Name: 전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 레이어형 장착법을 통해 Danio rerio 배아의 장시간 공초점 현미경 촬영을 수행하는 방법을. 이 기술은 취약한 수생 모델의 성장을 허용하면서도 위치를 고정하여 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 알버트 팬과 아른트 시에크만에게 형질전환 생선 선물을 주셔서 감사합니다. 일본 문화체육관광부의 국립생물자원사업인 국립유전학원의 가와카미 고이치(Koichi Kawakami)에게 형질전환 제브라피쉬 HGn39b의선물에 감사드립니다. 우리는 또한 공초점 현미경 검사법에 대한 도움을 파티마 상인과 캐슬린 Gajewski, 사진에 대한 트레이시 테리아울트에 감사드립니다.
이 작품은 국립 보건원의 국립 환경 보건 과학 연구소의 보조금에 의해 지원되었다 (보조금 번호 P30ES023512 및 계약 번호 HHSN2732015000010C). SU는 Keck 전산 암 생물학 프로그램 (걸프 코스트 컨소시엄 CPRIT 교부금 RP140113)과 휴 로이와 릴리 인다우먼트 기금의 펠로우십에 의해 지원되었습니다. J-Å G는 로버트 A. 웰치 재단 (E-0004)에 의해 지원되었다.

여기에 제시 된 동물 작품은 휴스턴 대학과 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었습니다.
1. 생선 축산
참고: 척추동물 모델로 작업하려면 IACUC 승인 프로토콜이 필요합니다. 관련 국내 및 국제 지침에 따라 수행해야 합니다.
<ol><li>이전에 출판된 문헌9에설명된 바와 같이 성체 얼룩말어를 유지한다.</li>
	<li>오후에는 성인용 제브라피시를 번식탱크에 놓습니다. 1:2의 비율로 암컷에 남성을 번식.</li>
</ol>2. 솔루션 준비
<ol><li>배아 매체에서 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 만드십시오 (E3 : 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,pH 7.0으로 조정). 스톡 용액을 1.5 mL 튜브에 Aliquot하고 4 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>증류수에서 4%(v) 트리카인(MS-222)의 재고 용액을 만드십시오. 어두운 병에 4 °C에서 보관하십시오. 주의: 트리카인은 독성이 있으며 무게를 측정하고 연기 후드에 용해시켜야 합니다.</li>
	<li>증류수에서 20 mM N-페닐티우레아 (PTU)의 재고 용액을 만드십시오. -20 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. 배아의 준비
<ol><li>짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 26.5 °C에서 배양한다. 참고: 이것은 태아가 화상 진찰의 시작에 대략 30 somite 단계에 이다 는 것을 그래서 태아의 발달을 감속합니다.</li>
	<li>E3에서 0.016-0.020 % 트리카인에서 배아를 마취하십시오. 색소 침착을 억제하려면 PTU를 200 μM의 농도에 추가하십시오.</li>
	<li>해부 현미경으로 집게를 사용하여 배아를 초질. 두 개의 집게를 사용하여, 그립과 부드럽게 배아를 해제 하기 위해 떨어져 융기를 당겨.</li>
</ol>4. 아가로즈에 장착
참고: 개발된 마운팅 방법은 필요에 따라 0.02% 트리카인과 PTU를 가진 E3에서 저용융 아가로스의 두 가지 농도가 필요합니다. 첫 번째 아가로즈 용액은 왜곡과 운동성이 최소한인 아가로스의 최적의 농도를 함유하고 있습니다. 최적화는 아래 5단계에서 설명합니다.
<ol><li>두 층(5단계에서 정의된 농도) 및 1%에 대해 아가로즈 용액을 가열합니다. 65 °C. 아가로즈를 장착 직전에 약 30°C까지 식혀 배아가 열에 의해 해를 입지 않도록 하십시오. 장착시, No. 0 커버 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 접시의 바닥에 부착 된 커버 유리는 배아를 배치할 10mm 얕은 (약 1.2mm 깊이)을 잘 만듭니다. 참고: 이 경우, 운동성 및 왜곡이 가장 적은 농도는 0.025~0.040% 아가로즈 사이였다.</li>
	<li>유리 피펫이나 마이크로 파이펫을 사용하여 접시의 바닥으로 측면 중 하나를 사용하여 dechorioned 배아를 부드럽게 놓습니다. 마이크로파이펫을 사용하는 경우, 배아에 맞게 개구부 크기를 증가시키기 위해 팁의 바깥 부분을 절단한다(도1A). 마이크로파이펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>배아를 덮기 위해 접시의 바닥에 부착된 커버 유리에 의해 생성된 작은 우물에 제1 아가로즈 용액을 첨가한다(Layer 1)(도1B). 아가로즈가 작은 우물을 덮지만 넘지 않도록 하십시오.</li>
	<li>커버 글래스(22 mm x 22 mm)로 작은 우물을 덮어(도1C)를두 개의 커버 안경 사이에 배아로 채워진 좁은 아가로즈 공간을 조성한다.</li>
	<li>접시 의 바닥 전체에 커버 유리의 상단에 1 % 아가로즈 용액의 층을 놓습니다 (층 2)(그림 1D). 이 층이 굳어지면 커버 유리를 제자리에 고정시됩니다.</li>
	<li>접시의 나머지 부분을 0.02% 트리카인을 함유한 E3로 채우어 시스템을 수화(층 3)(도1E)로유지한다. 참고: 이 설정에서 커버 글래스와 1% 아가로즈는 바닥 층이 희석되지 않도록 보호합니다.</li>
</ol>5. 계층 1에 대한 아가로즈 솔루션의 최적화
<ol><li>계층 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하려면 다중 스케일 그리드 검색 방법을 사용합니다. 아가로즈의 농도가 0.01%에서 1%로 증가하는 데 서 배아를 탑재한 다음, 시야에서 배아 성장 제한 및 운동성의 시간 경과 이미징이 뒤따릅니다. 왜곡과 운동성이 모두 최소인 농도를 식별합니다.</li>
	<li>아가로즈의 농도를 더욱 최적화하기 위해, 5.1단계에서 가장 좋은 것으로 밝혀진 농도에 따라 아가로스의 농도(예를 들어, 0.025~0.040% 아가로즈)의 미세한 농도 범위를 사용하여 배아를 장착한다(예를 들어, 0.025%, 0.028%, 0.031%, 등). 참고 : 우리의 실험실에서, 최적의 아가로즈 농도는 약 이었다 0.03%.</li>
</ol>6. 타임랩스 이미징
참고: 이 장착 방법은 형광 및 밝은 필드 이미징을 위한 타임랩스 기능을 갖춘 모든 반전된 현미경에 작동합니다.
<ol><li>최대 55 시간 동안 전체 배아 또는 그것의 부분에 대한 시간 경과 이미징을 수행합니다. 여러 배아의 이미징을 위해 접시당 하나의 배아가 장착된 여러 접시를 담는 스테이지 어댑터를 사용하십시오. 배아가 눈으로 결정된 대로 대략 수평으로 위치되도록 접시를 하나씩 회전시다. 최적의 배아 성장 및 발달을 위해 28.5°C로 설정된 인큐베이터를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오.</li>
	<li>현미경 소프트웨어에서 낮은 배율 목표를 선택합니다. 눈 조각 아래에서 밝은 필드 조명을 사용하여 접시를 회전시켜 배아를 수평으로 찾고 미세하게 정렬하고 소프트웨어에서 위치를 기록합니다. 데이터를 자동으로 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다. 참고: 본 실험에서, 계획 apo λ 4x 0.2 NA 대물및 ND 획득 창 내의 XY 탭을 사용하여 배아의 위치를 기록하였다. 데이터는 .nd2 형식으로 저장되었습니다. 목표는 Ti 패드 탭에서 아이콘을 클릭하여 선택되었습니다.</li>
	<li>핀홀 크기, 스캔 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 설정합니다. 다음으로 이미지를 캡처할 때 더 높은 배율 목표를 선택합니다. 참고: 본 실험에서, 전체 배아의 이미징에 계획-아포 10x 0.45 NA 목표가 사용되었고, 초형플루어 20x 0.75 NA 대물렌즈를 배아 부분의 더 높은 배율 이미징에 사용하였다. 핀홀은 1.2AU(10x 렌즈의 경우 19.2 μm)로 설정되었으며, 스캔 속도는 2.4 μs의 픽셀 거주 시간 동안 설정되었고 이미지 크기는 스캔 줌으로 1024 x 1024 픽셀로 설정되었으며, 10x 렌즈의 경우 1.24 μm의 픽셀 크기를 제공하며, 20x 렌즈의 경우 0.62 μm.</li>
	<li>이미지할 형광 채널을 선택합니다. 한 번에 하나의 채널에 이미지 캡처 설정을 조정합니다. 각 형광 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 채도를 피하고 광 표백을 제한하면서 가능한 최상의 동적 범위를 수집하십시오. 참고: 본 실험에서, GFP는 488 개의 녹색 채널(488 nm 레이저 및 500~550nm 사이 방출) 및 561 적색 채널(561 nm 레이저 및 570~600 nm 사이 방출)을 이용한 RFP로 이미지화되었고, 전송 이미지는 561 nm 레이저 및 투과광검출기(T)를 사용하여 수집하였다. </li>
	<li>전체 배아를 10배 의 목표로 이미지화하기 위해, 현미경 소프트웨어를 사용하여 여러 시야를 겹치게 하고 함께 스티치합니다. 참고: 배아가 이미징 중에 크기가 상당히 커지기 때문에 배아의 전방 및 후방 시야에 공간이 있는지 확인하십시오. ND 수집 창의 큰 이미지 스캔 탭을 사용하고 10% 겹치는 4 x 1 패턴을 선택하여 인접한 4개의 뷰 필드를 캡처합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 사용하여 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다. 참고 : 배아는 유리 접시의 바닥에 가깝게 장착되기 때문에, 그 중심은 성장함에 따라 바닥에서 멀리 이동합니다. ND 수집 창의 Z 탭을 사용하고 비대칭 상대 범위를선택합니다. 이 방법을 사용하면 현재 포커스 평면이 참조 평면으로 사용되고 나머지 평면은 Z 스택 부피 내에서 전체 배아를 포함하기 위해 위와 아래에 비대칭으로 분포되어 표본의 성장을 고려할 충분한 공간이 있습니다. 모든 실험에서, 간격은 11 μm및 약 45개의 평면으로 총 범위를 설정하였다.</li>
	<li>장기 시간 경과 화상 진찰 도중 다중 태아의 초점을 유지하기 위하여는, 자동화한 포커스를 이용하십시오. 여러 배아를 이미징하는 경우 각 배아의 개별 오프셋 수준을 조정하여 참조 평면에초점을 맞춥니다. 참고: 이 실험에서는 레이저 기반 초점 안정화 시스템이 사용되었습니다.</li>
	<li>약 1시간 간격으로 55시간 동안 현미경 소프트웨어 및 이미지에서 타임랩스 파라미터를 설정합니다. 각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 각 주기 후에 자동으로 데이터를 저장합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어의 온라인 또는 오프라인 버전을 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지화된 경우, 이미징 위치에 따라 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다. 최대 강도 투영 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 세트를 2D 시간 데이터 세트로 변환합니다. 메뉴로 저장 옵션을 사용하여 .avi를 파일 형식으로 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 5프레임/s의 재생 속도에 대해 200ms 간격으로 압축 없음 옵션을 선택합니다. 참고 : 이 실험에서 두 배아의 원래 데이터 세트는 소프트웨어의 분할 위치 함수를 사용하여 분할되었습니다(파일 | 가져오기/내보내기 | 멀티포인트 분할). 3D 시간 데이터 세트를 최대 강도 프로젝션 기능을 사용하여 2D 시간 데이터 세트로 변환했습니다(이미지| ND 프로세싱 | Z)에서 최대 강도 투영 이미지를 만듭니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

전체 제브라피시 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법에 대한 장착 방법이 여기에 설명되어 있다. 장착 방법에 대한 가장 중요한 단계는 무제한 제브라피시 배아 성장을 허용하는 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 동시에 공초점 이미징을 위해 배아를 완전히 고정 된 위치에 유지하는 것입니다. 아가로즈의 최적 농도가 매우 좁기 때문에, 이 값은 용액을 제조하는 동안 아가로오스의 중량 및 E3의 부피의 측정 오류에 매우 민감하다. 최적 농도는 또한 배아의 온도 및 단계에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 최적 농도는 상이한 농도의 시험의 반복을 통해 아가로스 용액의 각각의 새로운 배치에 대해 재정의될 필요가 있을 것이다.
또 다른 중요한 단계는 아가로즈의 제2층을 첨가하는 마운팅 방법에 있다. 두 번째 레이어는 커버 글래스를 제자리에 놓습니다. 커버 유리가 움직이지 않도록 한 번에 조금씩 신중하게 접시에 추가해야합니다. 두 번째 층은 E3의 투과성 장벽역할을 합니다. E3가 없으면 배...

제브라피쉬는 오랫동안 발달 생물학의 모델 유기체였으며, 현미경 검사법은 배아 발달을 시각화하는 주요 방법입니다. 발달 연구를 위해 zebrafish 배아를 사용하는 장점은 작은 크기, 광학 선명도, 빠른 개발 및 성인 어류의 높은 배변성을 포함합니다. 특정 조직 또는 세포에서 형광을 발현하는 형질전환 제브라피시 라인의 생성은 더 큰 척추동물로는 불가능한 방법으로 조직 발달을 직접 시각화할 수 있게 하였다. 시간 경과 현미경 검사법과 함께, 조직 발달의 세부 사항 및 역학을 쉽게 연구 할 수 있습니다.
화상 진찰 zebrafish 발달을 가진 어려움은 배아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다; 태아는 수명1의첫번째 3 일 안에 그것의 길이를 4 시간 연장합니다. 또한, 초기 배아의 몸은 부드럽고 성장이 제한되면 쉽게 왜곡됩니다. 그러나 공초점 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 공초점 시간 경과 화상 진찰을 위한 고정된 위치에 배아를 지키기 위하여는, 그(것)들은 정규로 마취되고 0.3-1% 저용융 아가로즈에 거치됩니다. 이것은 태아의 운동을 제한하는 동안 특정 기간 동안 화상 진찰 도중 약간의 성장을 허용하는 이점이 있습니다. 배아의 부분은 이같이 능면화될 수 있습니다. 그러나, 장기간 동안 전체 배아의 화상 진찰을 위해 이 방법을 사용할 때, agarose에 기인한 제한된 성장 때문에 왜곡이 관찰됩니다. 따라서 다른 장착 방법이 필요합니다. Kaufmann 및 동료는 가로오스 또는 메틸셀룰로오스 2의 낮은 농도를 포함하는 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브에 배아를 장착함으로써 선택적 평면 조명 현미경 검사법 (SPIM)과 같은 가벼운시트 현미경 검사법에 대한 제브라피시 배아의 대체 장착을 설명했다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 배아 발생의 뛰어난 시각화를 생성합니다. Schmid 등은 1개의 화상 진찰 세션에서 몇몇 태아의 가시화를 제공하는 빛 시트 현미경 검사법3를 위한 FEB 관에 있는 아가로제에 있는 최대 6개의 배아의 설치를 기술합니다. 금형은 배아의 큰 숫자의 효율적인 장착을위한 배아 배열을 만드는 데 사용되었습니다4. Masselkink 등은 다양한 단계에서 제브라피시 배아를 배치할 수 있는 실리콘 주조를 만드는 데 사용할 수 있는 3D 프린팅 플라스틱 금형을 구성하여 공초점이미징을포함한 이미징을 위한 일정한 위치에 장착할 수 있습니다 5. 3D 프린팅은 또한 96웰 포맷6에서제브라피시 배아의 일관된 포지셔닝을 위한 금형을 만드는 데 사용되었습니다. 일부 금형은 특정 단계에 맞게 사용자 정의되며 장기간 무제한 성장을 허용하지 않을 수 있지만 다른 금형은 더 유연합니다. 최근, Weijts 등은 제브라피시 배아의 라이브 이미징을 위한 4웰 접시의 설계 및제작을7. 이 요리에서는 마취 된 물고기 배아의 꼬리와 줄기가 커버 유리 바로 위에 부착 된 투명한 실리콘 지붕 아래에 수동으로 배치되어 주머니를 형성합니다. 배아는 0.4% 아가로스를 첨가하여 이 위치에 고정된다. 이 장착은 배아의 약 2 mm 긴 후방 부분 (트렁크 및 꼬리)의 이미징을 허용하고, 최대 12 개의 배아가 잘 당 장착 될 수 있으므로, 방법은 여러 샘플의 이미징을 허용합니다. 마찬가지로, Hirsinger와 Steventon은 최근 꼬리가 자유롭게 자랄 수 있는 동안 물고기의 머리가 아가로오스에 장착되는 방법을 제시했으며,이 방법은 또한 배아8의트렁크 및 꼬리 부위의 이미징을 효율적으로 용이하게합니다.
이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 움직임을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 이 장착 방법의 장점은 모든 반전 된 현미경을 사용하여 이미징을위한 다양한 단계의 배아를 장착하는 저비용, 빠르고 쉬운 방법입니다. 장착은 배아 발달 도중 전신 (머리, 트렁크 및 꼬리)의 장기 적인 화상 진찰을 허용합니다. 이 방법의 유용성을 보여주기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 형질전환 어류에서 이미지화되었다. 세션당 2개의 배아, 3D의 2개의 파장에서 55시간 연속시간 경과 현미경검사법에 의해 이미지화되어 조직 발달의 영상을 렌더링하였습니다.

<table><tbody><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>A9414</td><td>4°C에 용존 용액 저장; </td></tr><tr><td>C No. 0 커버 슬립 및 유리 바닥 직경 10mm가있는 35mm 유리 바닥 접시</td><td>MatTek Corporation, MA</td><td>P35GCOL-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td> <td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>E10521</td><td>4 &deg에 용해 용액 저장; C</td></tr><tr><td>N-phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P7629</td><td>-20°C에 용해된 해결책을 저장하십시오; C</td></tr><tr><td>마이크로 커버 유리 22x22mm</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 형광 현미경</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LAS X 소프트웨어</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>현미경 소프트웨어</td></tr><tr><td>DMC4500 디지털 현미경 카메라</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1S 컨포칼 현미경</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Nikon NIS AR 버전 4.40</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>NA</td><td>현미경 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

발달의 역학은 특정 조직 또는 세포에 형광을 발현하는 살아있는 형질전환 제브라피시 배아의 공초점 시간 경과 현미경 검사법에 의해 뒤따를 수 있습니다. 화상 진찰 전체 배아 발달을 가진 어려움은 zebrafish 태아가 길이에서 실질적으로 증가한다는 것입니다. 0.3-1% 낮은 용융 아가로스에서 정기적으로 장착할 때, 아가로세는 성장 제한을 가하여 부드러운 배아 체체의 왜곡을 초래합니다. 그러나 공초점 시간 경과 현미경 검사를 수행하려면 배아를 고정시켜야합니다. 이 기사에서는 무제한 성장을 허용하면서 배아의 운동성을 제한하는 제브라피시 배아의 층상 장착 방법을 설명합니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 전체 배아 혈관, 신경 및 근육 발달은 55시간 연속으로 형질전환 어류에서 영상화되었다. 이 장착 방법은 금형이나 특수 장비의 요구 사항없이 반전 된 현미경을 사용하여 전체 얼룩말 배아의 쉽고 저렴한 이미징에 사용할 수 있습니다.

마운팅 방법의 개발 이 작업의 주요 목적은 장기간 제브라피시 개발의 시간 경과 이미징을 위한 저비용 장착 기술을 개발하는 것이었습니다. 층상 장착 방법은 깨지기 쉬운 얼룩말 배아 몸체의 완전한 성장을 허용하면서 움직임을 제한하기 위해 개발되었습니다. 층 1의 아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡되고 구부러지게됩니다(그림 2). 0.1%와 0.5%로 자란 배아는 꼬리, 왜곡된 지느러미 및 구부러진 머리를 줄였습니다. 반대로, 아가로오스 농도가 너무 낮으면, 성장하는 꼬리가 배아 몸에서 밖으로 스윙하고 움직이게 하기 때문에, 그(것)들이 마취되더라도, 시간 경과 현미경 검사법 도중 시야에서 밖으로 이동합니다. 우리의 손에, 최적의 아가로즈 농도 사이 변화 0.028% 그리고 0.034% 아가로즈의 다른 배치 사이 아가로즈. 0.025% 이하의 아가로즈를 장착하는 것은 배아가 시야에 머무를 수 있는 충분한 저항성을 제공하지 못했다.
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이 문서에서는 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위해 깨지기 쉬운 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대해 설명합니다. 이 저가형 방법은 모든 반전된 현미경에 이미징을 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 다른 농도에서 아가로즈의 층에서 수행됩니다.

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

우리는 깨지기 쉬운 제브라피시 배아의 무제한 성장을 허용하는 동시에 완전히 고정 된 위치에 그들을 유지하는 시간 경과 이미징을위한 장착 방법을 개발했습니다. 이 마운팅 방법은 빠르고 쉽고 저렴하며 반전 된 현미경의 실험실 이미징에 적합합니다. 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 화상 진찰을 위한 이 방법을 개발했습니다, 그러나 그밖 작은 수생 동물 모형의 화상 진찰을 위해 수정될 수 있었습니다.성인 얼룩말 물고기를 사육하여 시작합니다. 오후에는 물고기를 사육 탱크에 넣고 1대 2의 남성 대 여성 비율로 사육합니다. 그런 다음 배아 매체에 1% 낮은 용융 아가로즈의 스톡 용액을 준비하고 전자 레인지에 가열하여 용해하십시오.아가로즈 용액을 1.5 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 증류수에 4%트리카인의 스톡 솔루션을 만들고 아가로즈와 트리카인을 섭씨 4도에 보관하십시오. 트리카인은 독성이 있으며 연기 후드에 무게를 두고 준비해야합니다.짝짓기 후, 페트리 접시에 E3에서 제브라피쉬 배아를 수확하고 장착하기 전에 약 28 시간 동안 섭씨 26.5도에서 배양하십시오. 0.02%의 트리카인으로 배아를 마취시키고, 조리온을 부드럽게 잡아당겨 배아를 방출함으로써 현미경으로 배아를 비코로 비우게 한다. 장착 직전에 아가로즈 용액을 섭씨 65도로 가열한 다음 약 30°C까지 식히면 배아가 열에 의해 손상되지 않도록 하고 아가로즈 용액에 트리카인을 추가하십시오.숫자 제로 커버 글래스 바닥35 밀리미터 유리 바닥 접시를 사용합니다. 유리 파이펫이나 마이크로피펫으로 접시 의 바닥쪽으로 측면 중 하나를 가진 비반향 배아를 부드럽게 놓고 마이크로 피펫으로 남은 E3를 조심스럽게 제거합니다. 아가로즈가 작은 우물을 커버하지만 오버플로하지 않도록 배아를 커버하기 위해 접시의 바닥에 부착 된 커버 글래스에 의해 생성 된 작은 우물에 첫 번째 아가로즈 용액을 추가합니다.커버글래스로 작은 우물을 덮어 두 개의 커버글래스 사이에 배아가 있는 좁은 아가로즈로 채워진 공간을 만듭니다. 커버글래스 의 상단에 1%아가로즈 용액층을 배치하여 커버글래스를 제자리에 고정시합니다. 그런 다음 0.02%의 트리카인을 함유한 E3로 접시의 나머지 부분을 채우고 시스템을 촉촉하게 유지합니다.1층에 대한 최적의 아가로즈 농도를 식별하기 위해 아가로즈 농도증가에 배아를 장착하고 시간 경과 이미징을 수행하여 배아 왜곡과 운동성을 최소화하는 농도를 확인한 다음 결과에 따라 더 미세한 농도 범위를 테스트합니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 레이어 1에 대한 아가로즈의 최적 농도를 식별하는 것입니다. 0.030%0.032% 등 다양한 나노 농도를 테스트한다.최적의 농도를 찾을 수 있습니다. 배아의 시간 경과 이미징을 수행하려면 최대 55시간 동안 섭씨 28.5도로 설정된 인큐베이터와 이미지를 사용하여 현미경 단계를 사용하십시오. 여러 배아를 동시에 이미지화하려면 여러 개의 접시를 담고 있는 스테이지 어댑터를 사용하여 배아가 수평으로 배치되도록 접시를 하나씩 회전시합니다.낮은 배율 목표를 선택한 다음 접안렌즈를 사용하여 배아를 찾아 마지막으로 접시를 회전하여 수평으로 정렬합니다. 소프트웨어에서 배아의 위치를 기록하고 데이터를 자동 저장하기 위한 파일 이름을 만듭니다. 핀홀 크기를 설정하고 속도, 이미지 크기 및 확대/축소를 검사합니다.그런 다음 이미지 캡처및 이미지형 채널을 캡처하기 위해 더 높은 배율을 선택합니다. 각 채널에 대해 레이저 전력과 검출기 고전압을 조정하여 포화를 피하고 사진 표백을 제한하면서 최상의 동적 범위를 수집합니다. 다음으로, 전체 배아를 10X 목표로 이미지화하기 위해 소프트웨어의 큰 이미지 캡처 설정을 설정하여 여러 시야 필드를 이미지화하고 배아의 위치를 조정하여 이 큰 이미지 영역에 맞는지 확인합니다.원고 방향에 따라 Z 스택을 캡처하기 위한 설정을 구성합니다. 장기 경과 이미징 동안 여러 배아의 초점을 유지하기 위해 자동화 된 초점을 사용하고 참조 평면에 초점을 각 배아에 대한 개별 오프셋 수준을 조정하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어의 시간 경과 매개 변수를 1시간 간격으로 55시간 동안 이미지화하도록 설정합니다.각 주기마다 두 개의 배아 데이터 집합을 순차적으로 캡처하고 데이터를 자동으로 저장합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 하나 이상의 배아가 이미지된 경우 이미징의 위치를 기반으로 데이터 집합을 분할하여 각 배아에 대해 독립적인 파일을 만듭니다.최대 강도 투영 또는 유사한 도구를 사용하여 3D 시간 데이터 집합을 2D 시간 데이터 집합으로 변환합니다. 마지막으로 AVI로 저장하고 초당 5프레임의 재생 속도를 위해 200밀리초 간격으로 압축 옵션을 선택하여 동영상 파일을 만듭니다. 이 계층장착 방법을 사용하면 제브라피시 배아를 이미지화하는 동시에 성장을 허용하지만 움직임을 제한하는 동일한 방식으로 이미지를 만들 수 있습니다.아가로즈 농도가 너무 높으면 배아가 왜곡됩니다. 그러나 너무 낮으면 시간 경과 현미경 검사중에 시야밖으로 이동합니다. 최적 아가로즈 농도는 혈관의 내피 세포에서 전체 배아및 GFP에서 RFP를 발현하는 0.028과 0.034%의 살아있는 형질제 제브라피쉬 사이인 것으로 나타났으며, 그 동안 55시간 동안 혈관간 혈관이 발아되고, 수피장 및 머리 혈관질이 개발되고, 골짜기 와 골병 이 형성되었다.GFP와 운동 뉴런을 발현하는 배아는 운동 신경 발달을 시각화하기 위해 이미지화되었습니다. 운동 신경 축축은 배아의 복부 측을 향해 소니트 를 통해 복부 신경관에서 새싹. 세그먼트 간 혈관의 위치와 관련하여 모터 뉴런 축종의 등삼 발아의 공동 개발은 더 높은 배율을 사용하여 이미지화되었다.이를 통해 신경관에서 발아되는 등쪽 축축뿐만 아니라 복부 축축발의 미세한 디테일을 시각화할 수 있게 되었습니다. 소미트 숫자가 증가함에 따라 솜릿도 길이와 너비로 확장됩니다. 이 과정은 근육에서 GFP를 표현하는 형질 전환 배아를 사용하여 이미지화되었다.아가로즈의 최적 농도는 매우 좁기 때문에 아가로즈의 재고 용액을 준비할 때 측정의 작은 변화에 매우 민감하며 아가로즈 솔루션의 각 새로운 배치에 대해 재정의되어야 합니다. 이미지 크기와 해상도, 스캔 속도, 줌, 검출기 고전압 및 레이저 전력을 포함한 이미징 매개 변수를 신중하게 설정하여 실험 간의 일관성을 보장하고 장기간 경과 하는 동안 사진 독성 및 사진 표백 가능성을 줄이는 것이 중요합니다. 전 유기체의 연장된 시간 경과 화상 진찰에 선행된 형질 전환 제브라피시 배아를 위한 이 마운팅 방법을 사용하여, 우리는 다른 조직이 어떻게 함께 발전하는지 구상할 수 있습니다.

a-layered-mounting-method-for-extended-time-lapse-confocal-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

이 기사에서는 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비용 효율적이며 도립 현미경에서 이미징하기 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 서로 다른 농도의 아가로스 층에서 수행됩니다.

Layered Agar Mounting: 도립 현미경을 사용한 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

이 비디오는 저융점 아가로스를 사용하여 6웰 플레이트에 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법에 대한 단계별 지침을 설명합니다. 또한 살아있는 배아의 이미지를 획득하고 소프트웨어를 사용하여 분석하는 프로세스를 제공합니다.

한천 장착(Agar Mounting): 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 기본 방법

이러한 확산, 패턴, 차별화, 그리고 축삭지도 등의 발달 과정은 쉽게 제브라 피쉬의 척수에서 모델링 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 이러한 이벤트의 시각화를 최적화하는 제브라 피쉬 배아에 대한 설치 절차를 설명합니다.

해부 및 제브라 피쉬 배아의 측면 장착 : 척수 개발의 분석

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

유사분열은 모든 살아있는 유기체에 매우 중요하며 결함은 종종 암과 발달 장애로 이어집니다. 이 이미징 프로토콜과 제브라피시를 모델 시스템으로 사용하여 연구원들은 살아있는 척추 동물 유기체의 유사 분열과 유사 분열 과정에 결함이 있을 때 발생하는 수많은 결함을 시각화할 수 있습니다.

라이브 Zebrafish의 배아에서 유사 분열 부문 및 역학을 관찰

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

Zebrafish의 개발의 장기 이미징을위한 다목적 장착 방법

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

배우세요 레이어형 장착법을 통해 Danio rerio 배아의 장시간 공초점 현미경 촬영을 수행하는 방법을. 이 기술은 취약한 수생 모델의 성장을 허용하면서도 위치를 고정하여 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

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