Name: 유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 단백질의 번역 후 수정 프로파일링 방법을. 렌티바이러스를 이용한 안정적 세포주 생성과 이중 태그 정제 기술로 질병 관련 변화를 식별하고 예후 및 진단 바이오마커를 발굴할 수 있습니다.

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이 작품은 HV와 MS에 라 리그 콘트레 르 암에 의해 지원되었다, 그리고 ARC (협회는 PS에 라 recherche sur 르 암을 부어) PS, INCa (연구소 국립 두 암) 및 JI에 암로 폴 PACA. IBISA (인프라 바이오로지 산테 에 아그로노미), 플레이트포메 테크놀로지 엑스-마르세유, 칸세로폴레 PACA, 프로방스-알프스 코트 다쥐르가 지원하는 마르세유 프로테오믹스(marseille-proteomique.univ-amu.fr)의 질량 분석 시설 레지옹, 파올리-카메테스 연구소, 레체르슈 앙 칸세로로지 드 마르세유.

1. 6His-Flag-Ubl을 발현하는 안정적인 세포주 생성
참고 : pCCL-6HF-Ubl, pVSVG 및 델타 도우미와 HEK-293T 세포의 공동 변환.
<ol><li>일 0: 종자 293T 세포는 6웰 플레이트에서 50-70% 합류를 다음날 얻었다.</li>
	<li>1일차: 50-70% 동시 세포를 pCCL-6HF-Ubl 또는 pCCL-GFP 1 μg, pVSVG 1 μg 및 델타 헬퍼 벡터 1 μg를 혼합하여 렌티바이러스 생산을 위한 트랜스펙션 시약 및 프로토콜을 사용한다. 6시간 의 형질전환 후, 환전될 세포에 해당하는 새로운 배지로 배지를 변경한다. 종자 세포는 다음날 10-20% 합류(형질전환개시일)을 얻기 위해 6웰 플레이트에서 트랜스듀렉될 수 있다.</li>
	<li>2일째: 24시간 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 회수하고 0.45 μm 필터를 사용하여 필터를 사용한다. 필요한 경우, 렌티바이러스의 두 번째 배치를 생산하기 위해이 시점에서 신선한 매체를 추가합니다. 렌티바이러스를 함유한 세포(10-20% 합류)를 시차할 세포의 배지를 대체한다. 참고: 렌티바이러스 배지는 전향 전 며칠 동안 +4°C에서 보관하거나 수개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>표준 인큐베이터 (37 °C, 5 %CO2)에서24 시간에서 72 시간 사이의 렌티 바이러스로 세포를 인큐베이션 한 다음 신선한 표준 인큐베이터에 대한 배지를 변경합니다. 가능하면, 반전형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하여 세포 발현률과 세포당 상대적 발현 수준인 형질전환의 효율을 평가합니다. 형광이 검출되지 않으면, 형질전환할 세포 유형에 따라 발현이 더 오래 걸릴 수 있기 때문에 추가로 2-3일을 기다린다.</li>
	<li>GFP 대조가 양성인 경우, 항기항체를 사용하여 면역형광 및 웨스턴 블롯에 의한 6HF-Ubl의 발현 조절을 충분히 수행할 때까지 모든 세포를 성장시다.</li>
</ol>2. 변형 된 단백질의 이중 정제
참고 : 버퍼 1 : 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na2HPO4/ NaH2PO4,pH 8.0, 0.5 % 트리톤 X-100. 버퍼 2 : 50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, 1 % Tween20, 5 % 글리세롤, pH 8.0. 버퍼 3: 100 mM NH4HCO3,pH 8.0.
<ol><li>세포 용해: 일단 준비되면, 실온(RT)에서 인산완충식염수(PBS)로 배양설을 적어도 한 번 씻고 세포 용해또는 액상N2에 플래시 동결을 진행하여 -80°C에 보관합니다. 용해의 경우 RT에서 15cm 접시당 2 mL의 버퍼 1을 추가하십시오.</li>
	<li>용해를 30초 동안 3회 초음파 처리하여 1분 동안 일시 정지합니다.</li>
	<li>15 분 동안 15,000 x g에서 초음파 처리 된 용해기를 원심 분리합니다.</li>
	<li>세포 스트레이너 (40 μm)를 사용하여 상구체를 새로운 튜브로 옮김.</li>
	<li>샘플의 농도를 결정하고 필요한 경우 동일한 양의 단백질과 동일한 부피를 얻기 위해 조정합니다. 50~100 mg(MiaPaCa-2 세포의 경우 직경 15cm의 10가지 요리)의 총 양의 단백질을 사용하십시오.</li>
	<li>Ni2+-NTA 구슬을 넣고 단백질 1 mg당 2 μL의 구슬을 사용하십시오.</li>
	<li>RT에서 2.5 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오.</li>
	<li>500 x g에서 5 분 동안 구슬을 펠렛하십시오.</li>
	<li>버퍼 1의 1 mL로 구슬을 세척하고 샘플을 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮은 다음 튜브를 얼음으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 합니다. 얼음 이나 4 °C에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>10 mM imidazole를 함유 한 얼음 차가운 버퍼 2 1 mL로 두 번 씻으하십시오.</li>
	<li>결합 된 단백질을 용출하려면 250 mM 이미다졸을 함유 한 완충액 2 600 μL을 추가하고 4 °C에서 2 시간 동안 회전하십시오.</li>
	<li>500 x g에서 원심분리하여 1분 동안 구슬을 펠렛.</li>
	<li>4°C에서 2.5시간 동안 30rpm에서 회전한 다음 완충2 500 μL로 2회 세척한 다음 버퍼 3의 500 μL로 2회 세척합니다.</li>
	<li>최종 용출의 경우, 0.1 μg/μL에서 플래그 펩타이드를 함유한 완충3의 100 μL을 추가하고 1.5시간 동안 4°C에서 회전합니다.</li>
	<li>500 x g의 원심분리기를 1분 간, 초자연자를 새로운 사전 냉각 된 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>SDS-PAGE에 10% (10 μL)를 적재하고 젤의 은 염색을 수행하여 정제 품질을 제어합니다. 정제가 양호해 보이는 경우 LC-MS/MS가 남긴 90%를 분석합니다.</li>
</ol>3. Ub/Ubls PTM의 프로파일을 생성하고 이들 PTM 간의 중요한 차이점을 식별하기 위한 질량 분석 데이터 처리
참고: MS 분석의 결과는 각 샘플에서 확인된 각 단백질에 대한 피크 면적 값(TOP 3 펩티드 영역10의평균)뿐만 아니라 총 펩티드 수를 포함한 많은 정보를 포함합니다. 이들 데이터는 펩티드 카운트 수 또는 피크 영역 값, 또는 둘 다를 사용하여 처리될 수 있다. 피크 영역을 사용하여 계산하려면 이러한 값은 일반적으로 106의 범위에 있으므로 아래와 동일한 수식을 적용하기 전에 이 순서로 분할해야 합니다. 두 가지 계수 방법론을 모두 사용하여 얻은 결과는 일반적으로 와 같이 강한 상관 관계를 보여야 합니다. 확인된 각 단백질에 대해 다음 포뮬러를 사용하십시오. 비처리 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> 된 유비퀴틴 샘플에서 v1 펩티드 값 (예를 들어, Ub - 약물) 젬시타빈 처리 된 유비퀴틴 샘플에서 v2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> 펩티드 값 (예를 들어, Ub + 약물) 비처리 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> 대조군 GFP 샘플에서 k1 펩티드 값(예를 들어, GFP - 약물) 젬시타빈 처리된 대조군 GFP 샘플에서 k2 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> 펩티드 값(예를 들어, GFP + 약물).
<ol><li>정규화: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴과 GFP에 대한 약물 처리 된 세포와 치료되지 않은 세포 사이의 값을 정상화하십시오. 정규화된 v = V 및 정규화된 k = K. V1=v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2=v2. (v1+ v2) / (2. v2) K1=k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2=k2. (k1+ k2) / (2. k2)</li>
	<li>배경 제거: 다음 수식을 사용하여 유비퀴틴 샘플의 값에서 대조군 샘플(GFP)의 값을 빼서 두 조건에서 확인된 각 단백질에 대한 특정 값(V'1 및 V'2)을 얻습니다. V'1=V1-K1 경우 V1-K1≥0; V'1=0 경우 V1-K1&lt;0 V'2=V2-K2 경우 V2-K2≥0; V'2 =0 인 경우 V2-K2&lt;0</li>
	<li>유비퀴틴의 변형(Var). 약물에 의해 유도된 PTM의 양성 및 음성 변화에 대한 점수(-100에서 +100 사이)를 얻으려면, 치료된 샘플과 미처리 된 샘플의 특정 값 간의 차이를 포함 하 여 모든 값의 합계로 나누어 다음 공식을 사용 하 여 제어 (또한 제어 GFP에서 확인 된 단백질을 처벌하기 위해), 100곱. Var = (V'2-V'1)//(V1+K1+V2+K2)*100; -100<var>-50(PTM의 억압) 이하 또는 50(PTM의 유도) 이하의 변화는 일반적으로 유의한 것으로 간주됩니다.</var></li>
	<li>신뢰 (Conf). 다음 수식을 사용하여 0에서 100% 사이의 신뢰도 값을 얻습니다. Conf = ((V1+V2)2/(1+V1+V2+K1+K2)2)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0의 경우 &lt;0 50을 초과하는 값은 일반적으로 확신하는 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>유도/억압 값의 더 좋은 분포를 얻고 변형 및 신뢰도 매개 변수를 모두 고려하려면 다음 <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> 공식을 사용하여 Var 및 Conf 값을 곱합니다. =SI(V2&gt;0;0;(((V2*C2)^2)//(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6)) 참고: 피크 면적 값은 일반적으로 펩타이드 계수보다 더 정확하기 때문에, 다음 의 Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus)와 같은 데이터의 이러한 종류의 해석에 전념하는 특정 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 사용 권장 사항.</li>
</ol>

<ol><li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification%3A+Nature%27s+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li>
<li>Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li>
<li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li>
<li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li>
<li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE%3A+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 주요 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 변형 된 단백질의 프로파일을 생성하는 강력하고 신뢰할 수있는 방법론을 개발했습니다. 실제로, 우리는 성공적으로 유비퀴틴에 의해 PTM의 프로파일을 생성하기 위해이 프로토콜을 적용하고, 또한 SUMO와 Nedd8에 의해, 및 치료와 관련된 변경을감지하기위해 7 , 특정 유전자의 과잉 발현 또는 녹다운에 대한 응답으로 (데이터는 다양한 화학요법 약물에 내성 표현형을 획득한 세포에서)
프로시저 중에 조작자가 주의해야 하는 중요한 단계는 거의 없습니다. 비드(Ni-NTA 또는 안티-플래그 결합)의 파이펫팅시, 점성 글리세롤 계 완충제에 현탁되기 때문에, 특히 반플래그 비드를 철저히 재중단하고, 팁을 증가시키기 위해 팁의 끝을 조금 절단하는 것이 중요하다. 또 다른 예방 조치는 구슬의 적층을 피하기 위해 천천히 파이펫하는 것입니다. 추가 중요한 단계는 imidazole를 가진 용출및 플래그 펩티드로 입니다...

여기에서 제안된 방법은 특정 조건 (처리, 분화 등)와 관련되었던 잠재적인 변경을 확인하기 위하여 배양한 포유류 세포에서 유비퀴틴 가족 구성원에 의해 중재된 PTM을 공부하기 위하여 전념합니다. PTM은 단백질의 기능 조절의 마지막 단계를 나타냅니다1. 실제로, 일단 번역 기계에 의해 생성된, 대부분의 경우 모든 단백질은 그들의 활동, 분자 상호 작용 및 세포내 위치1을조절하는 PTM의 다른 종류를 겪는다. PTM의 과다 중에는 단백질의 유비퀴틴 패밀리에 의해 매개되는 것들, 유비퀴틴 자체 및 모든 유비퀴틴-좋아하는 것들, 모든 세포내 또는 부분적으로 세포질 단백질을 조절할 수 있는 잠재력을 가지고있다 2. 그(것)들은 그들 자신 단백질이기 때문에, 그(것)들은 각각 특정 조절 기능과 관련되었던 다양한 topologies의 균질하고 이질적인 사슬을 형성하는, 서로 공액될 수 있습니다2. 이 복잡한 기계를 해독하고 이해하려면 도구가 필요합니다. 많은 접근법은 그들의 자신의 장점과 단점을 가지고, 전 세계적으로 개발되었다, 여기에서 우리는 배양 세포에 적합한 고성능 하나를 제안한다.
이 방법의 주요 장점은 정확성입니다. 실제로, 분리된 변형 된 단백질의 순도는 두 개의 태그 (6His 및 Flag)와 두 단계 절차의 조합 사용에 의해 매우 향상되므로 단일 태그 융합 Ub / Ubl3,4보다훨씬 더 선택적입니다. 6His 태그의 존재는 유비퀴틴 결합 도메인 또는 유비퀴틴 에 결합하는 다른 단백질을 함유하는 단백질의 공동 정제를 피함으로써 완전히 변성 조건에서 정제의 첫 번째 단계를 가능하게 한다. 이는 특정 항체5 또는 탠덤 유비퀴틴 결합 요소(TUBEs)6을사용하여 유비퀴틴화 된 프로테오옴의 친화도 정제에 기초한 여러 가지 다른 접근법에 의해 발생하는 기술적 문제이다. 중요한 것은, 이 기술은 모노와 다른 종류의 폴리쿼터시네이션이 모두 확인되었기 때문에, 다른 접근법의 경우일 수 있기 때문에, 특정 유형의 유비퀴틴화의 정제에 찬성하여 편향되지 않는다7. 따라서, 일단 발견되면, 유비퀴틴의 변경은 관련시킨 유비퀴틴의 정확한 종류를 확인하기 위하여 표준 생화확적인 접근에 의해 더 상세한 에서 공부되어야 할 것입니다.
마지막으로, 이 프로토콜의 또 다른 기술적 이점은 렌티바이러스를 사용하여 정상적인 세포 거동을 방해하지 않고 적절한 수준의 태그된 수정자의 발현을 통해 안정적이고 빠르게 세포주를 발현하는 것을 용이하게 생성합니다.
유비퀴틴화의 한 가지 중요한 역할은 프로테아소말 분해를 위한 단백질을 표적으로 하는 것이지만, 이제는 잠재적으로 대부분의 세포내 또는 부분적으로 세포내 단백질에 대한 많은 다른 조절 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다1. 이 기능의 수는 단백질 같이 많은 유비퀴틴의 존재에 의해 더 증강되고, 거의 모든 세포 기계장치를 통제하는 단백질의 가족을형성합니다 1. 그들의 변경은 세포 생물학에 과감한 영향을 미칠 수 있고 암9와같은 병리학적인 상황8을지도하거나 참여할 수 있습니다. 그러므로, 공구는 이 광대한 풍경을 탐구하고 새로운 치료 표적으로 봉사할 수 있는 병리학적인 상태와 관련되었던 변경을 확인하기 위하여 필요합니다.
이 프로토콜은 외인성 태그Ub/Ubl을 표현하기 위해 변환되어야 하기 때문에 배양되는 세포에 전념합니다. 일단 생성되면, 이러한 안정한 세포주는 2D 또는 3D 또는 이종이식에서 배양으로부터 Ubl 프로파일을 생성하는데 사용될 수 있으며, 따라서 PTM 프로파일을 연구하기 위해 적용될 수 있는 다양한 실험 모델의 지평을 확장할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>ANTI-FLAG M2 친화력 젤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220-5ML</td><td>은 모든 Flag 태그 단백질,</td></tr><tr><td>anti-Flag M2 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td>에 결합하여 ub/ubl Cell strainer 40 &micro<td>의 6His-Flag 태그 발현을 검출합니다</td></tr><tr><td>. m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>구아니딘 용해 세포에서 떠 다니는 펠릿 제거</td></tr><tr><td>플래그 펩타이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3290</td><td>항 플래그 비드에서 태그 된 단백질</td></tr><tr><td>구아니딘 하이드로 클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td>세포 용해물의 모든 단백질을 변성시키는 데 사용되는 카오스트로픽 에이전트</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td>은 <td>Ni-NTA 비드에서 6His 결합 단백질을 용출합니다.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td><td>HEK-293T 세포를 transfection하여 렌티바이러스</td></tr><tr><td>Lobind 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666491</td><td>귀중한 물질의 흡수를 피합니다</td></tr>. 멤브레인 <tr><td>필터, 0.45 &마이크로; m</td><td>Millipore</td>는 <td>6His 태그의 렌티바이러스 상급제</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>정제</td></tr>를 필터링하는 데 HAWP04700F1했습니다.</tbody></table>

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

유비퀴틴(ub) 및 유비퀴틴과 같은 (유블) 단백질의 의존적인 번역 후 변형은 단백질 안정성, 활동, 상호 작용 및 세포내 국소화를 조절함으로써 세포 내에서 근본적인 생물학적 조절 역할을 합니다. 그들은 세포가 신호에 응답하고 환경의 변화에 적응할 수 있게 합니다. 이 기계장치 내의 변경은 신경 퇴행성 질병 및 암과 같은 가혹한 병리상황으로 이끌어 낼 수 있습니다. 여기에 설명된 기술의 목적은 배양된 세포주로부터 ub/ubls 종속 PTM 프로파일을 신속하고 정확하게 확립하는 것입니다. 상이한 조건에서 수득된 상이한 프로파일의 비교는 예를 들어 치료에 의해 유도된 것과 같은 특정 변경의 식별을 허용한다. 렌티바이러스 매개 세포 트랜스덕션은 수식어(SUMO1 또는 Nedd8와 같은 유비퀴틴 또는 유블)의 2태그(6His 및 Flag) 버전을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하기 위해 수행된다. 이 꼬리표는 세포에서 유비퀴틴 및 그러므로 유비퀴틴 단백질의 정제를 허용합니다. 이것은 2 단계 정제 과정을 통해 수행됩니다 : 첫 번째는 6His 태그를 사용하여 변성 조건에서 수행되고 두 번째는 플래그 태그를 사용하여 기본 조건에서 수행됩니다. 이것은 이후에 확인되고 액체 크로마토그래피에 의해 반정화되고 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS) 기술에 선행되는 수정된 단백질의 고도로 특이하고 순수한 격리로 이끌어 냅니다. Excel 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터의 쉬운 정보학 분석을 통해 배경 신호를 제거하여 PTM 프로파일을 구축 할 수 있습니다. 이 단면도는 표준 생화학 기술에 의하여 그들의 검증으로 시작하여 그 때 더 구체적으로 공부될 특정 변경을 확인하기 위하여 각 조건 사이 비교됩니다.

GFP 및 6HF-Ub 발현 세포를 생성하기 위해 배양 포유류 세포의 전이 나중에 MiaPaCa-2 세포를 변환하는 데 사용될 렌티바이러스를 생산하기 위해, 70% 콘립쿠스 HEK-293T 세포는 pCCL-6HF-유비퀴틴 또는 GFP/델타-도우미/pvSvG의 동일한 양으로 병입된다. 생산의 24 시간 후에, 렌티 바이러스 입자를 포함하는 배지는 회수되고 여과된다. 이 시점에서 반전된 현미경상에서 293T 세포를 발현하는 GFP의 녹색 형광을 확인함으로써 형질감염의 효율을 조절할 수 있다. 그것은 세포의 100 %에 가깝습니다. MiaPaCa-2 세포는 렌티바이러스 상류로 1-3일 동안 배양됩니다. 렌티바이러스 형질전환의 효능은 먼저 GFP 형질전환 세포의 GFP 형광을 보고 조절된다(도1A 상부 패널). GFP 발현 수준은 한 세포에서 다른 세포로 다양...

이 프로토콜은 치료 또는 표현형과 같은 특정 조건과 관련된 이러한 종류의 번역 후 수정 (PTM)의 변경을 식별하기 위해 유비퀴틴 (Ub) 및 유비퀴틴 -좋아요 (Ubls) 특정 프로테오옴을 확립하는 것을 목표로합니다.

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

이 프로토콜은 유비퀴틴과 유비퀴틴과 같은 번역 후 수정의 프로파일을 생성하고 특정 식별된 특정 단백질을 식별하고 반정화하여 쉽게 생성할 수 있는 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 1 주일 이내에 안정적인 발현주를 만들기 위해 렌티 바이러스를 사용하고, 특히 단백질을 정화하기 위해 두 개의 태그를 사용하는 것입니다. 사실, 번역 후 수정의 이 종류는 대부분의 생물학 기능에 관련되고, 이 기계장치의 변경은 대부분의 질병에서 찾아낸다.따라서 이러한 변경 사항을 식별하는 것은 예후 및/또는 진단과 분자 표적으로서의 역할을 할 수 있습니다. 유비퀴틴은 진핵 세포에서 가장 보존된 단백질 중 하나이며 생존에 필수적입니다. 따라서 이러한 종류의 방법은 포유류에서 효모에 이르기까지 모든 진핵 모델에 적용될 수 있습니다.그러나, 우리의 렌즈 바이러스 시스템은 세포의 연구에 국한됩니다. 전체 절차는 때때로 긴 잠복기와 함께 매우 길기 때문에, 대신 2 일 동안 그것을 할 수 있습니다. 니켈 구슬의 용루는 영하 20에서 플래그 구슬을 추가하기 전에 동결 될 수 있습니다.이 프로토콜에는 정화의 최종 성공을 보장하기 위해 중요한 단계가 많이 포함되어 있으므로 번역 후 수정 프로파일의 정확한 확립이 포함됩니다. 절차의 시연은 미르나 스웨이덴과 아우렐리 도브릭, 실험실의 두 박사 과정 학생에 의해 수행됩니다. 우선, HEK 293T 세포의 6분의 1에 0.5배 10배, DMEM의 웰당 2밀리리터를 10%의 FBS로 넣고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 100%로 배양합니다.다음 날, 50~70%의 합류가 달성됩니다. pCCL-6HF 유비퀴틴 유사 또는 pCCL-GFP의 1마이크로그램, PBS VG의 1마이크로그램, 그리고 렌티바이러스 생산을 위한 트랜스페션 시약 및 프로토콜을 사용하여 델타 도우미 벡터의 마이크로그램 1개를 혼합하여 세포를 코트랜스펙트. 6시간의 트랜스펙트 후, 배지를 세포의 배지에 대응하는 새로운 것으로 변경하여 유도한다.다음날 10~20%의 결합을 얻기 위해 표준 배양 배지를 사용하여 6웰 플레이트에서 변환되는 세포를 시드한다. 24 시간 트랜스펙트 후, 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 회수하고 0.45 미크론 필터를 사용하여 필터를 한다. 렌티바이러스를 함유하는 여과된 배지에 의해 변형되는 세포의 배지를 교체한다.37섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 인큐베이터에서 24~72시간 동안 렌즈티바이러스로 세포를 배양한 다음, 신선한 표준으로 배지를 변경합니다. 반전된 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 확인하여 트랜스듀션의 효율성을 평가합니다. 형광이 발견되지 않으면 2 ~3 일 더 기다립니다.GFP 대조군이 녹색 형광으로 양성인 경우, 면역형광에 의한 6-His-FLAG 유비퀴틴의 발현 제어를 수행하기에 충분한 때까지 모든 세포를 성장시키고, 여기에 도시된 바와 같이, 및 항플래그 항체를 이용한 서부 블롯. 15센티미터 의 접시에서 세포를 성장 한 후, 실온에서 인산염 완충 식염수로 적어도 한 번 배양 접시를 씻으라. 세포 용해를 시작하려면 실온에서 각 15센티미터 접시에 버퍼 2 밀리리터를 추가합니다.셀 스크레이퍼를 사용하여 모든 용재를 50밀리리터 원심 분리 튜브로 복구합니다. 30초 동안 3회 를 세 번 초음파 처리하여 1분 간 일시 정지합니다. 15분 동안 15, 000배 g의 초음파 용해를 원심분리합니다.40 미크로른 세포 여과기를 통해 새로운 튜브로 상수체를 전송합니다. 초음파 처리 및 원심 분리 후 용재를 필터링하는 것이 매우 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 많은 비특이적 단백질의 화정화가 발생할 수 있으며, 이로 인해 배경이 증가하고 PTM 프로파일의 크기를 강하게 감소시킬 수 있다.새로운 팔콘 튜브에 50에서 100 밀리그램 사이의 동일한 양의 단백질을 전달합니다. 니켈 이온 NTA 구슬을 각 튜브에 넣고 1밀리그램당 2개의 마이크로리터의 비드를 넣습니다. 회전기에 튜브를 놓고 실온에서 2 1/2 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오.그런 다음 5 분 동안 500 배 g에서 구슬을 펠렛합니다. 구슬을 완충 1밀리리터로 씻고 샘플을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮겨냅니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.10 밀리머 이미다졸을 함유한 얼음 차가운 버퍼 2개로 두 번 씻으시다. 엘루트 바운드 단백질에 250 밀리알라 이미다졸을 함유한 완충 제2의 600 마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전합니다. 1분 동안 500회 g에서 원심분리로 구슬을 펠트렛한 후, 상체를 1.5밀리리터 튜브로 옮기고, 안티 플래그 M2 항체-컨쥬게이트 구슬 50마이크로리터를 첨가한다.섭씨 4도에서 2 1/2 시간 동안 30 rpm에서 회전하십시오. 그런 다음 버퍼 2의 500 마이크로 리터로 두 번 세척 한 다음 버퍼 3의 500 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 최종 용출의 경우, 마이크로리터 당 0.01 마이크로그램의 FLAG 펩티드를 함유한 완충제 3개 100마이크로리터를 추가하고 섭씨 4도에서 1 1/2시간 동안 회전합니다.원심분리 후 1분 동안 500회 g에서 상주체를 새로운 미리 냉각된 튜브로 옮긴다. SDS-PAGE에 10 마이크로리터를 싣고 젤의 은색 염색을 수행하여 정제 품질을 제어합니다. 정제가 좋아 보이면 LC-MS가 남긴 90%를 분석합니다.정규화를 수행하려면 수식을 사용하여 유비퀴틴과 GFP를 위해 약물 처리 된 세포와 치료되지 않은 세포 사이의 값을 정상화하십시오. 배경을 제거하려면, 유비퀴틴 샘플의 값에서 제어 샘플 GFP의 값을 빼서 두 조건에서 확인된 각 단백질에 대한 특정 값을 얻습니다. 유비퀴티뉴션의 변이를 얻으려면 약물에 의해 유도된 PTM의 양성 및 음극에 대해 마이너스 100과 100 사이의 점수를 얻습니다.처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플의 특정 값 간의 차이는 컨트롤에 있는 값을 포함한 모든 값의 합으로 나누고 100을 곱합니다. PTM의 억압을 나타내는 마이너스 50 이하의 변형또는 PTM의 유도를 나타내는 50 이상은 중요한 것으로 간주됩니다. 이 수식을 사용하여 50이상의 0과 100% 값 사이의 신뢰값을 얻으려면 일반적으로 자신감을 가질 수 있는 것으로 간주됩니다.유도 및 억압 값의 더 좋은 분포를 얻고 변형 및 신뢰 도면 변수를 모두 고려하려면 이 수식을 사용하여 분산 및 신뢰 값을 곱합니다. 이 연구에서는, 배양 포유류 세포의 변환은 GFP와 6-히스티딘 플래그 유비퀴틴 발현 세포를 만들기 위해 달성되었다. 렌티바이러스 트랜스듀션의 효능은 GFP-트랜스듀싱 된 세포의 GFP 형광을 보고 처음으로 제어되었다.FLAG-유비퀴틴의 발현은 항 플래그 항체를 사용하여 염색된 면역 형광에 의해 수행되었으며, 이는 트랜스듀싱 된 세포의 비율을 보여줍니다. 외인성 FLAG-유비퀴틴의 발현 수준을 제어하기 위해, 변환된 세포로부터의 용액은 SDS-PAGE에 의해 분석되었고, 그 다음으로 안티 플래그 항체를 가진 서양 블롯이 뒤따랐다. 유비쿼터티드 단백질의 정제 후, 최종 용출의 10%는 SDS-PAGE 및 겔의 은 염색에 의한 정제 물질의 양과 무결성을 제어하는 데 사용되었습니다.배경 GFP 샘플 뺄셈은 이러한 유비쿼터트 단백질의 50%A 유전자 세트 농축 분석 이상의 점수로 현저하게 유비쿼터처리된 364개의 단백질을 확인하여 그들이 참여한 생물학적 과정을 강조하기 위해 수행되었다. gemcitabine 유도 된 유비쿼터신화의 변경에 의해 형성 된 잠재적 상호 작용 네트워크. 이것은 관련 단백질의 증가 또는 감소 유비쿼터신화에 의해 강하게 영향을 받는 기능적인 상호 작용 네트워크의 식별으로 이끌어 냈습니다.또한 gemcitabine 치료 후 PCNA의 유비퀴티니션이 증가한 것으로 확인되었습니다. 배경이 크게 증가할 수 있기 때문에 두 개의 용출 단계 후에 일부 구슬이 전송되는 것을 피하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차는 다른 조건을 비교하여 특정 변경 사항을 식별할 수 있는 특정 번역 후 수정을 생성합니다.첫 번째 다음 단계는 생화학적 접근에 기초하여 적어도 관심의 변경을 검증할 것입니다. 우리는 췌장암세포의 새로운 방법 그리고 기계장치를 확인하기 위하여 유비퀴틴 기지를 둔, 번역 후 수정을 탐구하기 위하여 이 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜 및 그밖 개발된 세계적인 때문에 다른 생물학 프로세스를 해독하기 위하여 성공적으로 채택되었습니다.렌즈 바이러스는 BL-2 실험실에서 적어도 사용되어야합니다. Guanidine은 강력한 데스팅 에이전트이며 신중하게 사용해야합니다. 초음파 처리기는 귀에 해로울 수 있으며 다음 권장 사항을 사용해야 합니다.

profiling-ubiquitin-ubiquitin-like-dependent-post-translational

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Ubiquitination 세 효소의 집합으로 실시하는 핵심 posttranslational 수정합니다. 이 수정에 관여 유전자의 돌연변이가 여러 가지 인간의 질병와 관련된 있습니다. 여기, 우리는 교양 세포에 단백질 ubiquitination을 감지 프로토콜...

단백질 Ubiquitination의 감지

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

유비퀴틴화는 세포 과정에서 중요한 역할을 하는 번역 후 수정이며, 듀비퀴틴화에 의해 긴밀하게 조정됩니다. 두 반응의 결함은 인간의 병리를 뒷받침합니다. 우리는 정제 된 구성 요소를 사용하여 시험관 내에서 유비퀴틴화 및 듀비퀴틴화 반응을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

이 방법은 유비퀴틴 체인 토폴로지의 글로벌 변화에 대한 평가를 설명합니다. 평가는 질량 분광계 기지를 둔 표적 proteomics 접근의 응용에 의해 수행됩니다.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.

포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

여기에 사용된 실험은 중국 전통 의학의 소분자와 단백질 표적 간의 상호 작용을 예측하고 검증하기 위해 프로브 기술과 결합된 분자 도킹 방법을 보여줍니다.

분자 도킹 및 탈유비퀴틴 효소 프로브 기술을 기반으로 UCHL3 활성을 억제하기 위한 전통 한의학 화합물 스크리닝

유비퀴틴화는 세포 내 단백질 기능의 중요한 조절자입니다. 여기서는 포유류 세포에서 기질 단백질 유비퀴틴화 수준을 검출하는 두 가지 세포 용해 방법을 설명하고, 유비퀴틴화 수준 분석에 미치는 효과를 비교합니다. HEK293T 세포 내 단백질 과발현은 일시적 형질전환에 의해 유도되었고, 유비퀴틴화된 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출되었습니다.

SMAD2/SMURF2를 모델로 삼은 포유류 세포 용해체에서의 유비퀴틴화 검출 비교 전략

배우세요 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 단백질의 번역 후 수정 프로파일링 방법을. 렌티바이러스를 이용한 안정적 세포주 생성과 이중 태그 정제 기술로 질병 관련 변화를 식별하고 예후 및 진단 바이오마커를 발굴할 수 있습니다.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

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