Name: 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 정적 자기 지향 방법으로 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하는 비용 효율적인 프로토콜입니다. 다양한 신경 세포 유형을 유지하며 신경 발달 장애 및 뇌 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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예일 줄기세포 코어(YSCC)와 예일암센터(YCC)에 도움을 주셔서 감사합니다. 그의 신경병리학 적 검토에 대한 김정박사에게 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 재생 의학 연구 기금에 의해 지원되었다, Dimes의 행진, NHLBI R01HL131793 (S.G.), 예일 암 센터와 예일 암 생물학 교육 프로그램 NCI CA193200 (E.B.) 조셉과 루실 매드리.

1. 줄기 세포 유지 보수
<ol><li>H9 hESCs를 성장 인자 감소 층의 지하 멤브레인 매트릭스(재료 표참조, 이제부터는 단순히 매트릭스라고 함)에 유지하십시오.<ol>
<li>6웰 플레이트 1개 또는 10cm 접시 1개를 코팅하려면 매트릭스 100 μL과 얼음으로 차가운 덜베코의 수정된 독수리 매체(DMEM)/F12 용지 5.9 mL를 결합합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 초과 매트릭스 /미디어가 흡입 된 후 세포를 통과하기 위해 다음 날에 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포를 매주 약 1:12 분할 비율로 7일마다 배양한다. 37°C, 저산소 인큐베이터(5%O2,5%CO2)에서mTESR-1 매포를 사용하여 세포를 유지한다. 매일 미디어를 새로 고칩니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 세포를 분화 제거.</li>
	<li>H9 세포는 오르가노이드를 생성하기 위하여 그(것)들을 이용하기 전에 4 6 일 통과되어야 합니다. 세포는 세포 군집의 대략 1:8 비율로 통과되어야 합니다. 이렇게하려면 DMEM F12 매체로 세포를 헹구고 중성 프로테아제 (예를 들어, 디스파제, 단순히 프로테아제라고 함)로 세포를 해리하고 DMEM / F-12로 헹구고 플레이트를 4 플레이트 (6-well 또는 10 cm)에서 20 % ~ 20 % 동안 30-60 세포 클러스터로 헹구습니다. 수확 2일 전에, 일반 인큐베이터(21%O2,5%CO2)로전환한다. 플레이트는 오르가노이드 형성을 시작할 때 ~ 80 % 의 합의에 도달해야합니다.</li>
</ol>2. 오르가노이드 문화를 위한 hESCs의 해리
<ol><li>프로테아제 스톡 솔루션(5 U/mL)을 알리쿼트합니다. 참고: 일반적으로 몇 개월 동안 사용하기 위해 -20 °C에서 1 mL aliquots를 동결합니다.</li>
	<li>6웰 또는 10cm hESC 플레이트마다 1mL의 스톡 솔루션과 5mL의 DMEM/F12를 추가하여 프로테아제 스톡 용액을 작업 농도로 희석합니다.</li>
	<li>세포 배양 배지를 흡인하고 제거한 다음 프로테아제 용액으로 hESCs를 덮습니다. 10-15 분 동안 또는 식민지의 가장자리가 반올림하고 매트릭스에서 분리하기 시작할 때까지 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>플레이트를 기울이고 프로테아제 용액을 흡인하고 DMEM/F12로 세포를 세 번 부드럽게 세척합니다. 10cm 플레이트를 사용할 때는 6웰 플레이트와 6mL를 사용할 때는 세척할 때마다 2 mL/well을 사용하십시오. 이 단계를 수행할 때 콜로니가 행렬에 연결되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>신선한 mTESR 용지 약 1.5 mL을 각 웰(또는 10cm 플레이트의 경우 5mL)에 다시 넣고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 씻어내도록 합니다.</li>
	<li>10mL 파이펫을 사용하여 플레이트 내에서 hESC를 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 부드럽게 흡인하고 분배합니다. 식민지 클러스터는 이 단계를 완료할 때 ~250-350 μm 크기의 사각형과 유사해야 합니다.</li>
</ol>3. 오르가노이드의 생성
<ol><li>기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)없이 30 mTESR 매질의 30 mTESR을 함유하는 단일 초저 부착 T75 플라스크내로 세포를 전달한다.</li>
	<li>다음 날, 플라스크(들)를 기울여 코너에 있는 라이브 셀풀을 구하십시오(첫날에는 5-10분이 걸릴 수 있지만 클러스터가 커질수록 더 빨라집니다). 참고: 이 단계 또는 후속 단계에서 플라스크 의 바닥에 부착 된 많은 수의 세포가있는 경우 세포를 새 플라스크로 옮니다. 처음 이틀 동안 죽은 세포의 높은 인구를 가지고 정상입니다. 용지 변경을 수행할 때는 가능한 한 많은 세포 파편을 제거해야 합니다.</li>
	<li>일단 세포가 정착되면, 살아있는 세포를 포함하는 매체의 대략 10 mL를 떠나는 매체 및 죽은 세포를 흡인합니다.</li>
	<li>낮은 bFGF 매체의 ~ 20 mL를 추가 (DMEM/F12 1 x N2로 보충, 1 x B27, 1 x L-글루타민, 1 x NEAA, 0.05% 소 혈 청 알부민 (BSA), 그리고 0.1 mM 모노티오 글리세롤 (MTG) 30 ng/mL bGF보충.</li>
	<li>2일째에 세포를 확인합니다. 대부분의 세포가 건강하고 밝게 보이면 아무 것도 할 필요가 없습니다. 그러나 세포의 3분의 1 이상이 어둡게 나타나면 20 ng/mL bFGF로 보충된 낮은 bFGF 매체의 ~20 mL로 미디어(3.2단계에서와 동일한 틸팅 기법을 사용)로 교체합니다.</li>
	<li>3일째에, 10 ng/mL bFGF로 보충된 20 mL의 낮은 bFGF 매체로(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 미디어의 절반을 교체한다.</li>
	<li>5일째에 배지의 절반을(3.2단계에서 틸팅 기술을 사용하여) 신경 유도 매체 20mL(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)로 교체합니다. 참고 : 다른 세포보다 훨씬 큰 세포 또는 오르가노이드의 큰 클러스터가있는 경우, 그들은 문화에서 제거해야합니다. 크기는 현미경의 밑에 외관에 의해 추정됩니다; 예를 들어, 레티클이 있는 접안 렌즈를 사용하십시오. 오르가노이드의 대다수는 유사하게 크기 (대략 100 ±20 μm)입니다. 우리는 다른 것 보다는 대략 2 x 더 작거나 더 큰 오르가노이드를 제거했습니다.</li>
	<li>격일로 중간 크기(~15mL)의 절반을 NIM으로 교체하십시오.</li>
	<li>배양 3주 후, 100x 페니실린/스트렙토마이신을 배지에 추가합니다(NIM: DMEM/F12, 1x N2 보충제, 0.1 mM MEM NEAA, 2 μg/mL 헤파린)을 원하는 경우 최종 농도에서 1x로 추가하십시오. 격일로 미디어를 새로 고칩니다. 참고 : 이 방식으로, 우리는 문화에서 최대 6 개월 동안 오르가노이드를 유지했습니다.</li>
</ol>4. RNA 추출 및 준비
<ol><li>10 mL 파이펫을 사용하여 플라스크에서 약 15 개의 오르가노이드 (크기에 따라 다름)를 부드럽게 추출하고 1.5 mL 튜브에 넣습니다.<ol>
<li>원심분리기(200 x g 1분)에 오르가노이드를 부드럽게 펠렛하고, 덜베코의 PBS(DPBS)를 3회 1회 헹구세요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, RNeasy 키트)을 사용하여 RNA를 추출합니다.</li>
	<li>260 및 280 nm에서 각 샘플의 광학 밀도 값을 측정합니다.</li>
	<li>검증된 시스템 또는 프로토콜(예를 들어, iScript cDNA 합성 키트)을 사용하여 cDNA를 준비한다.</li>
	<li>적어도 하나의 하우스키핑 유전자를 포함하여 미리 검증된 프라이머(표1)를사용하여 qRT-PCR을 수행한다.</li>
</ol>5. 면역 화학
<ol><li>고정<ol>
<li>4% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 준비하고 4°C에 놓습니다.</li>
		<li>멸균 면도기를 사용하여 멸균 전사 파이펫의 팁을 잘라냅니다.</li>
		<li>절단 전달 파이펫을 사용하여 오르가노이드를 부드럽게 추출하는데, 특히 커지면 쉽게 부서질 수 있으며, 추가 용지 또는 DPBS가 있는 6웰 플레이트에 넣습니다.</li>
		<li>플레이트를 기울이고 용지를 흡인하고 1x DPBS로 교체합니다. 1x DPBS로 세포를 2회 더 헹구다.</li>
		<li>DPBS를 4% PFA 용액으로 교체하고 4°C의 셰이커에 놓습니다. 참고 : 2 일 동안 (작은 오르가노이드의 경우) 7 일 (오르가노이드 >3 개월), 짧은 시간 (예 : 16-24 시간)도 가능할 수 있습니다.</li>
		<li>DPBS에서 30%, 20%, 10%의 자당 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>PFA에서 고정한 후, 10% 자당 용액으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.</li>
		<li>10% 자당을 20% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.</li>
		<li>20% 자당을 30% 자당으로 교체하고 24시간 동안 4°C의 셰이커에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동 단면<ol>
<li>드라이 아이스의 평평한 층을 준비하고 그 위에 라벨플라스틱 금형을 배치합니다.</li>
		<li>최적의 절삭 온도 매체 (OCT)의 얇은 층을 금형에 붓고 (몇 초 이내에) 경화하기 시작합니다.</li>
		<li>팁이 잘린 전사 파이펫을 사용하여 금형의 OCT 상단에 몇 개의 오르가노이드를 놓고 오르가노이드의 위치에 주의를 기울이십시오.</li>
		<li>곰팡이가 가득 차고 오르가노이드가 덮일 때까지 OCT에 천천히 추가하십시오. 10분 동안 완전히 굳어지게 하십시오. 참고: 10분 이상 동결하면 단면화에 여러 오르가노이드의 이상적인 상대적 배치를 보장하는 데 도움이 되지만, 에탄올 드라이 아이스 믹스 또는 액체 질소를 사용하여 더 빨리 동결할 수 있습니다.</li>
		<li>절단 시 쉽게 찾을 수 있도록 마커로 오르가노이드의 상대 위치를 표시합니다.</li>
		<li>금형을 가방이나 상자에 넣고 단면을 잘라낼 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.</li>
		<li>저온 극저온을 사용하여 10 μm 섹션을 슬라이스하고 조직을 표지된 양전하 슬라이드에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼룩<ol>
<li>차단 용액 (0.3 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 일반 당나귀 혈청)을 준비하십시오.</li>
		<li>소수성 pap 펜을 사용하여 조직의 둘레를 그립니다.</li>
		<li>슬라이드를 PBS로 3회 5분 동안 헹구십시오.</li>
		<li>PBS를 실온에서 1시간 동안 차단 용액으로 교체하십시오.</li>
		<li>차단 용액을 밤새 4 °C에서 항체 용액 (적절한 농도의 항체, 0.1 % 트리톤 X-100, PBS에서 4 % 정상 당나귀 혈청)으로 교체하십시오.</li>
		<li>다음 날, 슬라이드를 PBS로 3회 10분 동안 세척합니다.</li>
		<li>PBS를 실온에서 1시간 동안 항체 용액으로 희석된 적절한 이차 항체(적절한 농도)로 대체합니다.</li>
		<li>1x PBS로 매번 10분 동안 3회 헹구어 내보시기</li>
		<li>4', 6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI) 얼룩을 바르고 1x PBS로 10분동안 3회 헹구어주세요.</li>
		<li>부착은 장착 용액으로 슬라이드 전면에 입술을 덮고, 어둠 속에서 실온에서 건조시키고, 4 °C에서 어둠 속에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li>
<li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoth%2C+G+%22The+Long+Evolution+of+Brains+and+Minds%22">The Long Evolution of Brains and Minds</a>. , Springer Netherlands. (2013).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Human+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31(2009).</li>
<li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+brain+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cognitive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
<li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
<li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li>
</ol>

S.G.K.는 Dansar IT 및 Gene-in-Cell의 SAB 멤버입니다.

다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추가 기술은 세포에 기초에 더 많은 정보를 모으기 위하여 미래 연구 결과에서 이용될 것입니다. 이 시스템의 또 다른 한계는, 보다 최근의 연구들 중 일부에서 행해진 바와 같이 오르가노이드 내에 혈관구조가 통합되지 않는다는 것이다17,18,19. 그러나, 낮은 산소 환경에서 높은 산소 환경으로 hESCs를 전환하는 것은 더 밀접하게 개발 배아에서 호기성 전...

무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은비유사성1,2. 흥미롭게도, 마우스는 영장류뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.
Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs7,8에서비교적 유사한 경로를 따랐습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 분리된 인간 ESCs(hESCs)의 클러스터로 시작하며, 도금 단계9,10뿐만 아니라 외인성 성장 인자(11)를 첨가하기 전에 파스카 실험실의 뇌 오르가노이드 프로토콜의 초기 단계인 톰슨 및 장 실험실의 정액 작업의 초기 단계와 유사하게 시작한다. 지하막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)는 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜에 활용되어 왔으며 효과적인 스캐폴드8로나타났다. 그러나, 가장 일반적으로 사용되는 지하 막 매트릭스는 생산12동안 배치 가변성에 배치와 성장 인자의 알 수없는 수량과 공동 으로 공동 으로 합병증없이 오지 않는다. 또한 이러한 행렬은 이미징을 복잡하게 하고 오염 및 비용의 위험을 증가시킬 수 있습니다.
인간의 뇌 오르가노이드는 많은 질문에 대답하는 데 사용할 수 있지만, 염두에 두어야 할 특정 한계가 있습니다. 하나는, 배아 줄기 세포에서 시작, 오르가노이드는 더 밀접하게 노화 뇌보다 미성숙 한 뇌를 닮은 등 알츠하이머 병과 같은 노년기에 발생하는 질병에 대한 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 둘째, 우리의 프로토콜은 여러 뇌 영역에서 세포에 대한 치료 또는 질병의 효과를 연구하는 데 유용한 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌 발달의 마커를 발견했지만, 다른 프로토콜은 특정 뇌 영역에 집중하기 위해 따를 수 있다13,14. 마지막으로, 오르가노이드 모델의 또 다른 제한은 크기의 반면, 인간의 뇌의 평균 길이는 약 167 mm, 교반의 사용으로 만든 뇌 오르가노이드는 4mm8까지 성장하고이 프로토콜에 의해 형성 된 오르가노이드는 1-2mm로 10 주까지 증가합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 프로토콜은 인간의 뇌 조직 및 여러 세포 유형의 상호 작용을 연구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 염소 안티 토끼</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>BX43 microscope</td><td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI stain</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><<td>a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td><td></td></tr><tr><td>FluroSave</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>NeuroMab, Davis, CA</td><td>N206A/8</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td><td>Corning, Corning, NY</td>, <td>USA 356231</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESC WiCell</td><td>, Madison, WI, USA</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,</td><td>USA 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTESR 배지</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 NeuroPlex</td><td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td><<td>a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>전자 현미경 과학, Hatfield, PA</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 기계</td><td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>MilliporeSigma, Burlington,</td><td>MA AB5603</td><td></td></tr><tr><td>TMS-F microscope</td><td>Nikon, Melville, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>초저 부착성 T75 플라스크</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>3814</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.

그림 1은 프로토콜의 여러 단계에서 세포/오르가노이드가 어떻게 생겼는지 를 입증하기 위해 여러 시간 지점의 대표적인 브라이트필드 이미지를 보여줍니다. hESCs를 조직 배양 플레이트에서 제거하고, 작은 조각으로 나누어, 그들이 구체를 형성 하는 T75 초저 부착 플라스크에 배치. 세포는 이 클러스터의 중심에 있는 어둡고 죽어가는 세포 없이, 밝고 유사한 크기에서 보이는 것이 중요합니다. 세포는 점차 bFGF를 제거하였다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내 이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드는 시간이 지남에 따라 더 커지고 어두워지지만, 뇌 오르가노이드 발달과 확장 전반에 걸쳐 존재하는 신경 로제트 와 같은 구조 (검은 색 화살표)를 주의하는 것이 중요합니다. 로제트는 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경관의 특징을 포함하고, 상피 특성을 표시하고 정점루멘(15)을둘러싸고 있다.
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이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

인간의 뇌 오르가노이드는 쉽게 조작되고 인간 설정과 다중 세포 유형의 적절한 상호 작용을 통합하는 시스템에서 질병을 연구하는 중요한 도구입니다. 이 기술은 신경 발달 장애, 독성 모욕, 뇌암의 성장과 치료를 포함하여 뇌의 수많은 질병을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 광범위한 뉴런 세포 유형을 가진 매우 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하는 능력입니다.이는 대부분의 실험실에서 수행할 수 있는 매우 단순한 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 그리고 이들은 전문 성장 인자 또는 정의되지 않은 행렬의 영향없이 일시적인 적절한 방식으로 생산되어 매우 간단하고 비용 효율적인 시스템입니다. 시작하려면 100 마이크로리터의 매트릭스와 5.9 밀리리터의 얼음 차가운 덜벡코의 수정된 이글 매체 또는 F12 미디어를 15밀리리터 원추형 튜브에 결합합니다.멤브레인 매트릭스의 1 밀리리터로 6웰 플레이트에 각각 잘 코팅합니다. 접시를 파라핀 필름으로 감싸고 섭씨 4도에서 하룻밤을 보관하십시오. 다음 날, 각 우물에서 과잉 미디어를 흡인, F12와 우물을 헹구고, 잘 당 mTeSR1 미디어의 두 밀리리터의 총 볼륨에 H9 hESCS를 추가합니다.매주 세포를 배양합니다. 매일 2밀리리터의 mTeSR1 미디어를 공급하고 5%의 산소와 5%의 이산화탄소를 가진 섭씨 37도 저산소 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 분화 세포를 제거합니다.매일 미디어를 새로 고칩니다. 세포는 오르가노이드 생산을 위한 H9 세포를 활용하기 전에 4~6일 전에 통과되어야 한다. 세포를 통과하려면 DMEM F12 미디어로 헹구고 과도한 액체를 흡입하여 시작합니다.헹구고, 프로테아제용액을 추가하고 40분 동안 세포를 배양하여 식민지가 우물 내에 떠다닌다. 다음으로, DMEM F12를 사용하여 세포를 세 번 세척하고 필요한 경우 조각을 작게 만들기 위해 적정염을 만듭니다. 그런 다음 세포를 4개의 6웰 플레이트 위에 대략 1-8 비율로 분배하고 배양기안에 판을 놓고 매일 먹일 수 있습니다.4~6일 후에, 세포는 대략 80%의 합류에 도달합니다. 일반 인큐베이터로 전환합니다. 프로테아제스 스톡 솔루션을 hESCS의 각 6웰 플레이트당 DMEM 또는 F12 배지 5밀리리터에 스톡 솔루션 1밀리리터를 추가하여 작업 농도로 희석합니다.흡인 및 세포 배양 매체를 제거한 다음 프로테아제용액으로 hESCS를 덮는다. 플레이트를 인큐베이터에 10-15분 동안 또는 식민지 가장자리가 모이고 매트릭스와 분리되기 시작할 때까지 플레이트를 완전히 반올림합니다. 접시를 기울이고 프로테아제용액을 흡수한 다음, DMEM 또는 F12 2밀리리터로 셀을 세번 부드럽게 세척합니다.식민지가 행렬에 부착되어 있는지 확인합니다. 따라서 ES 세포의 조각이 적절한 크기이므로 적절한 시간 동안 분리되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그들이 너무 짧은 시간 동안 거기에 있다면, 그들을 플러시하고 분해하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.그리고 만약 그들이 너무 오래 거기에 있다면, 그들은 실제로 그냥 세척 단계 동안 벗어날 수 있습니다. 신선한 mTeSR 매체의 약 1~1.5 밀리리터를 각 웰에 다시 추가하고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 플러시합니다. 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 플레이트 내에서 hESCS를 흡입하고 분배합니다.이제 식민지 클러스터는 250 ~ 350 마이크로 미터 크기의 조각을 닮았다. bFGF 없이 mTeSR 매체의 30 밀리리터를 포함하는 단일 초저 부착 T75 플라스크로 세포를 전송합니다. 다음 날, 라이브 셀이 모서리에 풀수 있도록 플라스크를 기울입니다.플라스크 의 바닥에 부착 된 세포의 많은 수가있는 경우, 새로운 플라스크에 세포를 전송하는 10 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 처음 며칠 동안 죽은 세포의 높은 인구가 있을 것으로 예상. 일단 세포정착, 미디어에 대 한 떠나 미디어와 죽은 세포 떨어져 흡인 10 라이브 세포를 포함 하는 미디어의 밀리 리터와 추가 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리 리터 보충 30 bFGF의 밀리 리터 당 나노 그램.이틀 후 셀을 확인합니다. 세포의 대부분은 건강하고 밝은 봐야한다. 그러나, 세포의 3 분의 1 이상이 어두운 나타나는 경우, 플라스크를 기울이고 교체 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리리터와 미디어의 밀리리터 20 bFGF의 밀리리터로 보충 20 bFGF의 밀리리터 당 나노 그램.셋째 날에는 미디어의 절반을 제거하고 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램으로 보충된 hESC 미디어의 15밀리리터로 대체하십시오. 5일째에는 미디어의 절반을 신경 유도 매체 15밀리리터로 교체하십시오. 그 후, 격일로, 신경 유도 매체로 매체의 절반을 대체합니다.3주 간의 문화가 끝나면 100X 페니실린-스트렙토마이신을 1X의 최종 농도로 미디어에 추가하십시오. 격일로 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 이 프로토콜에서 형성 된 뇌 오르가노이드는 이러한 클러스터의 중심에 어두운 죽어가는 세포없이 크기가 밝고 유사하게 보였습니다.세포는 점차적으로 bFGF 떨어져 짜냈다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드가 시간이 지남에 따라 더 크고 이렇게 어두워졌지만 신경 장미와 같은 구조는 확장되어 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경 관의 특징을 포함합니다.세포 내의 유전자 발현을 보다 심층적인 면모로 보기 위해 qPCR 분석이 수행되었다. 글루타민트 수송기 VLGUT1은 2주 반만에 표현되었고, 5주 만에 증가했으며, 5개월간의 문화를 통해 일관되게 유지되었습니다. 전뇌 마커 Foxg1은 문화권에서 5주까지 낮은 수준으로 표현되었다.깊은 층 마커 Tbr1은 약 5 주 피크와 그 후 감소. 상층 마커 Satb2, 복부 마커 Eng1, 힌드뇌 척수 마커 Hoxb4, 그리고 올리고덴드로시테 마커 Olig2의 발현이 시간이 지남에 따라 모두 증가했습니다. 대조적으로, 줄기 세포 마커 Sox2는 시간이 지남에 따라 감소.신경교 마커 GFAP는 5 주에 정점에 있었고 그 이후에 상대적으로 일정하게 유지되었습니다. 초기 단계 오르가노이드에서 ES 세포를 취급할 때 항생제 없이 자라기 때문에 오염을 피하고 일정에 따라 먹이를 주는 것을 기억하십시오. 이 절차에 따라, 단백질 발현 및 국소화를 위한 유전자 발현 및 면역 형광을 위한 정량적 RT-PCR와 같은 기술을 사용하여 오르가노이드를 평가할 수 있다.이 기술을 사용하여, 우리는 저산소증 챔버에서 모델로 인간 신생아 저산소 상해의 양상을 완화하기 위해 작은 분자의 능력을 연구 할 수 있었다. 이러한 인간의 뇌 오르가노이드가 생체 내 마우스 실험과 유사하게 행동한다는 것은 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 유도 만능 줄기 세포에서 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 그것은 신경권이 어떻게 다른 세균층의 형성을 억제하는 신경외배엽층을 형성하는지 보여줍니다. 신경구는 3D 젤 매트릭스에 내장되어 신경 상피 새싹을 형성합니다. 오가노이드 배지로 배양하면 이러한 신경 상피 새싹은 특정 뇌 영역으로 분화되어 성숙한 뇌 오가노이드를 형성합니다.

인간 뇌 오가노이드를 생성하는 체외 방법

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 기술을 보여줍니다. hESC 집락의 부착 배양은 효소로 처리하여 분리하고 클러스터로 분해합니다. 이러한 클러스터는 현탁액으로 3차원 구체를 형성한 다음 뉴런과 신경교세포층이 있는 뇌 피질을 모방한 오가노이드로 분화하도록 유도됩니다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오가노이드를 생성하는 기술

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 전뇌형 오가노이드를 생성하는 과정을 간략하게 설명하며, 줄기 세포 응집체에서 뇌 피질을 모방하고 다양한 뉴런 유형으로 분화하는 복잡한 구조로 진행되는 과정을 보여줍니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 전뇌형 대뇌 오가노이드 생성

신경 상피 조직의 전례 없는 복잡성으로 인해 인간의 뇌 발달을 모델링하는 데 방해를 받았습니다. 여기에서는 인간 뇌 발달의 초기 사건을 묘사하고 체외에서 소두증을 모델링하기 위해 뇌 오가노이드의 강력한 생성 방법을 설명합니다.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.

체외에서 뇌 신경 노화를 모델링하기위한 피질 뇌 오가노이드의 강력하고 재현 가능한 생성

이 프로토콜에서는 마우스 및 인간 배아 줄기 세포 모두에서 심장 전구 세포의 유도가 설명됩니다. 이 프로토콜의 주요 전략은 배아 줄기 세포주에 조작된 형광 리포터를 사용하여 유세포 분석으로 심장 전구 세포를 풍부하게 하는 것입니다.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

구개 개발의 연구는 구개열, 엄청난 의료 부담을 부과하고 외관을 손상하는 지속 남길 수 있습니다 출생 결함의 발생에 의해 좌우된다. 우리는 여기서 구개 개발 및 융합에 관련된 다른 신호 경로를 연구하기 위해 사용될 수있다 배양 구개 선반 기술을 보여준다.

정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

배우세요 정적 자기 지향 방법으로 인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하는 비용 효율적인 프로토콜입니다. 다양한 신경 세포 유형을 유지하며 신경 발달 장애 및 뇌 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법

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