ve bakterilerin yoğunluğunun altındaki 'yüksek' eşiği ayarlayın. NOT: Uygun eşikler seçildiğinde, yalnızca hücre dışı alanlar nesne olarak kabul edilir.</li>
	<li>Parçalı görüntü serisinin nesne katmanını yeşil kanal görüntü serisine aktarın. Bunu yapmak için Segment | Nesne katmanını aktarın. NOT: Hücre dışı alanlar ile mantar sitoplazması arasındaki kontrast tek tek renk kanallarında çok zayıfsa, Düzenleme 'yi tıklatarak segmentasyondan önce yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal serisine ekleyin | Görüntü hesap makinesi | Ek olarak. 4.2 altında açıklandığı şekilde segmentasyon gerçekleştirin ve parçalı görüntü serisinin nesne katmanını hem yeşil hem de kırmızı kanallı görüntü serisine aktarın.</li>
	<li>Kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisindeki nesne olmayan pikselleri silmek için nesne düzenleyicisini çalıştırın (Visualizer | Nesne editörü | Tüm görüntülerde | Nesne olmayan pikselleri silin). Şimdi biyofilm görüntüleri hem bakteriyel hem de mantar hücrelerinden temizlenir. İşlenen görüntü serisini TIF dosyaları olarak dışa aktarın.</li>
	<li>Her iki resim serisini de ImageJ'e aktarın. ImageJ, nesne olmayan tüm piksellere 0 yoğunluğu atar. Kırmızı görüntü serisini (R1) kendi başına bölerek bu pikselleri kaldırın (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Böl; Resim 2: R1) ve ortaya çıkan görüntü serisini (R2) orijinal kırmızı görüntü serisiile çarpma (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: R1; İşlem: Çarpma; Resim 2: R2). NaN'ın R1'de 0 şiddetinde tüm piksellere atanması dışında, R1 ile aynı olan üçüncü bir görüntü serisi (R3) oluşturulur. Yeşil görüntü serisi ile aynı şekilde devam edin.</li>
	<li>'Ortalama' filtresini kullanın (İşlem | Filtreler | Ortalama | Yarıçap | 1 piksel) kırmızı ve yeşil kanal görüntü serisi dedektör gürültü telafi etmek için. Yeşil kanal görüntü serisini kırmızı kanal görüntü serisine böl (İşlem | Görüntü hesap makinesi | Resim 1: G3; İşlem: Böl; Resim 2: R3). Ortaya çıkan görüntü serisi (G3/R3), tüm nesne pikselleri için yeşil/kırmızı oranını gösterir.</li>
	<li>Her görüntü için ortalama oranı hesaplamak (Analiz | Histogram). Görüntülerdeki oranların daha iyi görsel gösterimi için yanlış boyama uygulayın (Resim | Arama Tabloları). Yeşil/kırmızı oranları 3,6'nın altına takılan işlevi kullanan pH değerlerine dönüştürün.</li>
</ol>

<ol><li>Siqueira, J. F., Sen, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungi+in+endodontic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surgery%2C+Oral+Medicine%2C+Oral+Pathology%2C+Oral+Radiology%2C+and+Endodontics%22%5BJournal%5D)">Fungi in endodontic infections.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).</li>
<li>Matic Petrovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subgingival+areas+as+potential+reservoirs+of+different+Candida+spp+in+type+2+diabetes+patients+and+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects.</a> PloS One. 14 (1), 0210527(2019).</li>
<li>De-La-Torre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Candida+colonization+in+patients+with+chronic+periodontitis.+Is+there+any+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Iberoamericana+De+Micologia%22%5BJournal%5D)">Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship.</a> Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+co-infection+augments+Candida+pathogenicity+by+amplifying+the+mucosal+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response.</a> Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).</li>
<li>Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+oralis+and+Candida+albicans+Synergistically+Activate+%CE%BC-Calpain+to+Degrade+E-cadherin+From+Oral+Epithelial+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).</li>
<li>Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mucosal+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mucosal Candida albicans biofilms.</a> PloS One. 4 (11), 7967(2009).</li>
<li>Diaz, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+interaction+between+Candida+albicans+and+commensal+oral+streptococci+in+a+novel+in+vitro+mucosal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Early+Childhood+Caries%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Research%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis.</a> Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).</li>
<li>Falsetta, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans+synergizes+virulence+of+plaque+biofilms+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).</li>
<li>Hwang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+mannans+mediate+Streptococcus+mutans+exoenzyme+GtfB+binding+to+modulate+cross-kingdom+biofilm+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo.</a> PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407(2017).</li>
<li>Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exopolysaccharide+matrix%3A+a+virulence+determinant+of+cariogenic+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm.</a> Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).</li>
<li>Schlafer, S., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+Imaging+of+Extracellular+pH+in+Dental+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53622(2016).</li>
<li>Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+confocal+microscopy-based+method+to+monitor+extracellular+pH+in+fungal+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).</li>
<li>Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pH-ratiometry+for+the+three-dimensional+mapping+of+pH+microenvironments+in+biofilms+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions.</a> Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).</li>
<li>Hidalgo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tomographic+fluorescence+imaging+of+pH+microenvironments+in+microbial+biofilms+by+use+of+silica+nanoparticle+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).</li>
<li>Vroom, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth+Penetration+and+Detection+of+pH+Gradients+in+Biofilms+by+Two-Photon+Excitation+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).</li>
<li>Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+evidence+for+metabolic+and+chemical+microdomains+in+the+structured+polymer+matrix+of+bacterial+microcolonies%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies.</a> FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+strategy+for+three-dimensional+real-time+imaging+of+microbial+fuel+cell+communities%3A+monitoring+the+inhibitory+effects+of+proton+accumulation+within+the+anode+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environmental+Science%22%5BJournal%5D)">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+oral+Streptococcus+species+and+Actinomyces+viscosus+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daime%2C+a+novel+image+analysis+program+for+microbial+ecology+and+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research.</a> Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).</li>
<li>Barbosa, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+mutans+Can+Modulate+Biofilm+Formation+and+Attenuate+the+Virulence+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans.</a> PloS One. 11 (3), 0150457(2016).</li>
<li>Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oral+bacteria+on+growth+and+survival+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms.</a> Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).</li>
<li>Krzyściak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+Lactobacillus+Salivarius+Probiotic+on+a+Double-Species+Streptococcus+Mutans+and+Candida+Albicans+Caries+Biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm.</a> Nutrients. 9 (11), 1242(2017).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+Enhances+Interspecies+Relationship+between+Streptococcus+mutans+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans.</a> BioMed Research International. 2017, 7953920(2017).</li>
<li>Schlafer, S., Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+imaging+of+the+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix.</a> Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+extracellular+pH+in+bacterial+biofilms+with+C-SNARF-4%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).</li>
<li>Ohle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+microsensor+measurement+of+local+metabolic+activities+in+ex+vivo+dental+biofilms+exposed+to+sucrose+and+treated+with+chlorhexidine%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).</li>
<li>Schlafer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+landscapes+in+a+novel+five-species+model+of+early+dental+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm.</a> PloS One. 6 (9), 25299(2011).</li>
<li>Divaris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Supragingival+Biofilm+in+Early+Childhood+Caries%3A+Clinical+and+Laboratory+Protocols+and+Bioinformatics+Pipelines+Supporting+Metagenomics%2C+Metatranscriptomics%2C+and+Metabolomics+Studies+of+the+Oral+Microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, Clifton, N.J. 525-548 (2019).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+convection+around+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini review: convection around biofilms.</a> Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).</li>
<li>Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+Flow+disrupts+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: Flow disrupts communication.</a> Nature Microbiology. 1, 15012(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

C. albicans ve Streptococcus spp içeren çapraz krallık biyofilmlerin ekimi için farklı protokoller. daha önce9,22,23,24,25açıklanmıştır . Ancak, mevcut kurulum basit büyüme koşulları, düzenli çalışma günleri ile uyumlu bir zaman çizelgesi, dengeli bir tür bileşimi ve hacimli biyofilm matris gelişimi üzerinde duruluyor. Ayrıca, 96-iyi...

Hem mantar hem de bakteri türlerini içeren krallıklar arası biyofilmler oral kavitede çeşitli patolojik koşullarda yer almaktadır. Candida spp. sıklıkla endodontikenfeksiyonlardan izole edilmiş 1 ve periodontal lezyonlardan2,3. Mukozal enfeksiyonlarda, mitis grubundan streptokok türleri mantar biyofilm oluşumunu geliştirmek için gösterilmiştir, doku invazyonu, ve hem in vitro hem de murine modelleri yayma4,5,6,7. En ilginci, Candida spp oral taşıma. çocuklarda çürük yaygınlığı ile ilişkili olduğu kanıtlanmıştır8. Kemirgen modellerinde gösterildiği gibi, Streptococcus mutans ve Candidas albicans arasında simbiyotik bir ilişki hücre dışı polisakkaritüretimini artırır ve kalın ve daha karojenik biyofilm oluşumuna yol açar9,10.
Yukarıda bahsedilen tüm koşullarda, özellikle erken çocukluk çürükleri, biyofilm pH hastalığın ilerlemesi için önemlidir, ve asitojenik mikroortamların geliştirilmesi için biyofilm matris in güzide rolü11 devletler çapraz krallık biyofilm içinde pH değişiklikleri incelenmesine olanak sağlayan metodolojiler için çağırır. Bakteriyel12 ve mantar13 biyofilm içinde pH izlemek için basit ve doğru konfokal mikroskopi tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Oranmetrik boya C-SNARF-4 ve eşik tabanlı görüntü işleme sonrası, hücre dışı pH bir biyofilm14her üç boyutta gerçek zamanlı olarak belirlenebilir. Biyofilmlerde mikroskopise dayalı pH izleme için yayınlanan diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, C-SNARF-4 ile pH oranlı metrisi basit ve ucuzdur, çünkü referans boya15 veya iki foton uyarma16içeren parçacık veya bileşiklerin sentezini gerektirmez. Sadece bir boya kullanımı prob bölümleme ile sorunları önler, floresan kanama-through, ve seçici ağartma16,17,18 hala hücre içi ve hücre dışı pH arasında güvenilir bir farklılaşma için izin verirken. Son olarak, boya ile kuluçka biyofilm büyüme sonra yapılır, hangi laboratuvar ve yerinde yetiştirilen biyofilmler hem de incelenmesine olanak sağlar.
Bu çalışmanın amacı, pH orantisi kullanımını genişletmek ve krallıklar arası biyofilmlerdeki pH değişikliklerini incelemek için bir yöntem sunmaktır. Kavram kanıtı olarak, yöntem glukoza maruz kalan S. mutanlar ve C. albicanlardan oluşan çift tür biyofilmlerinde pH'ı izlemek için kullanılır.

<table><tbody><tr><td>Kan agar plakaları</td><td>Statens Serum Institut</td><td>677</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu</td><td>Oxoid</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kalp infüzyonu +% 5 sükroz</td><td>BDH laboratuvar malzemeleri</td><td>10274</td><td></td></tr><tr><td>Candida albicans</td><td>Ulusal Patojenik Mantar Koleksiyonu</td><td>NCPF 3179</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) - Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>daime: mikrobiyal ekolojide dijital görüntü analizi</td><td>Universit&auml; t Wien</td><td>N/A</td><td>Freeware; Sürüm 2.1; <a href="https://dome.csb.univie.ac.at/daime" target="_blank">https://dome.csb.univie.ac.at/daime</a></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco Life teknolojileri</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>GS-6R soğutmalı santrifüj</td><td>Beckman</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>N / A</td><td>Ücretsiz Yazılım; V1.46r; <a href="https://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij</a</td></tr><tr><td>>Java</td><td>Oracle</td><td>N/A</td><td>ImageJ'yi çalıştırmak için ücretsiz yazılım gereklidir; Sürüm 8.0; <a href="https://java.com/en/download" target="_blank">https://java.com/en/download</a></td></tr><tr><td>&micro;-Plate 96 Kuyu Siyah</td><td>Ibidi</td><td>89626</td><td></td></tr><tr><td>MyCurveFit</td><td>MyAssays Ltd.</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponu</td><td>Bioworld</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>PHM210 pH-metre</td><td>Radyometre Analitik Plan-Apochromat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63x yağa daldırma objektifi</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>NA=1.4</td></tr><tr><td>SNARF&reg;-4F 5- (ve-6) -Karboksilik Asit</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S23920</td><td></td></tr><tr><td>Steril fizyolojik tuzlu su</td><td>VWR</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Streptococcus mutans</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen</td><td>DSM 20523</td><td></td></tr><tr><td>Vis-spektrofotometre V-3000PC</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XL kuluçka makinesi</td><td>PeCON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 META</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

konfokal mikroskopi ile krallık lararası biyofilmlerde hücre dışı ph'ın izlenmesi

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy

Hem mantar hem de bakteri hücrelerinden oluşan krallıklar arası biyofilmler, endodontik enfeksiyonlar, periodontit, mukozal enfeksiyonlar ve en önemlisi erken çocukluk çürükleri gibi çeşitli ağız hastalıklarında rol oynarlar. Tüm bu koşullarda, biyofilm matrisindeki pH mikrop-konak etkileşimlerini ve dolayısıyla hastalığın ilerlemesini etkiler. Bu protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerdeki pH dinamiklerini izlemek için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntemi tanımlamaktadır. Biyofilmlerin hücre dışı bölgelerindeki pH düşüşlerini belirlemek için pH bağımlı çift emisyon spektrumu ve oranmetrik probu C-SNARF-4'ün boyama özellikleri nden yararlanılır. Prob ile pH oranlı metritrinin kullanımı, görüntüleme parametrelerinin titiz bir şekilde seçilmesi, boyanın ayrıntılı bir kalibrasyonu ve görüntü verilerinin dikkatli, eşik tabanlı post-processing'i gerektirir. Doğru kullanıldığında, teknik bir biyofilmin farklı alanlarında hücre dışı pH'ın hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ve böylece zaman içinde hem yatay hem de dikey pH degradelerinin izlenmesini sağlar. Konfokal mikroskopi nin kullanımı Z-profillemi 75 μm veya daha az ince biyofilmlerle sınırlarken, pH ratiometrisi kullanımı krallıklar arası biyofilmlerde önemli bir virülans faktörünün noninvaziv çalışması için idealdir.

24 saat ve 48 saat sonra, sağlam çapraz krallık biyofilmler kuyu plakaları geliştirdi. C. albicans ipliksi büyüme değişen derecelerde gösterdi ve S. mutans yüksekliği 35 μm kadar yoğun kümeler oluşturdu. Mantar hyphae etrafında gruplanmış Tek hücre ve S. mutan zincirleri ve büyük hücreler arası boşluklar hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir(Şekil S1).
Oranmetrik boyanın kalibrasyonu asimetrik sigmoidal eğri13,</sup...

Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH'ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

Cross-kingdom biofilms consisting of both fungal and bacterial cells are involved in a variety of oral diseases, such as endodontic infections, ...

Protokol, StreptococcuS'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin yetiştirilmesi için kolay bir yöntem sunuyor. mutans ve Candida albicans. Daha sonraki konfokal mikroskopi tabanlı pH ratiometrisi, bu biyofilmlerin hücre dışı matriks içindeki pH gelişimlerinin doğru izlenmesini sağlar.Görüntü edinme parametrelerinin dikkatli seçimi, sonraki analizler için yeterli kontrasta sahip görüntü verilerini elde etmek için son derece önemlidir. pH ratiometris gerçek zamanlı olarak çapraz krallık biyofilmlerde hem yatay hem de dikey pH gradyanları çalışma için hızlı, hassas ve ucuz bir yöntemdir. pH oranlı metritrisi tamamen mantar ve bakteriyel biyofilmlerde de yapılabilir.Bu yöntem biyofilmlerde mikrobiyal metabolizma anlayışımızı artırmaya katkıda bulunur. Biyofilm büyüme prosedürünü gösteren Anette Aakjaer Thomsen, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Aerobik koşullarda 37 santigrat derecede kan agar plakaları üzerinde S.mutans ve C.albicans grow.Sonra her organizmanın tek kolonilerini beş mililitre beyin kalp infüzyonu yla dolu tüpleri test etmek için aktarın ve bunları 18 saat daha büyütün. Ertesi gün, beş dakika için 1, 200 kez g kültürleri santrifüj ve supernatant atın. Fizyolojik salin deki hücreleri yeniden askıya alın ve Hem C.albicans hem de S.mutanlar için OD 550'yi 0.5'e ayarlayın.Sonra eşdeğer konsantrasyonları elde etmek için S.mutans süspansiyon 1 ila 10 seyreltmek. Pipet 50 mikrolitre steril tükürük çözeltisi mikroskopisi için optik bir alt 96 kuyuluk kuyularına. Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın, sonra tabağı 100 mikrolitre steril fizyolojik salin le üç kez yıkayın ve kuyuları boşaltın.Her kuyuya 100 mikrolitre C.albican süspansiyonu ekleyin, tabağı 37 derecede 90 dakika kuluçkaya yatırın, sonra kuyuyu tuzlu suyla üç kez yıkayın. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre ısı yalıtımlı fetal sığır serumu ekleyin. Tabağı iki saat kuluçkaya yatırın, sonra tuzlu suyla üç kez yıkayın.Kuyuları boşaltın, ancak aşırı kesme kuvvetini önlemek için 20 mikrolitrelik bir rezervuar bırakın. Her kuyuya %5 sakaroz ile 100 mikrolitre S.mutan syanımı ve 150 mikrolitre BHI ekleyin. Daha sonra 24 saat veya daha uzun süre 37 santigrat derece plaka kuluçka.Eski biyofilmleri yetiştirirken, günlük ortamı değiştirin. Krallıklar arası büyüme evresinin sonunda, tabağı steril fizyolojik salinle beş kez yıkayın. Oranmetrik pH görüntüleme için 63X yağ veya su daldırma lensi, 543 nanometre lazer hattı ve spektral görüntüleme sistemi ile ters konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.Mikroskop aşamasını 35 santigrat dereceye ısıtmak için bir kuluçka makinesi kullanın. Yeşil floresan'ın 576'dan 608 nanometreye ve kırmızı floresan629'dan 661 nanometreye eş zamanlı olarak algılanması için dedektörü ayarlayın. Sonra uygun bir lazer gücü seçin ve üzerinde ve az pozlama önlemek için kazanç.İğne deliği boyutunu bir hava ünitesine veya yaklaşık 0,8 mikrometrelik optik dilime ayarlayın. Ardından görüntü boyutunu 512'ye 512 piksel, tbmm hızını ise ikiye ayarlayın. Ortalama seçeneğini kullanarak iki satır ortalaması seçin.100 mikrolitre steril fizyolojik salin hazırlayın ve %0.4 glikoz pH 7'ye titre edin. Sonra C-SNARF-4 bir stok çözüm yapmak ve 30 mikromolar son konsantrasyona boya ekleyin. 20 mikrolitrelik rezervuar bırakarak çapraz krallık biyofilm ile kuyulardan birini boşaltın ve glikoz ve oranmetrik boya ile tuz ekleyin.Plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve görüntülemeye başlayın. 35 santigrat derecede 0,2 pH birim lik artışlarla pH 4 ila 7,8'e ayarlanmış 50 milimolar MES arabelleği hazırlayın. Pipet 150 mikrolitre her tampon çözeltisi optik alt 96-iyi plaka kuyularına.30 mikromolar konsantrasyonunda tampon dolu kuyulara boya ekleyin ve beş dakika boyunca dengesağlar. Mikroskop aşamasını 35 dereceye ısıtın ve daha önce açıklanan oranmetrik pH görüntüleme ile aynı ayarları seçin. 96 kuyulu plakayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve kuyuların dibine odaklanın.Tüm arabellek çözümleri için yeşil ve kırmızı kanal görüntüleri edinin. Düzenli aralıklarla, dedektör ofset düzeltmek için lazer kapalı görüntüleri almak. Kalibrasyon denemesini üç eritme de gerçekleştirin ve tüm görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.Yeşil ve kırmızı görüntüleri ayrı klasörlerde saklayın ve her iki dosya serisini de sıralı sayılarla yeniden adlandırın. Görüntüleri ImageJ gibi özel görüntü çözümleme yazılımına aktarın. Lazer kapalı çekilen görüntülerde, ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için analiz ve histogram tıklayın.İşlem, matematik ve çıkarma işlemini tıklatarak bu değeri biyofilm görüntülerinden çıkarın. Daha sonra iki resim serisini daime'ye aktarın ve segment, otomatik segmentasyon ve özel eşiği tıklatarak kırmızı kanal görüntülerinin eşiğe dayalı bölümlemesini gerçekleştirin. Mantar sitoplazmasının floresan yoğunluğunun üzerindeki düşük eşiği ve mantar hücre duvarlarının ve bakterilerin yoğunluğunun altındaki yüksek eşiği ayarlayın.Daha sonra segmente tıklayarak ve nesne katmanı aktararak parçalı görüntü serisinin nesne katmanını yeşil kanal görüntü serisine aktarın. Kırmızı ve yeşil kanal serisindeki nesne olmayan pikselleri silin. Şimdi biyofilm görüntüleri bakteri ve mantar hücrelerinden temizlenir ve TIFF dosyaları olarak ihraç edilebilir.Görüntü serisini ImageJ'e geri aktarın ve kırmızı resim serisini tek başına bölün. Ardından sonucu özgün görüntü serisiyle çarpın. Ortaya çıkan görüntü serisi, sıfır yoğunluktaki tüm pikseller kaldırılsa da orijinalle aynıdır.Yeşil görüntü serisi ile işlemi tekrarlayın. Ardından, dedektör gürültüsünü telafi etmek için her iki görüntü serisindeki ortalama filtreyi kullanın. Yeşili kırmızı görüntü serisine bölün ve bu da tüm nesne pikselleri için yeşil-kırmızı oranını verir.Sağlam krallıklar arası biyofilmler 24 ve 48 saat sonra kuyu plakalarında geliştirildi. Mantar hyphae ve büyük hücre içi boşluklar etrafında gruplanmış tek hücre ve S.mutan zincirleri hacimli bir matrisin varlığını göstermiştir. Hücre dışı alandaki pH bir arama tablosu kullanılarak görüntülendi.Biyofilmlerdeki hücre dışı pH glikoza maruz kaldıktan sonraki ilk beş dakika içinde hızlı bir şekilde düştü. Bundan sonra, asitleşme genellikle 15 dakika sonra 5,5-5,8 değerleriulaşan yavaşladı. Yerel pH değişimleri nedeniyle biyofilmlerdefloresan yoğunluğu zaman içinde değişmiştir.Görüntü segmentasyonu sırasında, bakteri ve mantar hücrelerinin kapsadığı tüm alanları yeterince ortadan kaldırmak için yüksek ve düşük eşikler seçilmiştir. Mavi ve yeşil alanlar sırasıyla düşük ve yüksek eşikler tarafından elendi. Görüntü edinme parametrelerinin dikkatli seçimi bakteri hücreleri, mantar hücreleri ve biyofilm matrisi arasında iyi bir kontrast elde etmek için çok önemlidir.Akış hücrelerinde krallıklar arası biyofilmler yetiştirilirse, pH gelişmeleri ağız boşluğundakileri taklit eden akış koşulları altında izlenebilir. pH oranları, özellikle düşük pH'lı dental biyofilmlerde ki yerel alanları belirlemek için kullanılmıştır.

monitoring-extracellular-ph-cross-kingdom-biofilms-using-confocal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Ortodontik aletler doğal oral biyofilm yapısal ve kompozisyon analizi için bir protokol...

Floresan In-Situ Hibridizasyon ve Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Palatal Genişleticilerden Oral Biyofilm Analizi

Kaynak: Schlafer, S ve Frost Kristensen, M. Konfokal Mikroskopi kullanarak Çapraz Krallık Biyofilmlerinde Hücre Dışı PH'ın İzlenmesi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, Streptococcus mutans ve Candida albicans'ın ağız benzeri koşullarda biyofilmler çapraz yetiştirilişini göstererek bakteriyel-mantar etkileşimlerini modellemekte; böylece mikrobiyal sinerji, glukan aracılı yapışma ve ağızdan patogenezde asidijenik virülans incelenmesini mümkün kılar.

Ağızdan Patogenezi İnceleme İçin Bakteriyel-Mantar Çapraz Biyofilmlerin Oluşturulması

Bu videoda, mikroskopi kullanarak mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilmleri büyütmek ve kalitatif olarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriyel biyofilmler sıklıkla mantar yüzeylerinde oluşur ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim sürecini içerir.

Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Bu video, pH'a duyarlı bir oransal prob kullanılarak dental biyofilmlerde hücre dışı pH'ı izlemek için gerçek zamanlı bir testi göstermektedir. Yerinde yetiştirilen bir bakteri biyofilmi glikoza maruz kaldığında, bakteriyel biyokütlenin yakınındaki hücre dışı pH'daki bir azalma probu protonlar protonlar ve bakteri içindeki konsantrasyonunun artmasına neden olur. Protonlanmış ve protonlanmamış prob arasındaki emisyon dalga boyundaki eşitsizlik, biyofilmin hücre dışı matrisi boyunca pH'ı...

Dental Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın Gerçek Zamanlı İzlenmesi için Bir Test

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Bir pH-duyarlı rasyometrik boya gerçek zamanlı olarak diş biyofilmlere ekstrasellüler pH izleme konfokal lazer tarama mikroskobu ve dijital görüntü analizi ile kombinasyon halinde kullanılır.

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Akış Sitometresi görsel kümeleme ile birlikte su biyofilmler çalışmak için kullanımı kolay ve hızlı bir yöntem sunar. Biyofilm karakterizasyonu, biyofilm toplum yapısındaki değişikliklerin tespiti ve biyofilm içinde gömülü abiyotik parçacıklar tespiti için kullanılabilir.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Keşfedin, Candida albicans ve Streptococcus mutans ile çapraz krallık biyofilmleri yetiştirme ve konfokal mikroskopi ile hücre dışı pH izleme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyal metabolizmayı gerçek zamanlı analiz etmeye yardımcı olur.

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

Daha fazla video keşfet