Name: 마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 배우세요 포르말린 고정 파라핀 매립된 태반 융모 조직에서 다중 마이크로위성 DNA 게노타이핑과 유동 세포분석 방법을. 모계 DNA 오염을 최소화하여 수태낭종 진단의 정확성을 높이는 이 프로토콜은 유전학 및 병리학 연구에 필수적입니다.

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저자는 원래 의 흐름 세포 분석 프로토콜을 공유 소피 패트리어와 마리안 파레시 감사, 공급 및 시약을 제공하는 프로메가와 Qiagen. 이 작품은 레소 Québécois en 생식및 건강 연구를 위한 캐나다 연구소 (MOP-130364)에 의해 R.S에 지원되었습니다.

<ol><li>Szulman, A. E., Surti, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndromes+of+hydatidiform+mole.+II.+Morphologic+evolution+of+the+complete+and+partial+mole%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).</li>
<li>Fukunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interobserver+and+intraobserver+variability+in+the+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).</li>
<li>Gupta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+reproducibility+of+hydatidiform+moles%3A+ancillary+techniques+%28p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%29+improve+morphologic+diagnosis+for+both+recently+trained+and+experienced+gynecologic+pathologists%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).</li>
<li>Howat, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+histopathologists+reliably+diagnose+molar+pregnancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?</a> Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).</li>
<li>Banet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+hydatidiform+moles%3A+analysis+of+a+prospective+series+with+p57+immunohistochemistry+and+molecular+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping.</a> Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).</li>
<li>Lipata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+genotyping+diagnosis+of+hydatidiform+mole%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole.</a> Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).</li>
<li>Buza, N., Hui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hydatidiform+mole%3A+histologic+parameters+in+correlation+with+DNA+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).</li>
<li>Fisher, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+heterozygous+complete+hydatidiform+moles%2C+estimated+by+locus-specific+minisatellite+and+Y+chromosome-specific+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes.</a> Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).</li>
<li>Murdoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+NALP7+cause+recurrent+hydatidiform+moles+and+reproductive+wastage+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans.</a> Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).</li>
<li>Parry, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+causing+familial+biparental+hydatidiform+mole+implicate+c6orf221+as+a+possible+regulator+of+genomic+imprinting+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).</li>
<li>Nguyen, N. M., Slim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+Epigenetics+of+Recurrent+Hydatidiform+Moles%3A+Basic+Science+and+Genetic+Counselling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Obstetrics+and+Gynecology+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling.</a> Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).</li>
<li>Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+features+of+biparental+complete+hydatidiform+moles+in+women+with+NLRP7+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations.</a> Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).</li>
<li>Nguyen, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genotype-phenotype+correlations+between+NLRP7+mutations+and+the+balance+between+embryonic+tissue+differentiation+and+trophoblastic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).</li>
<li>Brown, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+pregnancy+loss+in+a+woman+with+NLRP7+mutation%3A+not+all+molar+pregnancies+can+be+easily+classified+as+either+%22partial%22+or+%22complete%22+hydatidiform+moles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Gynecologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles.</a> International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).</li>
<li>Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reappraisal+of+the+Incidence+of+Placental+Hydatidiform+Mole+Using+Selective+Molecular+Genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Gynecological+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping.</a> The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).</li>
<li>Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genotyping+of+hydatidiform+moles%3A+analytic+validation+of+a+multiplex+short+tandem+repeat+assay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

HM은 이질적인 병인을 가진 이상한 인간 적인 임신이고 그들의 정확한 분류 및 진단을 도전하게 하는 다른 조직학 및 genotypic 모형이 있습니다. 조직 병리학 적 형태 학적 평가는 종종 부정확입증되었고 따라서 HM을 CHM 및 PHM으로 분류하고 비 어금니 유산과 구별하기 위해 자체적으로 신뢰할 수 없습니다. 따라서 HM의 정확한 진단은 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 지질분석, 유세포분석에 의한 계략 분석, FISH에 의한 계략 분석, p57KIP2 면역조직화학 과 같은 다른 방법의 사용을 필요로 한다. 이러한 각 방법에는 고유한 제한 사항과 장점이 있습니다.
멀티플렉스 지노티핑 및 유량 세포분석의 한계와 장점
모성 오염은 FFPE 조직으로 일할 때 가장 일반적인 문제 중 하나이며 오진으로 이어질 수 있으므로 POC 조직에서 모계를 분리하는 것이 중요합니다. 그것은 지질 형질...

수다디폼 두더지(HM)는 비정상적인 배아 발달, 트로포블라스트의 과증식, 융모융물(CV)의 수경 변성을 특징으로 하는 비정상적인 인간 임신입니다. 역사적으로, HM은 형태학적 평가1에기초하여 완전한 HM(CHM) 및 부분 HM(PHM)의 두 가지 유형으로 나뉘었다. 그러나, 형태학적 평가만으로는 HM을 두 개의 아류형(CHM 및 PHM)으로 분류하고 이를 비어치 유산2,3,4와구별하기에 충분하지 않은 것으로 나타났다.
CHM과 PHM은 악성 종양에 다른 성향을 가지고 있기 때문에, 환자에게 적절한 후속 및 관리를 제공하기 위해 HM의 유전자 형 유형을 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. 따라서 지난 수십 년 동안 어금니 조직에 대한 부모의 기여를 확인하고 HM의 올바른 분류에 도달하기 위해 여러 가지 방법론이 개발되고 발전했습니다. 여기에는 핵형 분석, 염색체 밴딩 다형성, 인간 백혈구 항원 (HLA) 혈청학적 입력, 제한 단편 길이 다형성, 가변 수의 탠덤 반복, 마이크로 위성 유전자 변형, 유세포 분석 및 p57이 포함됩니다. KIP2 면역 화학. 이것은 그들의 게놈에 부모 기여에 근거를 둔 HM 개념의 정확한 세분화를 허용했습니다, 다음과 같이: CHM, 이는 이월 및 유전적 단정자 또는 디플로이드 안드로이노믹 분산증, 및 PHM, 이는 삼엽충, 99%에서 분산성 및 케이스5,6,7,8의1 %에서 단정자 . 게다가, 지난 2 년간 에서 나타난 HM의 또 다른 genotypic 모형이 있습니다, 이는 이형 양부모입니다. 후자는 주로 재발하고 단일 가족 구성원 (심플렉스 케이스) 또는 적어도 2 개의 가족 구성원 (가족 케이스)에 영향을 미칠 수 있습니다. 이들 디플로이드 두더지들은 주로 환자9,10,11,12에서 NLRP7 또는 KHDC3L의 열성 돌연변이에 의해 유발된다. NLRP7에서 열성 돌연변이를 가진 환자에서 디플로이드 양부모 HM은 형태학적 분석에 의해 CHM 또는 PHM으로 진단될 수 있으며 이는 환자13,14에서돌연변이의 중증도와 연관된 것으로 보인다. 그들의 유전자형에 따른 HM의 분류 이외에, 몇몇 유전형질 방법의 소개 그리고 사용은 이누엽 이완 양부모 개념과 같은 비 어금니 유산에서 각종 대구물 엔티티의 구별을 허용하고 개념의 다른 유형5,15. 이러한 개념은 HM의 일부 형태학적 특징을 어느 정도 모방하는 trophoblast 증식 및 비정상적인 융모 형태를 가질 수 있습니다.
이 문서의 목적은 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직의 다중 지질 분석 및 유세포 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고, 이러한 방법의 결과와 다른 방법과의 통합에 대한 포괄적 인 분석을 제공하는 것입니다. 어금니 조직의 정확하고 결정적인 진단.

<table><tbody><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD BioSciences</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>모세관 전기 영동 기기 : Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA 분석기</td> 응용 유전체학 센터에서 제공하는 <td>응용 바이오 시스템</td><td>313001R</td><td> (http://www.tcag.ca)</td></tr> <tr><td>구연산</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60, 조직 병리학 장착 매체</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>23244257</tr><tr><td>Eosin Y 원액 (1%)</td> <td>Fisher</td><td>SE23-500D</td><td></td></tr><tr><td>FCSalyzer - 유세포 분석 소프트웨어</td><td>SourceForge-https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FFPE Qiagen kit</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td>절편 및 세척 공정용</td></tr><tr><td>Glacial 아세트산 (농축)</td> <td>Sigma</td><td>A6283-500mL</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립 : 커버 유리</td><td>Fisher</td><td>12-541a</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Fisher</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>고 탈 이온화 포름 아미드 : Hi-Di 포름 아미드</td><td>Thermofisher</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>IHC 플랫폼 : 벤치 마크 Ultra</td><td>Roche-Kimwipes</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Ultident</td><td>30-34120</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>라이카</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰 블레이드</td><td>Fisher</td><td>12-634-1C</td><td></td></tr><tr><td>Nitex 필터링 메시, 48 &mu; m</td><td>Filmar</td><td>74011</td><td>http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; 다른 필터도 적합하지만 이것은 비 연구 회사의 저렴하고 효과적인 옵션입니다.</td></tr><tr><td>p57 항체</td><td>Cell Marque</td><td>457M</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>53499-632</td><td></td></tr><tr><td>PCR 기계</td><td>Perkin Elmer, Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>PeakScanner 1.0</td><td>유전형 분석을 위한</td> <td>응용 Biosystems</td><td>4381867</td> 소프트웨어.</tr><tr><td>돼지 위 점막의 펩신</td><td>시그마</td><td>P7012</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>양전하 슬라이드 : Superfrost Plus 25x75mm</td><td>Fisher</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>PowerPlex 16 HS System</td><td>Promega Corporation</td><td>DC2102</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 리보뉴클레아제 A</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>분리 매트릭스: POP-7 폴리머</td><td>써모피셔</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Agarose Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>크실렌</td><td>피셔</td><td>X3P1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로위성 dna 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

수다디폼 두더지(HM)는 과도한 트로포블라아제 증식과 비정상적인 배아 발달을 특징으로 하는 비정상적인 인간 임신입니다. 현미경 형태 학적 평가, 완전한 HM (CHM) 및 부분 HM (PHM)에 따라 HM의 두 가지 유형이 있습니다. 이들은 어금니 게놈에 대한 부모의 기여에 기초하여 더 세분화될 수 있습니다. 형태학 및 유전자형 분석에 의한 HM의 이러한 특성화는 환자 관리및 이 흥미로운 병리학의 근본적인 이해에 매우 중요합니다. HM의 형태학적 분석은 광범위한 관찰자 간 가변성의 영향을 받으며 HM을 CHM 및 PHM으로 정확하게 분류하고 수경 비 어금니 낙태와 구별하기에 충분하지 않다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. Genotyping 분석은 주로 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 개념작용의 제품에서 DNA 와 조직에 수행되며, 이는 최적의 품질보다 적고 결과적으로 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이 문서에서는, FFPE 어금니 조직의 다중 지질 분석 및 유동 세포 분석 분석을 위한 상세한 프로토콜은, 이 방법의 결과의 해석과 더불어, 그들의 문제 해결 및 형태학적 평가와의 통합과 더불어 제공됩니다 , p57KIP2 면역성 화학 및 현장 혼성화 (FISH)에서형광은 정확하고 견고한 진단에 도달합니다. 여기에서 저자는 약 400개의 개념 작용 제품을 분석하여 지난 10년 동안 배운 방법과 교훈을 공유합니다.

어금니 조직의 복잡성과 다양한 유전자형이 있을 수 있다는 사실은 형태학적 평가, p57 면역 조직 화학, 마이크로 위성 유전형 분석, 유세포 분석 및 FISH와 같은 여러 방법의 엄격한 분석 및 사용을 필요로합니다. 예를 들어, 한 환자(1790)는 POCs의 마이크로어레이 분석에 의해서만 삼엽수인 것으로 밝혀진 2개의 PHM을 참조하였다. 환자는 그러므로 재발하는 PHM으로 진단되었습니다. 환자와 그녀의 파트너의 DNA와 함께 그녀의 두 "PHM"의 마이크로 위성 유전자 형질 태핑은 환자의 첫 번째 두더지가 삼엽핍 분산증(그림 9A)동안, 그녀의 두 번째 "PHM"은 삼엽이식 유전자형을 가지고 있음을 밝혔다(그림 9 B)와따라서 PHM이 아니라 비어치 유산이다.
<p class="jove_con...

수다디형 두더지(Hydatidiform moles)는 어금니 게놈에 대한 부모의 기여와 형태학적 특징에 따라 분류될 수 있는 이기종 빈치학을 가진 비정상적인 인간 임신입니다. 여기서, 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 의전성 및 포르말린 파라핀 내장 어금니 조직의 유동 세포분석프로토콜은 결과의 해석 및 통합과 함께 상세히 기술된다.

마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

우리의 genotyping 프로토콜의 주요 장점은 모계 DNA로 오염을 최소화한다는 것입니다, 이는 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 어유 조직을 genotyping 할 때 주요 도전이다. 유동 세포측정은 수다티디폼 두더지의 진단을 크게 용이하게 하는 빠르고 저렴한 방법입니다. 각 포르말린 고정 파라핀 임베디드 또는 펙핀에 대해, 개념작용의 생성물인 FFPE는 현미경 검사법에 의한 형태학적 평가를 위해 이 비디오에 상세히 설명된 대로 4미크로닌 두께의 헤마톡시린 및 에오신 얼룩 섹션을 준비한다.단면을 용이하게하기 위해 15 분 동안 얼음에 FFPE 블록을 배치합니다. 미세 항을 조정하여 미세한 형태학적 평가를 위해 4개의 미크론 두께의 단면을 잘라냅니다. 차가운 블록을 마이크로톤에 놓고 H&E 염색을 위해 각 블록에서 한 부분을 잘라냅니다.집게를 사용하여 각 구간을 섭씨 45도까지 옮기는 다. 이전에 연필을 사용하여 샘플 식별 번호로 표시된 양충전 슬라이드로 수조에서 섹션을 선택하십시오. 섹션이 슬라이드를 부착할 수 있도록 섹션이 포함된 슬라이드를 섭씨 65도에 오븐에 놓습니다.슬라이드를 오븐에 25분간 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 표로 된 올바른 기간 동안 슬라이드를 적절한 염색 항아리에 잠급하여 H&E 염색을 수행합니다. 마운팅 배지를 가진 형태학적 분석을 위해 4미크로닌 섹션을 장착합니다.그리고 유리 커버 슬립으로 덮습니다. H&E 슬라이드와 가벼운 현미경을 사용하여 가장 많은 양의 융모를 사용하는 FFPE 블록을 선택합니다. 그리고 가능하다면, 모성 조직과 섞이지 않고 초리오닉 빌리가 분리되어 있는 블록.DNA 추출을 위해 두꺼운 10 미크론인 부분을 절단하기 위해 마이크로토메를 조정합니다. 블록의 융모의 양에 따라 10 ~30 섹션을 잘라냅니다. 슬라이드가 있는 섹션을 이전과 같이 픽업한 후 섹션이 65도의 오븐에 있는 슬라이드를 배치하여 섹션이 슬라이드를 부착할 수 있도록 합니다.슬라이드를 오븐에 20분 간 보관하십시오. 텍스트 프로토콜에 표로 된 올바른 기간 동안 슬라이드를 적절한 염색 항아리에 잠급하여 H&E 염색을 수행합니다. 독성 자일렌 냄새가 사라지기 위해 연기 후드 아래에 슬라이드를 최소 3 시간 동안 둡니다.집게를 사용하여, 촉촉한 종이 닦아작은 종이 조각을 찢어. 가벼운 스테레오 현미경으로, 포셉과 물 촉촉한 종이 물티슈의 작은 조각을 사용하여 H&E 얼룩 10 미크론 두께의 섹션에서 원치 않는 모든 모성 조직을 긁어 냅니다. 이 단계의 핵심은 인내심, 특히 도전적인 블록에 대한 것입니다.또한 다른 사람이 모성 조직을 놓치지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이제, 촉촉한 종이 물티슈에서 새 종이를 찢고 그것을 사용하여 융모의 사악한 것을 수집합니다. 1.5ml 튜브에 부착된 융모성 빌리와 종이 물티슈 조각을 놓습니다.DNA 추출 컬럼을 너무 많이 막히면 수집된 DNA의 최종 양을 줄일 수 있으므로 이 단계에서 사용되는 종이 물티슈의 양을 최소화하십시오. DNA 추출을 수행하기 위해 FFPE 키트에서 DNA 추출 프로토콜을 따르십시오. 실험실 분광계를 사용하여 DNA 1 마이크로리터를 적재하고 216 nm에서 흡수성을 측정하여 정량화를 합니다.2% 아가로즈 젤에 DNA 1 마이크로리터를 적재하고 질적 평가를 위해 80~100볼트의 전압으로 젤 전기전경을 실행합니다. DNA 평가 결과에 기초하여, 멀티플렉스 짧은 탠덤 반복 PCR 증폭에 사용될 DNA의 부피를 선택한다. DNA의 최소 1000 나노 그램을 사용하는 것을 목표로합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 PCR 증폭, 모세관 전기포고 및 데이터 분석을 진행한다. 이상적인 FFPE 블록을 선택하려면 가벼운 현미경으로 H&E 슬라이드를 사용하여 chorionic villi로 구성된 조직의 약 50~70%가 있는 FFPE 블록을 선택합니다. 이상적인 양의 융모가 없는 블록의 경우 단면이 수행됨에 따라 융모성 빌리를 풍부하게 합니다.이렇게 하려면, 새로 잘라 섹션의 어느 쪽이 해당 H&E 슬라이드에 따라 더 많은 chorionic villi를 포함 식별합니다. 그런 다음, 융모성 빌리를 위해 풍요롭게하기 위해 버려야 하는 나머지 절반을 잘라내기 위해 블레이드를 사용합니다. 최상의 FFPE 블록의 단면을 수행하려면 마이크로토메를 사용하여 두께가 50미크론인 4개의 섹션을 잘라냅니다.이상적인 FFPE 블록을 사용할 수없는 경우, 그럼에도 불구하고 모계 조직에 대한 융모 의 비율을 유지하는 것을 목표로. 예를 들어 블록의 30%만이 초리오닉 빌리로 구성되고 나머지는 모성 조직이 있는 반면, 모성 조직이 포함된 섹션의 절반 이상을 제거하고 보상하기 위해 더 많은 섹션을 사용합니다. 섹션은 15mL 튜브에 배치합니다.분리 및 재수화를 위해 연기 후드에서 작업하여 각 시약을 추가하고 텍스트 프로토콜에 표화된 적절한 기간을 기다립니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫으로 진공 흡입에 의해 시약을 제거합니다. 다음으로 15mL 튜브에 섭씨 4도 구연산 용액을 추가합니다.섭씨 80도의 수조에 2시간 동안 놓은 후, 실온까지 용액을 식히게 하십시오. 진공 흡입에 의해 구연산용액을 제거합니다. 1x PBS, 소용돌이의 6 밀리리터를 추가하고 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 기다립니다.필요한 경우 샘플을 1000 RPM에서 30초 동안 원심분리합니다. 진공 흡입에 의해 1X PBS를 제거합니다. 이제 예열 된 펩신 용액 1 mL을 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도 건조 목욕에 놓습니다.10분마다 소용돌이. 이 배큐베이션의 마지막 10분 안에 프로피듐 요오드 리보누엘리스 A 용액을 준비한다. 1x PBS, 소용돌이의 또 다른 6mL을 추가하고 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 1 ~ 2 분 기다립니다.다시, 진공 흡입에 의해 1 x PBS를 제거합니다. 프로피듐 요오드 리보누클로스 A 용액의 550 마이크로리터를 추가하고 샘플을 섭씨 37도 건조 목욕에 30분 간 배치합니다. 집게를 사용하여 폴리스티렌 라운드 하단 튜브의 상단 부분에 48 미크로네 여과 메쉬의 5cm x 5cm 조각을 배치하여 유동 세포계와 함께 사용하십시오.액체를 메쉬를 통해 튜브로 파이프를 입력하여 용액을 필터링합니다. 샘플은 이제 유동 사이토미터에서 실행할 준비가 되었습니다. 그들이 실행할 준비가 될 때까지 호일에 싸여 유지합니다.마지막으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 흐름 세포 측정 및 데이터 분석을 수행합니다. 부분 수다티디폼 두더지의 마이크로위성 지음, 환자와 그녀의 파트너의 DNA와 함께, 환자의 두더지는 삼중 분산되어 있음을 알 수 있습니다. 첫 번째 1 번째 마커는 개념작용의 제품에 있는 2개의 봉우리를 보여줍니다.첫 번째 피크는 어머니만이이 크기의 피크를 가지고 있기 때문에 어머니에서 유래합니다. 같은 추론에 따라, 두 번째 피크는 그가 같은 동계를 공유하기 때문에 아버지에서 유래. 두 번째 피크가 첫 번째 피크보다 훨씬 높은 방법을 주목, 그 피크에서 동일한 아버지 의 적 색의 아마 두 개의 복용량이 있음을 나타내는.모성 오염은 두 번째 모계 적색의 위치에 매우 작은 피크를 표시하기 때문에 개념작용의이 제품에서 매우 최소한의. 두 번째 마커는 개념작용의 제품에 있는 3개의 피크를 보여줍니다. 이 봉우리 중 두 개는 아버지에게서, 하나는 어머니에게서 유래했습니다.세 번째와 네 번째 마커는 첫 번째 마커와 유사하며 아버지로부터 오는 두 개의 악어와 어머니로부터 하나도 보여줍니다. 네 개의 마커는 모두 아버지로부터 유래한 3개의 악어, 2개는 어머니에게서 유래했기 때문에, 이 임신의 산물은 삼중 분산제이고 부분 두더지의 진단을 확인할 수 있습니다. 지노피 결과 해석을 위해 청소 단계에서 가져온 노트에 따라 오염 수준을 인식하는 것이 중요합니다.경우에 따라 이러한 두 가지 방법에 따라 결론에 도달할 수 없습니다. 이러한 경우, 우리는 진정한 유전자형을 밝히기 위해 FISH와 같은 다른 방법을 사용합니다. 마이크로위성 유전화는 정확한 어금니 진단을 허용하고 수다티디폼 두더지의 다양한 특징과 관련된 유전자형을 더 잘 이해할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 문서는 단일 셀 생선 blastomere 핵 확산에 대한 기술 및 현장 하이브 리다이 제이션과 임상 설정에서 미리 주입 유전자 진단 (PGD)에 적용되는 신호 골을에 적합한 프로브의 선택을 설명합니다.

사전 이식 유전자 진단 생선

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

저희는 미국 피카에 표시 효율적으로 어려운 작은 포유류에서 머리카락 샘플을 수집하는 비침 투 샘플링 방법을 제시한다. 우리는 샘플 머리카락에서 DNA를 추출하여 일반적으로 야생 동물의 생태와 보존 연구에 사용된 분자 마커의 여러 유형을 확장하여이 방법의 유틸리티를 보여줍니다.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

고해상도 용융 분석 (르마)와 함께 PCR은 제브라 피쉬의 유전자형에 신속하고 효율적인 방법으로 보여줍니다.

고해상도 용융 분석과 PCR을 이용하여 신속하고 효율적인 Zebrafish의 유전자형

우리는 유세포 측정을 필요로하지 않는 고정 / 저온 보존 조직 샘플 내에서 간세포 수와 핵 ploidy의 변화를 측정하기위한 강력하고 비용 효율적이며 유연한 방법을 제시합니다. 우리의 접근 방식은 간 손상과 질병의 진행을 추적하는 데 이상적인 간 세포학의 강력한 샘플 전체 서명을 제공합니다.

마우스에서 간세포 핵 Ploidy의 추정을 위한 situ 방법에서 높은 처리량

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

DNA 후광 제제와 형광 in situ 하이브리드화를 결합하면 뉴클레오스켈레톤과의 게놈 상호작용에 대한 고분해능 분석이 가능합니다. 부착된 게놈은 추출된 잔류 핵 내에 위치한 혼성화된 형광 신호를 유도하는 반면, 부착되지 않은 게놈은 잔류 핵을 둘러싸고 있는 DNA의 후광에 있습니다.

전체 염색체, 텔로미어 및 유전자좌를 밝히기 위한 DNA Halo Preparations의 형광 In Situ 혼성화

본 프로토콜은 단일 세포분석기로 인간 정자의 세포사멸, 미토콘드리아 막 전위 및 DNA 손상을 측정할 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.

인간 정자의 기능적 결함을 검출하기 위한 바이오마커의 유세포 분석

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

이 프로토콜은 쥐 FFPE 흑색종 조직의 DNA 바코드 기반 이미징을 위한 다중 면역형광 항체 패널을 설계하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 또한 쥐 흑색종 종양 면역 미세환경에 대한 공간 단백질체학 통찰력을 생성하기 위해 오픈 소스 도구를 사용하는 이미지 분석 파이프라인에 대해 설명합니다.

유전적으로 재프로그래밍된 쥐 흑색종의 FFPE 검체를 분석하기 위한 DNA 바코드 기반 다중 면역형광 이미징

배우세요 포르말린 고정 파라핀 매립된 태반 융모 조직에서 다중 마이크로위성 DNA 게노타이핑과 유동 세포분석 방법을. 모계 DNA 오염을 최소화하여 수태낭종 진단의 정확성을 높이는 이 프로토콜은 유전학 및 병리학 연구에 필수적입니다.

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