Name: 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 배우세요 캡슐화된 사구체에서 정수리 상피 세포 배양 및 활성화 분석 방법을. 이 기술은 쥐 신장에서 분리된 1차 세포를 사용하여 신장 섬유화 질환의 세포 메커니즘을 연구하고 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 네덜란드 신장 재단에 의해 지원 되었다 (보조금 14A3D104) 과학적 연구를 위한 네덜란드 조직 (NWO VIDI 교부금: 016.156.363).

모든 동물 실험은 라드부드 대학 니메겐의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었다.
참고: 치료되지 않은 건강한 야생형(WT) 마우스(n=4) 및 cd44/----(n=4) 마우스는 12-16주의 나이에 희생하였다. 남성과 여성 마우스 모두 사용 되었다. 모든 마우스는 C57Bl/6 배경에 있었다.
1. 마우스 신장 해부
<ol><li>자궁 경부 탈구에 의해 건강한 WT 마우스 또는 유전적으로 변경된 마우스를 희생하십시오.</li>
	<li>마우스를 희생한 직후 전체 마우스 신장을 해부합니다. 이를 위해 복부 가위를 사용하여 중앙 복강경 절제술을 수행하여 피부를 절단한 다음 복부 근육을 절단하십시오. 내장을 제거하고 마우스 옆에 놓습니다.</li>
	<li>조직을 연결에서 신장을 자유롭게하고 외과 적 집게를 사용하여 신장을 당겨, 가위로 신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단.</li>
	<li>외과 용 집게로 신장을 잡고 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 캡슐을 벗어 신장에서 신장 캡슐을 제거하십시오.</li>
	<li>신장을 6웰 세포 배양 플레이트(신장 2개/웰)에 넣고 잘 정한 2mL의 행크스 균형 잡힌 염액(HBSS)으로 준비하여 얼음 위에 놓습니다.</li>
</ol>2. 마우스 신장에서 구두를 분리
<ol><li>신장을 100mm 페트리 접시로 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 신장을 1-2mm의 작은 조각으로 다진다. 다진 신장 조각을 HBSS 의 1-2 mL를 사용하여 젖은 상태로 유지하십시오.</li>
	<li>다진 신장 조각을 300 μm 금속 체 위에 놓고 20mL 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. HBSS로 체를 반복적으로 헹노려 서학적 파이프를 사용하여 깨끗한 페트리 접시에서 흐름을 수집합니다. 또한 메스로 긁어 내어 체의 바닥에 남아 /스틱 모든 것을 수집하고 수집 된 흐름을 통해 (신장 동종)으로 전송합니다.</li>
	<li>HBSS를 가진 75 μm 체를 통해 신장 균모를 헹구는. 흐름을 수집하고 53 μm 체를 통해이 흐름을 헹신다. HBSS를 사용하여 두 체를 모두 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다. 참고: 이 단계에서흐름은 헹지만 75 μm 및 53 μm 체를 통해 압착되지 않습니다. 체에 파편과 작은 구조를 제거하기 위해 HBSS로 세척이 필요합니다. 따라서 일반적으로 HBSS의 200-300 mL은 총으로 사용된다.</li>
	<li>75 μm 및 53 μm 체에 남아 있는 신장 구조/물질을 덜벡코의 변형된 이글 배지(DMEM)로 체의 상부 표면을 세척하여 20%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충하고 물질을 6웰 초저 부착 마이크로플레이트로 옮기는다. 참고: 체의 상부 표면을 세척하려면 체를 기울어진 위치(>45°)로 헹구고 체 가장자리에서 신장 물질을 수집합니다. 수집된 재료는 캡슐화뿐만 아니라 캡슐화된 구체로 메물리로 보강되어 몇 개의 관 부조각만 표시됩니다. 캡슐화된 구성술은 매우 끈적끈적합니다. 따라서 단일 구엽을 수집하려면, 따라서 페트리 접시 또는 웰 플레이트의 표면에 부착 하는 구체를 방지 하는 것이 중요 하다. 준수를 방지하려면 20% FCS가 있는 배지를 사용하고 이 단계에 초저 부착 플레이트를 사용하십시오.</li>
</ol>3. 사구형 의 배양
<ol><li>초저 부착 마이크로플레이트를 반전된 광 현미경으로 가져와 캡슐화된 단일 캡슐화 및/또는 20μL 파이펫으로 캡슐화된 구광을 수집합니다. 다른 구조물과 파편을 피하십시오. 파이펫 팁에서 단일 구두를 수집한 후 동일한 파이펫 팁에 수집된 신장 물질 없이 신선한 DMEM 배지를 20μL의 부피에 추가합니다.</li>
	<li>20 μL DMEM 배지를 24웰 세포 배양판의 중심으로 단일 소구체를 전송하고 37°C및 5% (v/v)CO2에서 3시간 동안 배양하여 음의 중앙으로 구생물을 부착할 수 있도록 한다. 음구체의 부동을 피하기 위해 조심스럽게 접시를 이동하여 우물의 보더에게.</li>
	<li>3 h 의 배양 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 하이드로코르티존, 인간 내피 성장 인자, 소 뇌 추출물 및 젠타미신 황산 암포테리신 B(재료의 표)및 추가 5 % (v /v) FBS 및 1 % (v /v) 펜틴 을 포함하는 성장 인자 키트로 보충 된 내피 성 기저형 배지 (EBM)의 500 μL을 조심스럽게 추가합니다.</li>
	<li>37°C에서 6일간 단일 글로메룰리, 5% (v/v) CO2를배양한다. 참고: 6일 이내에 정수리 상피 세포로 구성된 아웃성장이 형성됩니다. 하나는 정수리 상피 세포에 특정 화합물 또는 약물의 효과 테스트 하는 것을 목표로 하는 경우 이 6 일 기간 내에서 매체에 추가 해야.</li>
</ol>4. 정수리 상피 세포 증식 분석
<ol><li>6 일 후에 사구배 기재를 분석합니다. 디지털 반전 광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어(예: ImageJ/FIJI)를 사용하여 포사구배의 표면적 및 직경, 그리고 성장하는 세포 또는 성장형 구체의 수를 결정합니다.<ol>
<li>사구선 성장의 표면적을 확인하려면 tif를 엽니다. ImageJ의 스케일 바가 있는 구사적 아웃성장 파일. 스케일 표시줄에 직선을 그리고 분석 및 측정(예: 1mm = 460 픽셀)을 클릭하여 픽셀의 거리를 결정합니다.</li>
		<li>분석,설정 축척 및 픽셀(예: 460)의 알려진 거리를 입력하여 스케일을 결정하고, 알려진 거리(예를 들어, 1) 및 길이 단위(예를 들어, 1mm)를 입력합니다. 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>분석을 클릭한 다음 측정을 설정하여 결과 표에 표시될 결과를 결정합니다. 구체 아웃성장의 표면적을 확인하려면 옵션 영역을 활성화하고 레이블을 표시합니다. 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>사구선 아웃성장의 표면적을 결정하려면, 구체 아웃스링 주위에 프리핸드 선택을 그립니다. 분석을 클릭한 다음 측정하면 결과 테이블이 ImageJ에 표시되어 이전 결정 된 배율에서 아웃 성장의 표면적을 보여 주겠습니다 (예 : 4.4, 예 : mm2참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 사구 세포 의 특성화
참고: 외성장의 세포 조성을 평가하기 위해, 세포 별 마커에 대한 면역 형광 염색은 t = 6 일에서 구체 아웃스키에서 수행됩니다.
<ol><li>배지를 조심스럽게 제거하고 인산염 완충식염(PBS)을 사용하여 두 번 구불구를 부드럽게 씻습니다.</li>
	<li>PBS에서 4%(w/v) 자당으로 보충된 2%(w/v) 파라포름데히드(PFA)를 사용하여 실온에서 10분 동안 고정하고 PBS를 사용하여 2배를 조심스럽게 세척합니다.</li>
	<li>PBS-ovine 세럼 알부민(BSA) 1%(v/v)에서 적절한농도(재료표)를가진 1차 항체를 실내 온도에서 1시간 동안 배양한다.</li>
	<li>항체 용액을 제거하고 PBS로 3배 조심스럽게 세척하십시오.</li>
	<li>이차항체(재료표)를가진 배양은 실온에서 45분 동안 어둠 속에서 PBS-BSA 1% (v/v)로 희석된다.</li>
	<li>신중하게 PBS와 3 배 세척하고 핵을 시각화하고 둥근 커버 슬립으로 잘 커버하는 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 수성 장착 매체의 1-2 방울을 사용하여 마운트.</li>
	<li>형광 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 가져 가라.</li>
</ol>

<ol><li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li>
<li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li>
<li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li>
<li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li>
<li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li>
<li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li>
<li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ERK1%2F2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li>
<li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li>
<li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li>
<li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li>
</ol>

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이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 하나는 정수리 상피 세포 활성화의 결과인 정수리 상피 세포 증식을 평가하기 위하여 단 하나 캡슐화된 구체를 사용할 수 있습니다. 이 전 생체 내 모델은 우리가 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 분자 경로를 자세히 연구 할 수 있게 합니다. 설명된 방법은 신장 해부및 체질의 간단한 개념에 의존하여 탈구를 분리하고 배양하고 상이한 실험 조건 하에서 정수리 상피 세포의 증식 및/또는 이주를 비교한다. 배양6일 후에 분석될 수 있는 결과는, 예를 들면, 표면적 또는 직경또는 단일 캡슐화된 구체의 성장세포의 수입니다. 이 분석에 대 한 또 다른 응용 프로그램 유도 하거나 정 수리 상피 세포 활성화에 관여 될 수 있는 분자 통로 억제 하는 약물의 효과 연구 할 수 있습니다.
면역형광 염색은 6일 후 배양후 성장세포가 정수리성 상피세포(CD44, 클라우딘-1, SSeCKS)에 대해 양성으로 염색되었으나, 포도세포 특이적 마커 시냅토포틴을 발현하지 않았...

구체 질환은 신장 질환의 중요한 그룹이며 말기 신장 질환 (ESRD)의 주요 원인을 나타냅니다. 불행히도, 특정 치료 옵션은 제한적이며 ESRD로의 진행은 불가피합니다. 구체 질환은 사구체 손상의 존재에 의해 정의되며 염증 성 및 비 염증 성 질환으로 그룹화 될 수 있습니다. 초기 모욕은 다르지만, 최근 연구에 따르면 일반적인 세포 메커니즘은 사구성 상피 세포 증식으로 이어지며 궁극적으로 모든 사구형 질환에서 사구체 경화증으로 이어지며 근본 원인11,2,,3,,4에관계없이.
구체적으로, 구체류경화성 병변은 주로 활성화된 정수리 성 상피 세포5,,6로구성된 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서, 정수리 상피 세포는 구체의 Bowman의 캡슐을 줄 이는 평평한 정지 상피 세포입니다. 그러나, 유전적 돌연변이(예를 들어, 포도세포 특이적 또는 미토콘드리아 세포병리학), 염증 또는 과여과(예를 들어, 신장 질량 감소, 고혈압, 비만 또는 당뇨병 성 멜리터스)으로 인한 모든 구체 손상은 정수리 세포의 활성화를 시작할 수 있다. 활성화된 정수리 상피 세포는 세포 초승달 또는 경화 병변의 형성을 초래하는 세포외 매트릭스를 증식하고 증착하고예금5,,7,,8. 이러한 프로세스의 진행은 신장 기능9의손실을 초래한다. 따라서, 정수리 상피 세포 활성화는 염증성 및 비염증성 구엽기 질환1,,2,,3,,4,,10모두에서 사구체 경화증의 발달 및 진행에 중요한 요소입니다.
정수리 상피 세포 활성화를 중재하는 분자 과정은 여전히 크게 알려지지 않았습니다. 최근 연구에 따르면 활성화된 정수리 상피 세포 드 노보 익스프레스 CD44, 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 다른 경로의 활성화에 중요한 수용체. 더욱이, CD44의 억제는 정수리 상피 세포 활성화를 억제하고 염증성 뿐만 아니라 비염증성 구엽기질환(11,,12)의동물 모델에서 초승달 형성 및 구종증의 진행을 감쇠시키는 것으로 나타났다.
정수리 상피 세포 활성화는 사구체 경화증과 초승달 형성의 발달을위한 핵심 플레이어이기 때문에, 이 세포의 억제는 사구형 질병의 진행을 감속할 수 있었습니다. 정수리 상피 세포 활성화를 구동 하는 분자 경로의 용해성 구엽 질환에서 초플라스틱 및 구체 성 병 변의 형성을 감쇠 특정 치료 개입의 개발로 이어질 수 있습니다.
실험적인 동물 모델에서는, 정수리 상피 세포에 변경된 유전자 발현(녹아웃 모델 또는 형질전환 마우스 모형) 또는 약물 치료의 직접적인 효력에 대한 증거를 제공하기가 빈번하게 어렵습니다. 기존의 녹아웃 마우스에서 생체 내에서 관찰된 생체 내 변화는 정수리 상피 세포의 직접적인 변화에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 유전자 발현은 마우스 내의 다른 세포 유형에서도 변경되기 때문에, 다른 세포 유형에 의해 매개되는 간접적인 효력을 배제할 수 없다. 정수리 상피 세포에서 주로 활성 프로모터에 의해 구동 조건부 cre-lox 마우스의 개발은 어떤 경우에는 용액을 제공하고있다 13. 그럼에도 불구하고 조건부 형질 전환 모델은 복잡하고 더 많은 조건부 라인을 사용할 수 있지만, 기존의 녹아웃 또는 형질전환 마우스 라인의 많은 경우 아직 조건부 대체가 없습니다.
정수리 상피 세포에 대한 직접적인 효과를 연구하기 위해 우리 그룹은 정수리 상피 세포 증식 및 이동을 측정하고 분석하기 위해 마우스 신장에서 분리 된 단일 캡슐형 사구를 사용하여 전 생체 분석기를 개발했습니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 특정 효과를 결정하고 정수리 상피 세포 활성화 및 테스트 치료 옵션에 대한 책임있는 경로를 찾을 수 있게 해 주어 이 활성화를 억제할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>내피 세포 마커(사용 농도 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>닭 안티 랫 Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;( 사용 농도 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>DAPI</td><td></td></tr><tr><td>디지털 도립 광 현미경</td><td>Westburg, EVOS fl 현미경</td><td></td><td></td></tr><tr><td>당나귀-안티 염소 Alexa 568</td><td>Thermo Fisher</td>를 포함하는 장착 매체&<td>nbsp;( 중고 농도 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>당나귀-안티-래빗 Alexa 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;( 사용된 농도 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's medium&nbsp;</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM 매체</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM-MV 단일 인용 키트</td><td>Lonza</td><td>하이드로 코르티손, hEGF, GA-1000, FBS 및 BBE</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat-anti-synaptopodin</td><td>Santa Cruz</td><td>Podocyte marker (used concentration: 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'Balanced Salt Solution</td>, <td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>FIJI 1.51n</td><td></td><td></td></tr><tr><td>petri dish</td>, <td>Sarstedt</td><td>size 100</td><td></td></tr>, <tr><td>rabbit-anti-claudin1</td><td>Abcam</td><td>Parietal epithelial cell marker (used concentration: 1:100)</td><td></td></tr><tr><td>Dr</td>. E. Gelman이 친절하게 제공한 <td>Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA</td><td>, Parietal epithelial cell marker</td><td></td></tr><tr><td>rat-anti-CD44</td><td>BD Pharmingen</td><td>Parietal epithelial cell marker (used concentration 1:200)</td><td></td></tr> <tr><td>scalpel</td><td>Dahlhausen</td><td>size 10</td><td></td></tr><tr><td>Sieves&nbsp;</td><td>Endecotts Ltd</td><td>크기 300 &micro; m, 75 &마이크로; m, 53 &마이크로; m, 스틸</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD Plastipak</td><td>크기: 20 ml</td><td></td></tr><tr><td>초저 부착 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>코닝 Costar</td><td>6웰 플레이트</td><td></td></tr></tbody></table>

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

정수리 상피 세포 (PEC) 활성화는 글로메룰로오스 경화증의 개발 및 진행에 관여하는 주요 요인 중 하나입니다. 따라서 정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로의 억제는 구엽 질병의 진행을 감쇠하는 도구가 될 수 있습니다. 이 문서에서는 마우스 신장으로부터 분리된 캡슐화된 사구류의 정수리 상피 세포 내 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 고립 된 마우스 신장을 해부 한 후, 조직은 다진, 그리고 사구는 체질에 의해 격리된다. 캡슐화된 사구는 수집되고, 단일 사구는 정수리 상피 세포의 구체 배설물 성장을 얻기 위해 6 일 동안 배양된다. 이 기간 동안, 정수리 상피 세포 증식 및 이동은 세포 수 또는 성장하는 세포의 표면적을 결정함으로써 분석될 수 있다. 이 분석은 그러므로 형질 전환기 또는 녹아웃 마우스에 있는 변경한 유전자 발현의 효력 또는 정수리 상피 세포 성장 특성 및 신호에 배양 조건의 효력을 연구하기 위하여 공구로 이용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 정수리 상피 세포 활성화 과정에 관여 하고 결과적으로 구체 로메로클로증에서 관련 된 중요 한 경로 연구 될 수 있다.

구체 아웃성장 분석법을 수행하는 방법의 체계적인 다이어그램이 도 1에도시된다. 도 2A-D는 광 현미경을 사용하여 관찰된 바와 같이 다른 시점에서 캡슐화된 사구체의 사구체 의 성장을 나타낸다. 외성장은 마우스 신장으로부터 의자간 후 배양에서 2일, 4일 및 6일째(도2B-D)로나타났다. 확장되는 세포가 정수리 상피 세포임을 확인하기 위해, 탈캡슐화된 구엽수는 도 2E, F에도시된 바와 같이 6일 동안 격리되고 배양되었다. 탈캡슐화된 사구는 6일 이내에 잠복기 동안 세포 밖으로 성장을 보이지 않았다. 도 3에서,면역형광...

이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

정수리 상피 세포의 활성화는 신장의 구체에 있는 흉터 조직의 발달에 있는 중요한 요인에 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 이 활성화에 관련되었던 세포 프로세스를 공부하고 잘하면 질병 진행을 늦추거나 조차 중단하는 처리 선택권을 찾아볼 수 있습니다. 우리의 기술의 주요 장점은 우리가 고립 된 사구에서 바로 성장하는 1 차 세포를 사용하는 것입니다.신장을 해방 한 후, 텍스트 원고에 설명 된 바와 같이, 수술 집게와 신장을 잡고 신장 캡슐을 당겨 집게의 또 다른 쌍을 사용합니다. 그 후, 각각 HBSS의 두 밀리리터를 포함하는 여섯 개의 잘 문화 판의 우물에 신장을 배치하고 얼음에 문화 판을 배치합니다. 첫째, 신장을 100mm 페트리 접시로 옮기고 두 개의 메스를 사용하여 약 1~ 2밀리미터의 작은 조각으로 다진다.다진 신장 조각을 HBSS로 젖게 하십시오. 다음으로, 신장 조각을 300 마이크로미터 금속 체 위에 놓고 20 밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 체를 통해 신장을 누릅니다. 반복적으로 사이에 HBSS로 체를 헹이고 흐름을 수집하고 깨끗한 페트리 접시로 전송하는 세로지학적 파이펫을 사용합니다.메스를 사용하여 체 바닥에 남아있는 모든 것을 긁어 수집 된 신장 균질로 옮긴다. HBSS로 75 및 53 마이크로미터 체로 신장 균모를 헹구는 다. 그런 다음 두 체를 HBSS로 세척하여 모든 작은 구조를 제거합니다.20%의 태아 종아리 혈청을 보충한 DMEM으로 각각의 상부 표면을 세척하여 체에 남아 있는 신장 구조와 물질을 수집하고 6개의 매우 낮은 부착 마이크로플레이트의 우물로 재료를 옮기시다. 초저 부착 마이크로플레이트를 거꾸로 된 빛 현미경으로 가져와서 캡슐화되거나 캡슐화된 글로메룰리를 수집한 20 마이크로리터 파이펫을 사용하십시오. 파이펫 팁에 단일 구체를 잡은 후, 20 마이크로 리터의 부피에 동일한 파이펫 팁에 수집 된 신장 물질없이 신선한 DMEM 배지를 추가합니다.DMEM 배지를 가진 단일 구엽물을 24개의 잘 된 세포 배양 판의 중심으로 옮기고 3시간 동안 5%의 이산화탄소로 37도에서 배양하여 음의 중심에 구생물을 부착할 수 있도록 한다. 인큐베이션 후, 사구체는 우물의 중앙에 부착됩니다. 신중하게 추가 500 내피 성 기초 매체의 마이크로 리터 성장 인자 키트와 추가 5% FBS와 1% 페니실린과 연쇄 절제술각 각 우물에 보충.6일 동안 이산화탄소5%를 기록하며 섭씨 37도에서 단일

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

눈물샘 (LG)는 비전과 눈 건강을 유지하기 위해 필요한 눈물의 수성 부품을 생산하는 분기 기관이다. 여기에서 우리는 LG 개발에 참여 경로 신호 해독 쥐 LG 절제술 및 체외 배양 기술에 대해 설명합니다.

쥐의 눈물샘을 조작

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

이 프로토콜의 주요 초점은 가능한 기본 glomeruli 문화 다양 한 다운스트림 응용 프로그램에에서 사용 하기 위해 최소한의 오염 물질을 효율적으로 분리 하는 것입니다. 격리 된 glomeruli 구성 요소 셀 형식 간의 구조적 관계를 유지 하 고 교양 비보 전 짧은 시간 동안 수 있습니다.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 &gt; 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.

피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

배우세요 캡슐화된 사구체에서 정수리 상피 세포 배양 및 활성화 분석 방법을. 이 기술은 쥐 신장에서 분리된 1차 세포를 사용하여 신장 섬유화 질환의 세포 메커니즘을 연구하고 약물 테스트에 활용할 수 있습니다.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

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