Name: 환경과 비만 상호 작용의 모델로 비닐 염화물 과 고지방 다이어트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 학습하세요 비닐 염화물 흡입 노출과 고지방 다이어트를 사용한 생쥐 간 손상 모델링 방법. 이 기법은 인간 노출 조건을 모방하면서 동물 스트레스를 최소화하는 만성적이고 비침습적인 프로토콜을 활용합니다.

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이 연구는 줄리안 비어에 (K01 DK096042 및 R03 DK107912) 건강의 국립 연구소에서 상에 의해 투자되었다. 연구는 또한 기관 개발 상에 의해 지원 되었다 (IDeA) 보조금 번호 P20GM113226 및 알코올 남용 및 알코올 중독에 국가 학회에서 건강의 국립 연구소의 국립 연구소에서 수상 번호 P50AA024337에서 건강의 국립 연구소. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

모든 동물/VC 실험은 환경 보건부의 승인을 받았으며, 실험실 동물 관리 및 절차에 대한 안전 협회는 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 정제, 실험 식단에 대한 실험적 설정 및 적응
<ol><li>C56Bl/6J 마우스의 총 수를 결정합니다(그룹당 최소 6-8마우스). 참고: 각 식이 그룹의 동물은 노출 그룹으로 더 세분화됩니다. 연구를 계획할 때 필요한 동물의 총 수를 고려해야 합니다.</li>
	<li>동물을 식별하고 계량합니다. 이러한 데이터를 기록합니다.</li>
	<li>일반 차우에서 정제된 저지방(LFD) 또는 고지방 식단(HFD)으로 식단을 전환하여 생쥐를 새로운 식단에 적응시키기 위한 흡입 실험을 시작하기 1주일 전에(타임라인의 그림 1 참조).</li>
	<li>음식과 물 광고 libitum을 제공합니다. 케이지당 주어질 식품의 계량 및 기록, 그리고 각 수유일에 나머지 식품을 계량하고 기록하여 식품 소비를 모니터링합니다. 케이지 당 4 개의 마우스를 수용하는 경우 일주일에 두 번 ~ 50g의 음식을 제공합니다. 케이지 당 5 마우스를 수용하는 경우 일주일에 두 번 ~ 60g의 음식을 제공합니다. 참고 : 정제 된 식단을 공급하는 동안 쥐가 충분한 펠릿을 가지고 있는지 확인하기 위해 매일 음식의 양을 확인해야합니다. 부족한 펠릿이 있는 경우에 마우스는 음식을 '비장'하고 입구를 증가하는 경향이 있습니다. 더욱이, 특히 HFD는 LFD보다 훨씬 더 무너져 유사한 효과를 일으키는 경향이 있다.</li>
	<li>실험 전반에 걸쳐 동물을 모니터링하여 동물의 건강이 유지되도록 합니다. 참고: 주간 체중 증가 및 식품 소비, 신진 대사 모니터링 함께 전반적인 동물 건강의 인덱스를 제공 하기 위해 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 염화물 흡입 노출 시스템
참고: '코 전용'에서 '전신' 노출 및 수동, 자동화 시스템에 이르기까지 상업적으로 사용할 수 있는 여러 흡입 노출 시스템이 있습니다. 이 그룹에 의해 이전에 게시된 데이터는 전신 매뉴얼 시스템12,23,24에서파생되었다. 자동화된 흡입 노출 시스템을 설명하는 다이어그램은 그림 2에나와 있습니다.
<ol><li>실험 챔버와 제어 챔버 모두에서 희석된 공기가 고효율 미립자 공기(HEPA)이고 활성탄 여과, 건조 및 압력 조절이 되어 각각의 유량 측정 장치(질량 유량 제어기[MFC]를 입력해야 합니다. ] - 실험 챔버, 회전계 - 제어 챔버). 참고: 제어실에서 회전계는 마우스로의 공기 흐름을 조절합니다. 공기는 챔버의 상단으로 들어가 마우스에 의해 통과한 다음 마우스 아래에 소진되어 화학 후드에 들어가기 전에 HEPA 필터를 통과합니다. 온도 및 상대 습도(RH)는 챔버 내에서 측정됩니다. 실험 챔버에서 희석제 공기는 VC 탱크의 공기와 혼합됩니다. 두 흐름 모두 MFC로 조절됩니다. 두 혼합물의 비율은 실험 챔버에서 VC의 농도를 결정한다. VC는 서로 다른 방향을 가리키는 7개의 제트가 있는 분산기를 통해 노출 챔버의 상단으로 들어갑니다. VC는 마우스를 통과한 다음 케이지 랙 아래에 배치된 12개의 개별 포트를 통해 소진됩니다. 이러한 챔버 설계는 이전에25일균질 독성 농도를 제공하는 것으로 나타났다.</li>
	<li>압력, 온도 및 RH가 실험 실 과 제어 챔버 내에서 모니터링되도록 하십시오.</li>
	<li>챔버 배기 가스가 화학 후드의 배기 영역에 들어가기 전에 HEPA 필터,CO2 프로브 및 활성탄 필터를 통과하고 마우스가 허용 가능한 환기를 받고 있는지 확인하기 위해CO2 수준이 모니터링되는지 확인합니다.</li>
	<li>사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 흡입 노출 중에 환경 변수를 변경, 모니터링 및 기록할 수 있습니다. 참고: 수동 시스템을 사용하는 경우 2.1-2.4 단계에 설명된 변수를 모니터링하고 보정해야 합니다.</li>
</ol>3. 사전 노출 설정
<ol><li>기술자안전을 위해 실험 및 제어실의 모든 기류를 차단합니다.</li>
	<li>각 챔버에 대해 챔버 도어를 열고 배설물 팬 위에 흡수성 침구 재료 (흡수측 위)를 놓습니다. 흡수성 물질을 적시면 노출 기간 내내 쾌적한 습도 수준(40−60% RH)을 제공합니다.</li>
	<li>챔버에서 VC의 원하는 노출 레벨을 설정합니다. 하위 OSHA 제한 농도의 경우 VC의 0.85 ppm을 사용합니다. VC가 챔버로 전달되는 소프트웨어 관리 검출기 기반 피드백 제어를 사용하거나 시스템에 대한 수동 조정을 사용합니다. 참고 : 후자의 접근 방식은 재고 공급에서 VC 가스의 챔버 볼륨, 챔버 새로 고침 빈도, 공기 흐름 및 전달 속도에 대한 지식이 필요합니다. 이러한 계산은 이후에 정상 상태12,24에서챔버내VC 농도의 측정에 의해 검증및 교정되어야 합니다. 챔버에서 VC를 측정하는 가장 일반적인 기술은 샘플 공기(12,24)의가스 크로마토그래피 분석을 통해이다. VC 납품의 정확성과 정밀도에 관한 소프트웨어 기반 접근 방식의 장점은 분명합니다. 그러나, 수동 접근법도 정확하고 일관된 것으로나타났다(12,24). 주의: VC는 높은 수준의 알려진 독성 물질 및 발암 물질입니다. 챔버를 켜고 끄는 동안 적절한 개인 보호 장비와 가스 취급을 하십시오.</li>
</ol>4. 노출 케이지 및 동물 준비
<ol><li>그들의 하우징 챔버에서 마우스를 제거하고 흡입 챔버 케이지 랙의 개별 케이지에 배치 (제어 마우스에 대한 하나의 케이지 랙, 노출 된 마우스에 대한 하나). 각 마우스가 노출 챔버 내에서 균일하게 노출되도록 매일 케이지 랙 내에서 각 마우스의 배치를 무작위화합니다. 각 동물의 수와 케이지 배치 위치를 실험실 노트북에 표시합니다.</li>
	<li>각 케이지 랙을 각 챔버에 넣고 챔버 도어를 닫습니다.</li>
</ol>5. 노출 수행
<ol><li>VC 가스 탱크의 밸브가 열린 위치에 있는지 확인합니다. 실험 챔버의 희석유량이 25L/min으로 설정되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>실험 챔버에서 희석제 흐름을 시작합니다. 제어실의 회전계가 25L/min으로 설정되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>모든 센서(흐름, 온도, 습도, 챔버 압력, CO2 레벨)가 올바르게 작동하고 실험 챔버와 제어 챔버 모두에서 예상 결과를 표시하고 있는지 확인합니다. 참고: VC 흐름은 희석유와 원하는 VC 농도를 기준으로 계산되고 설정됩니다.</li>
	<li>노출 전반에 걸쳐, 실험 챔버에서, 노출 시간, 희석유동, VC 흐름, 온도, 습도, 챔버 압력,CO2 레벨 및 이론적 VC 농도가 표시, 그래프화 및 기록되도록 한다. 제어실의 온도와 습도도 표시, 그래프 로 표시되고 기록되어 있는지 확인합니다. 참고: 수동 시스템을 사용하는 경우 노출 기간 내내 필요한 경우 VC 흐름을 확인하고 조정해야 합니다.</li>
	<li>노출 중에 문제가 발생하면 VC 흐름을 0으로 설정하고 희석유를 최대값으로 증가하여 챔버를 신속하게 제거합니다.</li>
	<li>노출 시간(예: 6시간/일)에 도달하면 소프트웨어가 자동으로 VC 흐름을 끕니다. 15 분 안전 타이머는 VC를 취소실험 챔버에 대한 기간 후 시간 동안 시작됩니다. 동물을 제거하는 것이 안전해지면 대화 상자에서 확인 버튼을 클릭합니다. 시스템에서 파일에 대한 측정 기록을 중지하고 노출이 끝났습니다. 참고: 수동 시스템을 사용하는 경우 노출 지속 시간 및 노출 종료 시 VC 정리 시간이 끝날 때 VC 흐름을 수동으로 해제해야 합니다.</li>
</ol>6. 노출 후
<ol><li>VC 가스 탱크의 밸브에서 스톱콕을 닫힌 위치로 돌리고 노출 챔버의 모든 공기 흐름을 끕니다. 제어실을 통해 흐르는 공기 흐름이 없을 때까지 회전계를 돌립니다.</li>
	<li>각 챔버에서 도어를 제거하여 마우스에 환기를 제공합니다. 챔버에서 케이지 랙을 분리합니다. 후드 아래에서, 그들의 노출 케이지에서 마우스를 제거하고 그들의 주택 케이지에 다시 배치합니다. 모든 마우스를 일반 케이지에서 하룻밤 하우징을 위해 하우징 룸으로 다시 운반합니다.</li>
	<li>배설물 팬의 폐기물은 기관 환경 보건 서비스에 의해 화학적 위험으로 간주될 수 있기 때문에 환경 보건 및 안전부(DEHS)가 승인한 생물학적 위험 컨테이너에 폐기합니다. 실험 및 제어 시스템을 위해 챔버 도어, 배설물 팬, 노광 케이지 랙 및 노광 챔버를 청소하십시오.</li>
</ol>7. 노출 시 챔버 내 VC 농도 검증
<ol><li>각 노출(3시간)을 통해 실험 챔버 내의 VC 농도의 측정을 중간에 수행한다.</li>
	<li>VC 검출기 튜브와 pretreat 튜브에 유리 팁을 깰. VC 검출기 튜브의 흐름 아웃 끝을 검출기 튜브 펌프에 부착합니다. 짧은 튜브조각으로 VC 검출기 튜브의 흐름 끝을 pretreat 튜브의 흐름 아웃 끝에 부착합니다. pretreat 튜브의 흐름 끝에 튜브의 짧은 조각을 부착합니다.</li>
	<li>마우스의 호흡 영역 근처에 있는 샘플링 포트 중 하나에서 플러그를 제거합니다. pretreat 튜브의 흐름 끝에서 샘플링 포트에 튜브를 부착합니다.</li>
	<li>전체 위치에서 검출기 튜브 펌프의 피스톤의 핸들을 전체 아웃 위치로 확장합니다. 이것은 90 s의 기간 동안 VC 검출기 튜브에 챔버에서 샘플링 된 가스의 100 mL를 당길 것입니다. 90년대를 기다린 후 핸들을 다시 밀어 넣습니다.</li>
	<li>총 400 mL이 VC 검출기 튜브로 당겨지되도록 7.4 단계를 세 번 더 반복하십시오.</li>
	<li>챔버의 샘플링 포트에서 튜브를 제거하고 플러그를 포트에 다시 삽입합니다. VC 검출기 튜브의 색상 변화를 검사하여 챔버 내의 VC 농도를 확인합니다.</li>
	<li>실험실 노트북에서 VC 검출기 튜브 판독값을 기록하고 이론적 가치와 비교합니다. VC 검출기 튜브 및 프리트트리트는 적당한 용기에 폐기한다.</li>
</ol>8. 흡입 노출 실험의 종료
참고: 흡입 노출이 시작된 후 6, 8 및/또는 12주 후에 원하는 노출 시간 이후에 실험이 종료되고 동물이 안락사됩니다(타임라인의 그림 1 참조).
<ol><li>마우스를 안락사의 시간 전에 4 시간 빨리. 참고: 이 절차는 신진 대사 분석을 위한 단식 혈당 그리고 인슐린 수준의 결정을 허용합니다.</li>
	<li>마취와 같은 미국 수의학 협회(AVMA) 지침과 일치하는 안락사 접근법을 사용하고 그 다음에 흥분을 해소하십시오.</li>
	<li>케타민/자일라진(100/15 mg/kg)을 각 마우스에 심상 주사하여 마취를 유도합니다. 참고: 염화 비닐 노출이 그 효과를 저해할 수 있으므로, 사과 전 마취마취로 펜토바르비탈 나트륨을 피하십시오.</li>
	<li>혈액 응고를 방지하고 시료 보존을 위해 열등한 정맥에서 혈액을 구연산나트륨 용액 (최종, 0.38 %)으로 수집하십시오.</li>
	<li>간 및/또는 다른 원하는 장기를 제거합니다. 액체 질소에 간 및 스냅 동결 부분을 해부하고 냉동 시편 배지에 포함하고 조직학을 위해 10 % 완충 포르말린을 수정하십시오.</li>
	<li>원심분리를 통해 혈액으로부터 혈장과 분리하고 구이 플라즈마를 적절한 튜브로 옮기고 분석이 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다.</li>
	<li>간 손상의 조직학적 지표를 평가하기 위해 5 μM 포르말린 고정 파라핀 내장 간 섹션으로 염색한 헤마톡실린및 에오신(H&E)을 수행하고 밝은 시야 현미경으로 이미지를 얻습니다.</li>
	<li>플라즈마 트랜스아미나제 수준을 얻으려면 시판되는 키트를 사용하여 구화 플라즈마에서 알라닌 아미노 트랜스트랜스퍼라제(ALT)와 아스파타테 아미노트랜스퍼라제(AST) 운동 분석기를 모두 수행합니다. 참고: 품질 관리를 위해 C57Bl/6J 마우스의 플라즈마 트랜스아미나제는 LFD+VC 그룹의 정상 범위(35−45 IU/L)에 있어야 하며, HFD+VC 그룹에 대한 값은 상승(~150 IU/L)이어야합니다(그림 3C).</li>
</ol>

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WT 골드스미스는 설명된 시스템의 템플릿인 IEStechno에 재정적 관심을 가지고 있습니다. 나머지 저자는 공개 할 것이 없습니다.

VC-강화 된 NAFLD의 이 모델은 전신 흡입 패러다임에서 하위 OSHA 제한 VC 노출의 효과를 평가하는 새로운 방법이다. 이 모델을 통해 연구자들은 VC만으로도 낮은 수준의 간독성 및 과민효과를 연구할 수 있습니다. 실제로, 이 공동 노출 모형은 이농도23에서심장과 같은 그밖 기관 시스템에 크게 영향을 미치지 않는 동안, 향상된 간 상해, 혈장 ALT 및 AST및 온건한 염증의 고도를 달성합니다. 이 만성 모델은 전신 흡입 챔버를 필요로하지만 스트레스와 노출 농도를 최소화합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 소프트웨어 기반 접근 방식이지만, 우리의 경험에 따르면 수동 접근 방식은 또한 노출12,24의정확하고 일관된 방법입니다. 더욱이, 휘발성 유기화합물 노출(22)에 의한 다른 장기손상(23)을 포함한 다중 연구 분야에 용이하게 적용가능하다. 특히,이 모델은 환경 화학 물질과 근본적인 질병에 대한 인간의 공동 노출의 발병 기전과 더 밀접하게 유사 할 수있다5.
유사한 결과를 얻으려면 프로토콜 최적화의 특정 중요한 단계를 달성해야 합니다. 예를 들어, 조사자는 챔버 내의 VC 또는 다른 독성제의 농도가 원하는 노출 범위 내에 있음을 확립해야 한다(즉, 낮은 수준, 하위 OSHA, 또는 급성 수준). 흡입 챔버의 이 단계를 최적화하는 것은 관심있는 인간의 노출의 성공적인 모델에 매우 중요합니다. 둘째, 일일 노출 시간 및 실험 기간을 조정하는 것도 수정될 수 있다. 이 그룹의 관심사에 따라 직업 노출 설정이 달성되었으며 식단의 추가 매개 변수도 연구되었습니다. 그러나, 환경 및 급성 노출은 또한 이 프로토콜로 모델링될 수 있다.
이 작업은 VC(직업 및 환경)의 현재 노출 제한이 안전하다는 패러다임에 도전합니다. 실제로, VC에 대한 현재 OSHA 노출 한계는 1 ppm이지만,이 모델은 이 한계 이하의 VC농도가 마우스에서 HFD로 인한 간 손상을 향상시키기에 충분하다는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 새로운 독성 노출 패러다임을 연구하고 특성화하고 TASH를 모델링할 수 있습니다.
이것은 만성, 저용량 VC 노출의 첫번째 모형입니다. 이전 작품은 VC 노출을 위한 대리로 아주 높은 볼루스 사격량, 심각한 노출 또는 액티브한 대사 산물을 이용했습니다. 이 접근의 전부는 인간 적인 노출에 사실 인정의 관련성을 감소시다. 따라서 TASH-NAFLD 상호 작용의 이 새로운 모델은 조사자가 낮은 수준의 VC 노출의 복잡한 상호 작용을 검사하는 데 필요한 플랫폼을 제공합니다.
독성 유도 간 손상의 이 모형은 그밖 휘발성 유기 화합물을 위해 이용될 수 있고 또한간 및 그밖 기관 시스템에 영향을 미칠 수 있는 그밖 상호 작용을 공부하기 위하여8,22,23. 더욱이, 이 모델은, 더, 이 널리 퍼진 독성물질24에대한 작용 의 작용 의 개입 요법 및 심층적인 기계론적 연구를 조사하는데 사용될 수 있다. VC는 공지된발암물질(26,27,28)으로서,이러한 노출 패러다임은 또한 VC-유도 암의 연구를 위해 변형될 수 있다. 알콜 간 질병 같이 그밖 동환율은 또한 VC 공동 노출에 의해 강화될 수 있습니다. 또한, 고도 불포화 지방18,29,30,또는 탄수화물31의 다른 모형 및 이 모형에 있는 VC와 그들의 공동 노출과 같은 지방의 다른 모형을 공부하는 것이 흥미로볼 것입니다. 실제로, 이러한 요인의 모든 간 손상의 개발에 차등 영향을 미칠 것으로 알려져 있으며 VC 유도 간 질환에 역할을 할 수 있습니다.
결론적으로, 이것은 환경 독성 유발 간 손상의 새로운 흡입 모델이며 만성, 낮은 수준의 VC 노출에 대한 노출 패러다임을 설정합니다. 이 모형에서 사용된 VC의 사격량은 마우스에 있는 다른 요인 (HFD)에 기인한 간 상해를 강화하는 동안 그 자체로 sub-hepatotoxic입니다. 이 모형은 조사자가 만성 VC 독성을 위한 기계장치 그리고 내정간섭을 공부하는 것을 허용할 것이고 노출된 인간 과목을 보고 노출을 위한 고위험에 번역 연구에 도움이 될 수 있습니다.

수많은 독성물질은 우리가 매우 낮은 수준에서 호흡하는 공기에 존재합니다. 염화비닐(VC)은 폴리염화비닐(PVC) 플라스틱 제품1을만들기 위해 업계에서 사용하는 단모성 가스입니다. 그것은 널리 환경 간 독성, 알려진 발암 물질이며, ATSDR 유해 물질 우선 순위 목록2에#4 순위가 높습니다. 인간의 건강과 기존 동환율과의 상호 작용에 대한 독성 영향을 더 잘 이해하려면 인간의 노출을 모방하는 노출 모델을 설정하는 것이 중요합니다. 이 그룹의 주요 관심사는 낮은 농도에서 만성 VC 노출의 간 효과를 연구하는 것입니다. VC는 간장증, 섬유증, 간경변3,4뿐만아니라 간세포 암종 (HCC) 및 기타 매우 드문 간 혈관 육종을 유발하는 (고농도)와 독성 관련 지방 간염 (TASH)을 유발하는 것으로 나타난 간간에 주요 효과를 발휘합니다. TASH는 수십 년 동안 인구에 존재할 가능성이 있지만 조사관4,6에의해 특성화되지 않고 과소 평가된 채로 남아 있습니다. VC 노출에 대한 직접적인 독성 우려를 입증한 연구 결과, 산업안전보건청(OSHA)은 허용 가능한 노출 임계값을 8시간 근무일7시간동안 1ppm으로 낮췄습니다. 노출 임계값이 낮아졌지만, VC의 이러한 농도가 인간의 건강에 미치는 영향은불분명합니다 7. 추가적으로, 간 질병과 같은 기존 comorbidities에 VC 노출의 효력은, 크게 알려지지 않은8. 이러한 지식 격차는 오늘날 특히 비알코올성지방간 질환(NALFD)4,6,7,9,10,11, 12의글로벌 보급증가로 인해 특히 중요하다. 중요한 것은, VC는 최근 다른 원인13으로부터간 질환에 대한 독립적인 위험 인자인 것으로 나타났다. 이 프로토콜의 목표는 따라서 휘발성 환경 독성물질, VC에 대한 노출을 위한 관련 흡입 모델을 개발하여 근본적인 간 손상의 맥락에서, 인간 노출을 모방하고 VC 유도 또는 VC 강화 간 손상의 잠재적, 새로운 메커니즘을 식별하는 것이었습니다.
많은 환경 독성 물질과 오염 물질에 대한 노출의 주요 경로는 흡입을 통해입니다. 일단 흡입되면, 화합물은 폐를 통해 전신 순환을 입력하고, 간으로 여행하고,14,15,16배설되기 전에 간 효소에 의해 대사적으로 활성화될 수 있다. 그것은 종종 이러한 활성 대사 산물 독성 및 신체 내에서 손상을 일으킬. 이 그룹 및 다른 사람에 의한 이전 연구는 VC 가스17,18에노출을위한 대리로 VC 대사 산물을 사용했다. 다른 그룹은 VC의 흡입 모델을 사용했습니다. 그러나, 매우 높은 노출 수준 (>50 ppm) 급성 독성을 유도 하기 위해 구현 되었다, 심한 간 상해, 및 종양 개발19. 이러한 연구는 VC 유발 발암성의 중요한 정보와 메커니즘을 제공했지만, 그들은 미묘한 효과와 다른 기여 요인과 복잡한 상호 작용을 재현하지 않으므로 인간의 노출과 덜 관련이 있습니다.
여기에 설명된 VC 흡입과 고지방 식단(HFD) 모델(타임라인의 경우 그림 1 참조)은 마우스가 인간 노출을 훨씬 더 밀접하게 모방하는 조건하에서 독성물질에 노출되는 만성 저용량 VC 노출(즉, 하위 OSHA 농도)의 첫 번째 모델입니다. 실제로, 이 모델에서 데이터는 VC에 노출된 인간에서 관찰된 결과를 되풀이, 예를 들어 대사 경로에 미치는 영향20,산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능 장애4. 헤드 전용 및 코 전용모델(21)과같은 흡입의 다른 마우스 모델은 동물을 억제하여 동물에게 스트레스를 유발하도록 요구한다. 여기서, 이러한 전신 노출 방법은 동물에게 주사 또는 불필요한 스트레스를 필요로 하지 않는다. 동물은 음식과 물에 광고 리비텀 액세스 가 있으며, 주당 하루 와 일의 결정 된 수에 대한 더 큰 흡입 챔버 내에 배치됩니다. 더욱이, VC가 다른 간독성제에 대한 민감성을 수정한다는 개념은 이 그룹12에 의해 처음 입증된 새로운 발견이며 직접적인 간독성에 필요한 농도보다 훨씬 낮은 농도에서 VC 노출에 대한 의미를 갖는다.
이 흡입 노출 방법은 환경에 존재하는 다른 휘발성 유기 화합물을 포함한 다양한 기체 독성 물질에 대한 노출을 모방하는 데 사용할 수 있습니다. 실제로, 휘발성 유기 화합물은 환경 독성 물질의 큰 그룹이며 산업화 된 지역에서 더 널리 퍼져 있어 특정 인구가 만성 노출(22)에대한 위험이 더 높습니다. 이 프로토콜은 다양한 실험 적 질문에 맞게 수정할 수 있습니다. 투여된 화합물의 시간 및 농도의 길이는 다양할 수 있다. 비록 처음에 간 손상의 결정을 위해 개발, 다른 장기 시스템 수 있습니다 그리고이 모델으로 공부 되었습니다23. 동물과의 만성 노출을 연구하는 것을 목표로하지만 동물의 스트레스를 최소화하고자하는 조사자는이 모델을 사용하는 것을 고려해야합니다.

<table><tbody><tr><td>ALT/AST 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>TR70121, TR71121</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Animal Studies는 모든 관련 윤리 및 동물 복지 규정을 준수해야 하며 해당 정부 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 검토 및 승인을 받아야 합니다. 이것은 만성 연구이기 때문에 생후 4-6주령의 수컷 또는 암컷 마우스를 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>CO2 모니터</td><td>IEStechno</td><td>Ex-Sens</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>E6003</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>흡입 노출 챔버 시스템</td><td>IEStechno</td><td>GasExpo</td><td>흡입 노출 챔버 시스템에는 맞춤형 소프트웨어, 인터페이스 및 컨트롤러 허브가 포함됩니다</td></tr><tr><td>포화 지방(13%) 제어 다이어트</td><td>Teklad Diets</td><td>TD.120336</td><td></td></tr><tr><td>포화 지방(42%) 다이어트</td><td>Teklad Diets</td><td>TD.07511</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>염화비닐</td><td>MATHESON TRI-GAS</td><td>시리즈 3590-CGA*</td><td>가스 취급은 주의해야 합니다</td></tr></tbody></table>.

환경과 비만 상호 작용의 모델로 비닐 염화물 과 고지방 다이어트

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

풍부한 환경 오염물질인 염화비닐(VC)은 높은 수준의 지방 간염을 유발하지만 낮은 수준에서 안전한 것으로 간주됩니다. 여러 연구에서 직접 간 독성으로 VC의 역할을 조사했지만, VC가 고지방 식단 (HFD)으로 인한 비 알코올 성 지방 간 질환 (NAFLD)과 같은 다른 요인에 대한 간 민감성을 수정한다는 개념은 새적입니다. 이 프로토콜은 VC에 대한 만성, 저수준 노출의 영향을 평가하기 위한 노출 패러다임을 설명합니다. 마우스는 흡입 노출의 시작 1 주일 전에 저지방 또는 고지방 규정식에 적응하고 실험 내내 이 규정식에 남아 있습니다. 마우스는 VC(하위 OSHA 수준: <1 ppm) 또는 실내 공기 흡입 실에서 6시간/일, 5일/주, 최대 12주 동안 노출된다. 동물은 체중 증가 와 음식 소비에 대 한 매주 모니터링 됩니다. VC 노출의 이 모형은 혼자 VC 흡입으로 더 과장된 간 상해를 일으키는 원인이 되지 않습니다. 그러나, VC와 HFD의 조합은 크게 간 질환을 향상. 이 공동 노출 모델의 기술적 장점은 구속없이 전신 노출입니다. 더욱이, 조건은 더 밀접하게 근본적인 비알코올성 지방 간 질병을 가진 VC에 결합된 노출의 아주 일반적인 인간 상황유사하고 그러므로 VC가 비만의 합병증으로 간 손상의 발달을 위한 환경 위험 요소이다는 새로운 가설을 지원합니다 (즉, NAFLD). 이 작업은 VC(직업 및 환경)의 현재 노출 제한이 안전하다는 패러다임에 도전합니다. 이 모델을 사용하면 VC 노출의 위험에 대한 새로운 빛과 우려를 불러올 수 있습니다. 독성 유발 간 손상의이 모델은 다른 휘발성 유기 화합물에 대 한 사용 될 수 있으며 간 및 다른 장기 시스템에 영향을 미칠 수 있는 다른 상호 작용을 공부.

실험의 과정을 통해, 동물의 체중과 음식 소비는 동물의 건강을 보장하고 생체 내 신진 대사를 평가하기 위해 매주 모니터링되었다. 그림 3A는 12주 실험에 대한 체중 및 음식 소비를 나타낸 다. 체중은 일주일에 한 번 측정되었고 음식 소비는 모든 그룹에 대해 일주일에 두 번 측정되었습니다. 모든 마우스는 연구의 과정을 통해 무게를 얻었다. 반면, 예상대로 HFD 군에서 마우스는 LFD 군에서 마우스로서 더 많은 체중을 얻었지만, VC에 노출된 마우스는 각각의 대조군에서 마우스보다 더 많은 체중을 얻지 못했다. 음식 소비는 모든 그룹 간에 다르지 않았다12,24.
그림 3B는 일반적인 형태학의 분석을 위해 H&amp;E로 염색된 간 절개의 대표적인 광현미경 을 묘사합니다. LFD 그룹에서 VC는 병리학적 변화를 일으키지 않았습니다. HFD 수유는 지방축적(fat accumulation)을 크게 증가시키고 VC 노출은 이 효과를 증가시켰습니다. 더욱이, HFD 군에서VC 노출은 일부 염증성 초점12,24를초래했다.
플라즈마 transaminase (ALT 및 AST) 수준은 간 손상의 지표로 측정 되었고 높은 transaminase 수준은 간 손상의 지표. LFD 그룹에서 VC는 트랜스아미나제 수준을 증가시키지 않았다. HFD 만으로도 트랜스아미나제 수치가 약간 증가하고 중요한 VC가 이 효과를 크게 향상시켰습니다(도3C)12,24.
간 중량 대 체중 비율은 각 그룹에 대해 계산되었다. HFD는 체중 비율에 간을 크게 증가시켰습니다. 그러나 VC는 이 효과를 크게 증가시키지않았다(도 3D)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig01.jpg"> 그림 1: 흡입 모델 절차의 개요입니다. 생쥐는 각각 저지방(13% 포화지방) 또는 고지방(42% 포화지방)을 정제된 식단에 순응시키기 위해 1주일 동안 ad libitum을 먹인다. 1주일 후, 마우스는 흡입 요법에 도입된다. 이를 위해, 마우스는 12주 동안 6시간/일, 5일/주 동안 및 실내 공기(제어)의 &lt;1 ppm(0.85 ppm ±0.1 ppm) 및 실내 공기(제어)에 노출을 위해 최첨단 전신 흡입 챔버에 배치된다. 흡입 절차 도중 마우스는 음식과 근해에 자유로운 접근을 허용됩니다. 12주에, 마우스는 아침에 안락사된다. 이 모델은 만성 노출의 더 긴 기간으로 확장될 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig02.jpg"> 그림 2: 흡입 챔버 설계. 균일 한 독성 농도를 제공하는 자동 흡입 노출 시스템의 다이어그램이 표시됩니다. 사용자 정의 소프트웨어는 사용자가 변경 모니터링 및 흡입 노출 동안 환경 변수를 기록 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig03.jpg"> 그림 3: 염화 비닐만으로는 간 손상을 일으키지 않지만 식이에 의한 간 질환을 향상시킵니다. (A)체중과 식품 소비를 매주 모니터링하였다. (B)H&amp;E 염색에 의한 일반 간 형태학의 대표적인 광현미경 검체(배율 = 200배)가 나타났다. (C)세포화 플라즈마는 노출 기간의 끝에서 수집하고 간 손상의 지수로서 트랜스아미나제 효소 활성을 분석하였다. (D)간 중량은 상이한 실험 시점에서 결정되었고, 전체 체중과 비교하였다. 결과는 각각의 LFD 대조군과 비교하여 평균 ±SEM.a,p&lt; 0.05로서 제시된다; b,p &lt; 0.05 VC의 부재에 비해. 그룹당 샘플 크기 n = 8−10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜의 목표는 간 손상을 유발하지 않고 오히려 기존의 간 손상을 악화낮은 수준의 독성 노출의 뮤린 모델을 개발하는 것이었습니다. 이 패러다임은 더 나은 인간의 노출과 안전한 것으로 간주되는 독성 농도에 노출시 발생하는 미묘한 변화를 재현.

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

염화물 염화물은 현재 안전 제한 이하의 농도에서 다이어트와 같은 다른 요인에 의한 간 손상을 악화시다. 따라서 평균 모집단의 사용 매개 변수를 재평가해야 합니다. 이 기술의 주요 장점은 동물에게 최소한의 스트레스를 유발하면서 인간의 노출을 밀접하게 모방하는 만성 비 침습적 흡입 프로토콜을 사용한다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 안나 랭, 포스트 닥터, 그리고 레지나 Schnegelberger, 대학원생, 모두 내 실험실에서 될 것입니다. 흡입 실험이 시작되기 1 주일 전에 모든 실험 동물의 무게를 측정하고 케이지 당 제공되는 저지방 또는 고지방 다이어트 식품의 양을 무게. 음식과 물 광고 리비툼을 제공 하 여 각 노출 그룹에 대 한 일반 차우를 저지방 또는 고지방 다이어트 차우로 대체, 적절 하 게.각 먹이 일의 끝에 나머지 음식을 무게와 동물의 건강이 유지되도록 실험 을 통해 마우스를 모니터링. 염화물 흡입 노출 시스템을 설정하려면 각 유량 측정 장치에 들어가기 전에 실험 및 제어 챔버 모두에서 희석공기가 고효율 미립자 공기 및 활성 탄화, 건조 및 압력 조절되었는지 확인합니다. 온도 및 상대 습도가 실험 및 제어 챔버 내에서 모니터링되는지 확인하고, 챔버 배기는 HEPA 필터, 이산화탄소 프로브 및 활성 탄필터를 통과한 후, 마우스가 허용 가능한 환기를 받고 있는지 확인하기 위해 화학 후드의 배기 영역으로 들어가기 전에 전달된다.사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 흡입 노출 중에 관심 있는 환경 변수를 변경, 모니터링 및 기록할 수 있습니다. 흡입 노출을 위해 챔버를 준비하려면 실험 및 제어 챔버의 모든 공기 흐름을 끄는 것으로 시작합니다. 각 챔버 도어를 열고 흡수성 침구 소재를 배설물 팬 위에 올려 놓습니다.이어서, 흡수성 물질을 적시어 노출 기간 동안 약 40~60%의 상대 습도의 쾌적한 습도를 제공하고 실험챔버에서 염화물의 원하는 노출 수준을 설정한다. 챔버가 준비되면, 흡입 챔버 케이지 랙 내에서 개별 케이지로 마우스를 전송, 각 마우스가 챔버 내에서 균일하게 노출되도록 매일 랙 내에서 각 마우스의 배치를 무작위. 그런 다음 각 케이지 랙을 각 챔버에 넣고 챔버 도어를 닫습니다.흡입 노출 실험을 수행하기 위해, 비닐 염화물 가스 탱크의 밸브가 열린 위치에 있는지 확인하고 실험 챔버의 희석 흐름을 분당 25 리터로 설정합니다. 제어 챔버의 로타미터가 분당 25리터로 설정되어 있는지 확인하고 모든 센서가 올바르게 작동하고 실험 및 제어 챔버 모두에서 예상 결과를 표시하고 있는지 확인합니다. 노출 전반에 걸쳐, 노출 시간, 희석흐름, 염화물 흐름, 온도, 습도, 챔버 압력, 이산화탄소 수준 및 실험 챔버의 이론적 염화 비닐 농도를 모니터링 및 기록한다.제어실의 온도와 습도도 표시, 그래프 및 기록되어 있는지 확인합니다. 각 노출을 통해 약 절반정도, 비닐 염화물 검출기 튜브와 퇴각 튜브에 유리 팁을 깨고 검출기 튜브 펌프에 비닐 염화물 검출기 튜브의 흐름 끝을 부착. 짧은 튜브를 사용하여 비닐 염화물 검출기 튜브의 끝에 있는 흐름을 pretreat 튜브의 흐름에 부착하고 퇴각 끝에 있는 흐름에 짧은 튜브를 부착합니다.호흡 영역 근처의 샘플링 포트 중 하나에서 플러그를 제거하고 pretreat 튜브 의 끝에있는 흐름에서 샘플링 포트에 튜브를 부착합니다. 전체 위치에서, 검출기 튜브 펌프의 피스톤에 손잡이를 전체 아웃 위치로 확장하여 챔버에서 샘플링 된 가스 100 밀리리터를 비닐 염화물 검출기 튜브로 끌어 당깁니다. 90초 후에 핸들을 다시 밀어 넣습니다.마지막 가스 샘플을 얻은 후 챔버의 샘플링 포트에서 튜브를 제거하고 플러그를 포트에 다시 삽입합니다. 비닐 염화물 검출기 튜브의 색상 변화를 검사하여 챔버 내의 염화물 농도를 확인하고 이론적 값에 비해 검출기 튜브 판독값을 기록한다. 노출 중에 문제가 발생하면 비닐 염화물 흐름을 0으로 설정하고 희석 흐름을 최대 값으로 늘려 챔버를 신속하게 제거합니다.노출 지속 시간이 도달하면 소프트웨어가 자동으로 비닐 염화물 흐름을 끕니다. 그런 다음 15분 안전 타이머가 실험 챔버에서 비닐 염화물을 치우는 기간을 카운트다운하기 시작합니다. 동물을 제거하는 것이 안전하면 확인을 클릭하십시오.노출 기간이 끝나면 비닐 염화물 가스 탱크 밸브 스톱콕을 닫힌 위치로 돌리고 노출 챔버의 모든 공기 흐름을 끕니다. 제어실을 통해 공기가 흐르지 않고 각 챔버에서 문을 제거할 때까지 로타미터를 켭니다. 챔버에서 케이지 랙을 제거하고 라미나르 흐름 후드 아래 자신의 홈 케이지로 마우스를 다시 전송합니다.그런 다음, 기관 건강 및 안전 규정에 따라 배설물 팬에서 폐기물을 처분하고 챔버 도어, 팬, 노출 랙 및 챔버를 청소하십시오. 여기서, 주간 체중과 12주 실험의 격주 음식 소비가 표시됩니다. 모든 마우스는 이 연구 과정을 통해 체중을 얻었습니다.그러나, 고지방 식이군에서 마우스가 저지방 식이군에서 쥐에 비해 더 많은 무게를 얻었지만, 염화비닐에 노출된 쥐는 각각대조군에서 마우스보다 더 많은 체중을 얻지 못했다. 음식 소비는 또한 그룹 사이에서 다르지 않았습니다. 이러한 대표자 에서 H&E 염색 간 섹션의 사진 현미경, 비닐 염화 비닐은 저지방 다이어트 그룹에 있는 아무 과장된 병리학 적인 변경을 일으키지 않았습니다.고지방 다이어트 공급 크게 증가 steatosis, 비닐 염화물 노출에 의해 더 악화되었다. 더욱이, 고지방 식이군에서 염화비닐에 노출되어 염증성 포시가 발생하였다. 저지방 다이어트 동물에서는 염화비닐이 트랜스아미나아제 수준을 증가시키지 않았고, 고지방 식단만으로도 트랜스아미나아제 발현이 약간 증가하여 염화비닐에 노출된 고지방 식이군에서 관찰되는 효과가 크게 향상되었다.또한, 고지방 식단은 간에서 체중 비율을 크게 증가시켰지만 염화물 염화물은 이 효과에 크게 영향을 미치지 않았습니다. 이 프로토콜을 구현할 때, 항상 적절한 안전 예방 조치를 취하여 인간이 비닐 염화물에 실수로 노출하는 것을 피하십시오. 이 절차는 동물 건강, 복지 및 장기 손상에 미치는 영향을 비닐 염화 비닐의 단기, 장기 및 누적 효과에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다.이러한 연구는 환경 및 직업 위험 평가 분야에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 우리 그룹은 이제 염화 비닐과 다이어트 사이의 기계적 상호 작용을 연구합니다.

vinyl-chloride-high-fat-diet-as-model-environment-obesity

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

지방 콘텐츠 분석은 정기적으로 murine 비만 모델을 이용한 연구를 실시하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징 및 분석의 신흥 방법은 종방향 세부 풍부한 지방이 콘텐츠를 분석 제공하고 있습니다. 작은 동물 중부 표준시 이미징, 분석 및 시각화를 수행하기위한 단계 절차에 의해 여기 세부 단계.

세분화 및 Murine 비만 모델에서 지방 볼륨 측정 X 선 계산된 Tomography를 사용하여

식이 지방 함량에 영향 에너지 섭취와 포유류의 신체 지방 성분 모두. 선택 일련의 실험에서 고지방 음식에 대한 쥐 '환경 설정을 검사하여, 높은 지방 음식에 대한 자신의 선호에 유전 적 차이와 약물 개입을 테스트 할 수 있습니다.

지방 성향 : 먹는 행동의 소설 모델 쥐에

높은 지방, 높은 자당 다이어트를 사용 하 여 토끼에서 다이어트 유발 된 변화 증후군 (메츠)의 실험 모델을 개발 하는 방법을 설명 합니다. 동물 개발 중앙 비만, 가벼운 고혈압, 사전 당뇨병, 그리고 dyslipidemia, 따라서 인간의 메츠의 주요 구성 요소를 재현. 이 만성 모델 질병 진행의 지식 기본 메커니즘의 인수를 수 있습니다.

토끼에서 다이어트 유발 된 변화 증후군의 실험 모델: 방법론 고려 사항, 개발 및 평가

이 프로토콜 신체 조성 분석기와 신체 구성 및 쥐에서 대사 매개 변수 특성을 대사 동물 모니터링 시스템의 사용을 설명 합니다. 고 지방 먹이로 유도 된 비만 모델은 이러한 기술의 응용 프로그램에 대 한 예제로 사용 됩니다.

신체 구성 및 높은 지방 연 준 쥐에서 대사 배우면 분석

이 프로토콜은 설치류에서 과식과 비만을 모델링하기 위해 매우 맛있는 서양식 카페테리아 식단의 사용을 설명합니다. 여기에서는 식품 선택, 준비 및 측정에 대한 자세한 개요를 제공하고 견고하고 재현 가능한 표현형을 생성하는 데 도움이 되는 방법론 적 요인을 설명합니다.

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이 논문은 식이 유발 비만의 Sprague-Dawley 쥐 모델에서 고강도 인터벌 트레이닝(HIIT) 프로토콜의 형태학적 반응과 훈련 수행 결과를 제시합니다. 이 프로토콜의 목적은 운동 강도를 극대화하고 마른 쥐와 비만 쥐의 HIIT에 대한 생리학적 반응을 결정하는 것이었습니다.

운동 노력을 극대화하고 쥐의 생리적 변화를 유도하기 위한 만성 고강도 인터벌 트레이닝 및 식이 유도 비만 모델

이 연구는 일반적으로 지방 췌장을 특징으로 하는 단순 비만을 나타내는 비만 쥐 모델을 확립하기 위해 재현 가능하고 표준화된 방법을 제공합니다. 또한 췌장 조직 샘플링 및 면역조직화학에 대한 자세한 프로토콜도 포함되어 있습니다.

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체외 이식 모델을 사용하여, 저지방 쥐의 내장 백색 지방 조직의 앞부분 일부를 7일에서 10일간 배양하여, 고지방 식이 섭취 중 지방 조직 염증을 유도하고 연구할 수 있게 합니다.

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Lipoxygenase (LOX) isozymes 증가 또는 증가 시킬 수 있는 제품을 생성할 수 있습니다 또는 신경 염증 및 신경 변성. 유전자 환경 상호 작용 연구 LOX isozyme 특이적 효과 식별할 수 있습니다. 두 개의 LOX isozyme-결핍 형 형질 라인에서 니그로스트리아탈 손상의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하면 도파미너기크 및 염증에 대한 LOX 이소지메의 기여도를 비교할 수 있습니다.

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우리는 흥분 독성 매개 성 뇌 손상에 관련된 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용될 수있는 뇌 슬라이스 모델을 개발 하였다. 이 기술은 실행 가능한 성숙한 뇌 조직을 생성하고, 부분적으로 손상 신경 회로, 세포 상호 작용과 시냅스 구획을 유지하면서, 실험에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

학습하세요 비닐 염화물 흡입 노출과 고지방 다이어트를 사용한 생쥐 간 손상 모델링 방법. 이 기법은 인간 노출 조건을 모방하면서 동물 스트레스를 최소화하는 만성적이고 비침습적인 프로토콜을 활용합니다.

환경과 비만 상호 작용의 모델로 비닐 염화물 과 고지방 다이어트

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