Name: 분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 학습하세요 C. elegans 배아 블라스타미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 이용한 세포 접촉 패턴의 체외 재구성 방법. 이 기술은 세포 외 신호에 대한 세포 반응을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 조언과 C. elegans 균주, 돈 모어만, 코타 미즈모토, 생명 과학 연구소 이미징 코어 시설 공유 장비 및 시약, 아오이 히로야수, 리사 페르난도, 김민지 의 유지 보수에 대한 우리의 원고의 유지 보수에 대한 조언과 제공 에 대한 제임스 프리스와 브루스 Bowerman 감사합니다. 우리의 작업은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원됩니다 (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. 접착제 폴리스티렌 비드의 준비
참고:이 프로토콜은 무균 기술이 필요하지 않습니다.
<ol><li>1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 카르복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬 10 mg의 무게.</li>
	<li>구슬을 세척하려면 튜브에 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산(MES) 완충제 1mL를 추가합니다. MES 완충제는 인산염 및 아세테이트를 포함하지 않기 때문에, 이는 탄수화물의 반응성을 감소시킬 수 있고, 단백질 커플링 반응에 사용하기에 적합하다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.</li>
	<li>벤치탑 원심분리기를 통해 2,000 x g에서 60초동안 튜브를 회전시다.</li>
	<li>버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>1.2-1.4 단계 다음 단계로 MES 버퍼의 1 mL로 구슬을 다시 씻으십시오.</li>
	<li>표면 카르복실 기를 활성화하기 위해 튜브에 EDAC 10 mg을 포함하는 MES 버퍼 1 mL을 추가하십시오. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.</li>
	<li>실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다.</li>
	<li>2,000 x g에서60 s에 대한 구슬을 아래로 회전 .</li>
	<li>버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>구슬을 세척하려면 튜브에 인산 완충 식염수 (PBS) 1 mL을 추가합니다. 튜브를 소용돌이로 혼합하여 구슬을 혼합한다.</li>
	<li>2,000 x g에서60 s에 대 한 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>버퍼를 조심스럽게 파이펫팅하여 상급을 폐기하십시오.</li>
	<li>1.10-1.12 단계 다음 단계로 PBS의 1 mL로 구슬을 다시 씻습니다.</li>
	<li>사용되는 로다민의 최종 농도는 이미지화되는 변형에 따라 달라집니다. 0.65 mM 로다민 Red-X 재고 용액에서 로다민 레드-X의 1mL, 10-100배 및 1000배 희석 시리즈를 준비합니다.</li>
	<li>각 직렬 희석 튜브에 비펫 20 μL의 비펫.</li>
	<li>실온에서 튜브를 5분 동안 회전하고 배양합니다.</li>
	<li>1.10-1.12 단계를 반복하여 PBS의 1 mL로 구슬을 두 번 씻습니다.</li>
	<li>튜브에 1 mL의 PBS를 넣고 최대 6 주 동안 4 °C에 보관하십시오. 살아있는 화상 진찰을 위해 이용된 현미경의 밑에 구슬의 형광 강렬을 검사하십시오. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 적절한 농도는 이미징 조건에 의존한다(도1). 참고 : 로다민 적색 X 처리가없는 구슬은 세포에 부착되지 않습니다. 로다민 레드-X는 형광 마커뿐만 아니라 접착제 분자의 역할을 한다. 양전하로다민 적색-X와 음전하 플라즈마 멤브레인 사이의 정전기 상호 작용은 접착의 원인이다.</li>
</ol>2. 입 피펫의 조립
<ol><li>폭(내경 6.35mm)과 좁은(내경 3.175mm) 타이곤 튜브를 각각 약 25cm 및 40cm 길이로 자른다(그림2).</li>
	<li>타이곤 튜브를 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 필터(0.2 μm 모공 크기)와 연결합니다(그림2).</li>
	<li>시판되는 흡입기 튜브를 분해하고 좁고 넓은 타이곤 튜브의 끝에 모세관 홀더와 마우스피스를 각각 부착합니다(그림2). 참고 : PTFE 필터는 입 파이펫을 통해 하이포 염액 용액의 연기 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.</li>
</ol>3. 배아 블라스포미어의 분리
참고: 표백 용액과의 절단 및 접촉을 피하기 위해 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.
<ol><li>마이크로 모세관의 각 끝(용량; 10 μL)을 오른손과 왼손으로 잡습니다.</li>
	<li>미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관의 중심을 버너 위에 가져와 손으로 당긴 두 개의 모세 혈관을 만듭니다(그림 3A).</li>
	<li>해부 현미경 아래 집게로 손으로 뽑은 모세 혈관의 끝을 다듬고 당겨진 모세관을 입 파이펫팅 장치에 부착합니다(그림2). 두 가지 유형의 파이펫을 준비합니다. 파이펫에 대한 팁 개방 크기는 배아 전달 및 난자 제거를 위한 C. elegans 배아(30 μm)의 짧은 축 길이의 약 2배 및 1배이어야 하며, 각각 도 3B-D).</li>
	<li>파이펫 45 μL의 달걀 소금 용액을 멀티웰 슬라이드의 우물 상에(그림4A;하단)에.</li>
	<li>5-10명의 성인 C. 예쁜꼬마선충을 달걀 소금 용액이 들어있는 우물 위에 놓습니다.</li>
	<li>초기 C. 예쁜꼬마선충 배아를 얻으려면, C. 예쁜꼬마선충의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 지나서 슬라이딩하여 성인을 조각으로 잘라냅니다(그림 4A;상부 회로도).</li>
	<li>피펫 45 μL의 하이포아염소산염 용액을 잘 함유된 계란 염액 옆에 있는 우물위에(그림 4B).</li>
	<li>쉘튼의 성장 배지의 피펫 45 μL을 하모염염 액을 함유하는 웰 옆에 있는 3개의 웰 에 상구한다(도4B).</li>
	<li>배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅에 의해 1 세포 단계 및 초기 2 세포 단계 배아를 하이포아염소산염 용액으로 옮김(도4B)으로옮김을 옮김을 전달한다.</li>
	<li>40-55s 기다립니다.</li>
	<li>배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 하이포아염소산염 용액에서 배아를 쉘튼의 성장 배지로 옮겨 배아를 세척한다(그림4B).</li>
	<li>배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 파이펫팅을 하여 배아를 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮겨 다시 세척한다(그림4B).</li>
	<li>씻은 배아를 배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관으로 입 피펫팅하여 쉘튼의 성장 배지의 새로운 우물로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮니다. 손으로 그린 모세관을 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 조심스럽게 파이펫팅을 반복합니다(그림 4C; 중간 회로도). 난자 껍질이 성공적으로 제거되면 배아 세포가 더 구형이 됩니다(그림 4C; 오른쪽).</li>
	<li>2 세포 단계 배아 블래스타미어를 달걀 껍질 제거를 위해 손으로 그린 모세관으로 부드럽고 지속적으로 파이펫팅하여 분리합니다(그림4D).</li>
</ol>4. 블라스포미어와 구단으로 접촉 패턴 의 재구성
참고 : 비드에서 세포의 해리를 방지하고 적시에 이미지 수집을 용이하게하기 위해 이미징 현미경에서 작동합니다.
<ol><li>반전된 현미경을 사용하여 관찰하려면 그림 5에서와같이 이미징 챔버를 준비합니다.<ol>
<li>커버슬립 홀더에 커버슬립을 놓습니다(그림5A).</li>
		<li>커버슬립의 가장자리를 테이프로 테이프로 하여 안정화합니다. 테이프가 있는 쪽은 '뒷면' 면입니다(그림5A, B).</li>
		<li>커버슬립 홀더를 '앞면' 쪽으로 뒤집고 소수성 펜으로 커버슬립에 원을그립니다(그림5C). 참고 : 배아가 입 피펫에 의해 조작 할 수 있다면 모든 유리 바닥 요리도 작동합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소수성 마커에 의해 그려진 원 내에 셸튼의 성장 배지를 추가합니다(그림5D).</li>
	<li>분리된 블래스토미어를 이미징 챔버로 옮김.</li>
	<li>배아 이식을 위해 손으로 그린 모세관을 사용하여 화학적으로 기능화된 비드의 소량을 분배합니다.</li>
	<li>비드가 분리된 블래스토미어에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관에 불어 폴리스티렌 비드의 위치를 제어합니다.</li>
	<li>매체의 증발을 방지하기 위해 커버 슬립을 장착합니다(그림 5E). 라이브 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>5. 중요한 시약의 준비
<ol><li>계란 소금 용액 (10 mL): 235 μL 의 5 M NaCl 및 2M KCl의 240 μL과 9525 μL의 dH2O를 결합합니다.</li>
	<li>하이포아염소산염 용액 (10 mL): 클로록스 7.5 mL (약 7.5 % 하이포 염화 나트륨 함유)와 10 N NaOH 2.5 mL (하이포 아염소산 나트륨의 최종 농도는 약 5.625 %)를 결합합니다. 참고 : 많은 출판 된 방법이 치틴 계란 껍질을 소화하기 위해 치티 나아제 (chitinase)를 사용했지만, 우리는 hypochlorite 용액11을사용하는 방법을 채택했습니다. 치티나제 활동의 배치 대 배치 변형을 피함으로써, 우리는이 방법이 더 재현 가능하고 비용 효율적인 접근 방식이라고 생각합니다.</li>
	<li>0.81 mM 이눌린 용액 (40 mL)<ol>
<li>dH2O 의 40 mL에 이눌린 0.2 g을 추가하십시오.</li>
		<li>용해할 오토클레이브. 참고: 4°C에서 1개월 동안 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 M MES 버퍼(500mL)<ol>
<li>400 mL의 증류수(dH2O)에MES 48.81 g을 용해시.</li>
		<li>pH를 6.0으로 조정합니다.</li>
		<li>dH2O로 총 볼륨을 500 mL로 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS 솔루션(1L)<ol>
<li>10배 PBS 용액을 만들려면, 10-dH2O의 1L에 PBS 프리믹스 파우더 1패키지를 용해시고.</li>
		<li>10배 PBS 솔루션 100mL와 900mL의 dH2O를 결합합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5% 폴리비닐피롤리돈(PVP) 용액(4mL)<ol>
<li>멸균 조건하에서, 초파리 슈나이더 의 배지 4 mL에 0.2 g의 PVP를 용해시다. 참고 : 항상 조직 배양 (TC) 후드에 슈나이더의 중간 주식을 엽니 다. 4 °C에서 1 개월 동안 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.65 mM 로다민 레드-X 재고 솔루션 (2 mL)<ol>
<li>무게 1 로다민 레드-X의 mg.</li>
		<li>용해시키기 위해 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2 mL를 첨가합니다.</li>
		<li>알리쿼트 및 -20 °C에서 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셸튼의 성장 매체 (SGM) (10.25 mL)<ol>
<li>멸균 조건하에서, 드로소필라 슈나이더 배지 8mL, PVP 용액 1 mL, 이눌린 용액 1mL, 기저 미디엄 이글(BME) 비타민 1mL, 페니실린-스트렙토마이신 50 μL, 100 μL의 지질 농축액을 함께 결합합니다.</li>
		<li>1.5 mL 마이크로튜브로 SGM의 325 μL. 참고: 4 °C에서 약 1개월 동안 보관하십시오.</li>
		<li>블라스토미어 분리의 날에, SGM에 175 μL의 태아 소 혈청 (FBS)을 추가하십시오 (총 부피 500 μL). 참고: FBS를 -20°C에 보관하고 사용 전에 해동하십시오. FBS는 열을 죽일 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

단순화된 세포 접촉 패턴의 재구성은 연구원이 형태 형성의 다른 양상에 있는 특정 세포 접촉 패턴의 역할을 시험하는 것을 시킬 것입니다. 우리는 세포 분열 축이 접착제 비드(10)와의물리적 접촉에 의해 제어된다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용했다. 분할축 명세서는형태형성14, 줄기세포분열15,16,조직항상성15,16에기여함으로써 다세포발달에 매우 중요하므로, 이 방법은 동물조직 형성의 새로운 기전을 조명할 수 있어야 한다.
세포 분열 배향 이외에, 이 방법은 기계적 단서와 세포 운명 사이의 관계를 시험하는 플랫폼이 될 가능성이 있다. 이전 연구는 기계적 큐가 세포 운명 사양을 제어한다고...

다세포 발달 도중, 개별 적인 세포의 세포 행동 (예를 들면, 분할 축)는 각종 화학적 및 물리적 단서에 의해 지정됩니다. 개별 세포가 이 정보를 해석하는 방법, 그리고 다세포 어셈블리를 응급 재산으로 조절하는 방법을 이해하는 것은 형태 형성 연구의 궁극적인 목표 중 하나입니다. 모델 유기체 C. elegans는 세포 극성1,세포 분열 패턴1,세포 운명 결정2,신경 배선3 및 유기발생과같은 조직 규모 규정과 같은 형태 형성의 세포 수준 조절에 크게 기여하고 있다4,5. 다양한 유전 적 도구가 있지만 조직 공학 방법은 제한적입니다.
C. elegans 연구에서 가장 성공적인 조직 공학 방법은 고전적인 blastomere 격리6; C. 예쁜꼬마조충태아는 달걀 껍질과 투과성 장벽7에둘러싸여 있기 때문에 제거는이 방법의 주요 절차 중 하나입니다. 이 blastomere 절연 방법은 단순화 된 방식으로 세포 세포 접촉의 재구성을 가능하게하지만, 원치 않는 큐의 제거를 허용하지 않습니다; 세포 접촉은 여전히 기계적(예: 접착) 및 화학 적 단서를 모두 발생시켜 큐와 세포 행동 사이의 인과 관계를 완전히 분석하는 능력을 제한합니다.
이 백서에 제시된 방법은 리간드로 단백질을 포함하여 어떤 아민 반응성 분자든지에 공유하게 묶을 수 있는 carboxylate 수정된 폴리스티렌 구슬을 이용합니다. 특히, 우리는 구슬을 시각적으로 추적 할 수 있고 세포에 접착제로 만들기 위해 리간드로 로다민 레드-X의 아민 반응성 형태를 사용했습니다. 리간드 분자의 비드 표면 및 1차 아민 기의 카르복실 기는 수용성 카르보디미드 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드(EDAC)8,9에의해 결합된다. 얻어진 접착제 비드는 세포역학(10)에기계적 큐의 효과를 허용한다. 우리는 세포 분열 방향10에필요한 기계적 단서를 식별하기 위해이 기술을 사용했다.

<table><tbody><tr><td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1080703</td><td>비드 제제용</td></tr><tr><td>흡인기 튜브 어셈블리</td><td>Drummond</td><td>21-180-13</td><td>배반구 분리용.</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans 균주 : N2, 야생형</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>N2</td><td>균주 이 연구에 사용</td></tr> 된 <tr><td>Caenorhabditis elegans 균주 : KSG5, 유전자형 : zuIs45;이 연구에 사용 된 집 KSG5 균주의 itIs37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated Mircopipets, 10 &micro; L</td><td>Drummond</td><td>21-180-13</td><td>포반구 분리용</td></tr><tr><td>카르복실레이트 변성 폴리스티렌 비드 (30 &micro; m 직경)</td><td>KISKER Biotech</td><td>PPS-30.0COOHP</td><td>비드 제제</td></tr><tr><td>CD Lipid Concentrate</td><td>Life Technologies</td><td>11905031</td><td>포반구 분리용. 조직 배양 후드에서 작업합니다.</td></tr><tr><td>클로록스</td><td>클로록스</td><td>N.A.</td><td>포반구 분리를 위해. 차아염소산염 처리가 잘 작동하지 않을 때 새 병을 엽니다.</td></tr><tr><td>커버슬립 홀더</td><td>사내</td><td>N.A.</td><td>포반구 분리를 위해.</td></tr><tr><td>해부 현미경: Zeiss Stemi 508(M 스탠드 포함). 광원은 내장 LED입니다. 접안 렌즈의 배율은 10X입니다.</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td>포반구 분리용.</td></tr><tr><td>태아 소 혈청, 자격을 갖춘 원샷, 캐나다 원산지</td><td>Gibco</td><td>A3160701</td><td>포반구 분리용. 조직 배양 후드에서 작업합니다.</td></tr><tr><td>일반적인 사용 및 정밀 글라이드 피하 주사 바늘, 25 게이지</td><td>BD</td><td>14-826AA</td><td>블라스토머 격리용</td></tr><tr><td>Inulin</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA1842509</td><td>블라스토머 절연</td></tr><tr><td>MEM 비타민 솔루션(100x)</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>블라스토머 분리용.</td></tr><tr><td>MES (Fine White Crystals)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP300-100</td><td>비드 준비</td></tr><tr><td>용 Multitest Slide 10 Well</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN6041805</td><td>블라스토머 분리</td></tr><tr><td>PBS, 인산염 완충 식염수, 10 x 분말</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP665-1</td><td>비드 준비</td></tr><tr><td>용 페니실린-스트렙토 마이신 (10,000 U/mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140148</td><td> 배반구 격리.</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP431-100</td><td>배반구 분리용</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Bioshop</td><td>POC888</td><td>배반구 분리용</td></tr><tr><td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td><td>Molecular Probes</td><td>R6160</td><td>비드 제제용</td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Sterile Medium</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td>배반구 분리용. 조직 배양 후드에서 작업합니다.</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Bioshop</td><td>SOD001</td><td>블라스토머 절연</td></tr><tr><td>수산화나트륨 용액, 10 N</td><td>Fisher Chemical</td><td>SS255-1</td><td>블라스토머 절연</td></tr><tr><td>스피닝 디스크 컨포칼 현미경: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert 반전 스코프, Quant EM 512 카메라, 63X NA 1.4 플랜 아포크로맷 대물 렌즈. 시스템은 Slidebook 6.0에 의해 제어되었습니다.</td><td>지능형 이미징 혁신</td><td>N.A.</td><td>라이브 이미징용</td></tr><tr><td>주사기 필터, PTFE, Non-Sterile</td><td>Basix</td><td>13100115</td><td>배반구 분리용.</td></tr><tr><td>Tygon S3 Laboratory Tubing, 제형 E-3603, 내경 3.175 mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-862</td><td>배반구 분리용.</td></tr><tr><td>Tygon S3 Laboratory Tubing, 제형 E-3603, 내경 6.35mm</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>89403-854</td><td>배반구 분리용.</td></tr></tbody></table>

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

다세포 시스템에서, 개별 세포는 인접한 세포 및 환경에서 오는 각종 물리적 및 화학적인 단서에 의해 포위됩니다. 이 조직 복잡성은 외인성 단서와 세포 역학 사이 인과 링크의 확인을 혼동합니다. 종합적으로 재구성된 다세포 시스템은 연구원이 다른 사람을 제거하는 동안 특정 단서를 테스트할 수 있게 함으로써 이 문제를 극복합니다. 여기서, 우리는 분리 된 예쁜 꼬마염 블래스토미어 및 접착 성 폴리스티렌 구슬로 세포 접촉 패턴을 재구성하는 방법을 제시합니다. 절차는 계란 껍질 제거, 세포 세포 접착을 방해하여 blastomere 격리, 접착성 폴리스티렌 구슬의 준비, 세포 세포 또는 세포 비드 접촉의 재구성을 포함합니다. 마지막으로, 우리는 배아 개발에서 공간 세포 패터닝 및 세포 운명 사양의 조절에 기여하는 세포 분열 축의 방향을 조사하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 제시한다. 이 견고하고 재현 가능하며 다재다능한 체외 식 방법을 통해 공간 세포 접촉 패턴과 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구할 수 있습니다.

구슬 제제를 위해, GFP-미오신 II 및 mCherry-histone을 발현하는 형질전환 균주에 대한 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 최적 양을 결정하였다(도1A-D). 우리는 세포 주기 진행의 마커로 mCherry 태그 히스톤을 사용. 로다민 레드-X와 mCherry 모두 561 nm 레이저로 조명되기 때문에 로다민 레드-X 신호의 최적 강도는 세포와 비드의 동시 이미징을 허용하는 히스톤의 강도와 비교할 수 있습니다. 예를 들어, 0.005 μg/mL 로다민 Red-X 수치니미딜 에스테르로 처리된 비드로부터의 형광 신호는 비드를 가시화하기에는 너무 약했다(도1A). 한편, 5 μg/mL로 처리된 구슬로부터의 형광 신호는 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르가 이미지 mCherry-histone에 너무 강했다(도1</st...

다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

다세포 조직은 복잡하며,이 프로토콜은 단순화 된 방식으로 세포 전이를 재구성합니다. 한 가지는 세포 도체 양성자와 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구하는이 기술입니다. 이 프로토콜은 화학적으로 기능적인 폴리스티렌 구슬을 사용하여 세포 도체 양성자를 재구성합니다.구슬은 관심있는 양성자와 함께 절단 할 수 있습니다, 세포 반응에 미치는 영향을 테스트하기 위해. 우리는 마우스 배아에 C-엘레강스에서이 방법을 사용했다. 따라서,이 프로토콜은 넓은 유기체의 연구에 똑바로 할 수있다.배아는 높은 전체 염소 처리 후에 깨지기 때문에, 1개의 성공적으로 blastomere를 격리할 수 있기 전에 중요한 사례가 필요합니다. 시각적 데모는 blastomere 격리 방법 중에 모세관을 처리하는 방법에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 시작하려면 1.5 밀리 리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 10 밀리 그램의 카복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬의 무게를 측정합니다.MES 버퍼 1밀리리터를 튜브에 추가하여 세척합니다. 튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 벤치 탑 원심분리기를 통해 2000XG에서 60초 동안 튜브를 회전시합니다.버퍼를 조심스럽게 피펫으로 전환하여 상신을 디카드합니다. MES 버퍼 1밀리리터로 구슬을 다시 씻으십시오. 세척 후, 튜브에 EDAC 10 밀리그램을 포함하는 MES 버퍼 1밀리리터를 추가하여 표면 카복실 그룹을 활성화합니다.튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. 2000XG에서 60초 동안 구슬을 회전시합니다.버퍼를 조심스럽게 꺼내서 상체를 버리고 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 튜브를 소용돌이하여 구슬을 혼합하고 PBS 세척을 한 번 더 반복합니다. 0.65 밀리 리터 로다민 레드-X 스톡 솔루션에서 1밀리리터 10, 100, 100, 1,000배의 로다민 레드-X 희석 시리즈를 준비합니다.Pippette 20 마이크로 리터의 구슬은 각 시리얼 희석 튜브에 넣습니다. 실온에서 5분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. PBS 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시면 됩니다.세척 후, 튜브에 PBS의 1 밀리 리터를 추가하고 최대 6 주 동안 섭씨 4도에 저장합니다. 라이브 이미징에 사용되는 현미경으로 구슬의 형광 강도를 확인하십시오. 오른손과 왼손으로 10 마이크로 리터의 용량으로 마이크로 모세관의 각 끝을 잡으라.미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관 의 중심을 버너 위로 가져와 손으로 당겨진 두 개의 모세 혈관을 만듭니다. 해부 현미경에서, 집게와 손으로 뽑아 모세 혈관의 끝을 손질. 두 팁 개구부 크기를 약 2배, 배아 전이 및 달걀 껍질 제거를 위한 C-Elegance 배아의 짧은 접근 길이의 1배를 확인합니다.끌어온 모세관을 입에 넣는 장치에 부착합니다. 핍펫 45 마이크로 리터의 달걀 소금 용액이 다중 웰 슬라이드의 우물에 들어있습니다. 5~10명의 성인 C-엘레강스를 우물에 놓습니다.초기 C-엘레강스 배아를 얻으려면 C-Elegance의 몸의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 미끄러지게하여 성인을 조각으로 잘라냅니다. Pippette 45 마이크로 리터의 저혈당 용액은 계란 소금 용액을 함유하고 있으며, 쉘튼의 성장 매체의 45 마이크로 리터를 다음 세 개의 우물에 잘 함유하고 있습니다. 1개의 세포 단계 및 초기 2개의 세포 단계 배아를 더 큰 크기의 개구로 입 핍펫에 의하여 hypochlorite 용액으로 옮기고 40 55 초 동안 기다립니다.셸튼의 성장 매체와 함께 다음 세 개의 우물로 배아를 전송하여 배아를 씻어. 처음 두 개의 우물 각각에 1 ~ 2 초. 손으로 그린 모세관을 사용하여 작은 크기의 개구부를 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 배아를 조심스럽게 반복합니다.그 후, 2세포 단계 배아 발파소를 분리하기 위해 손으로 그린 모세관을 지속적으로 배피한다. 달걀 껍질 제거 후, 파열을 방지하기 위해 배아를 위아래로 핍펫에 힘을 최소화. 커버슬립 홀더에 커버슬립을 배치하여 이미징 챔버를 준비하고 커버슬립의 가장자리를 테이프로 사용하여 염색합니다.커버슬립 홀더를 뒤집어 소수성 펜으로 커버슬립에 원을 그립니다. 소수성 마커에 의해 그려진 원 내에서 쉘튼의 성장 매체를 추가하고, 원 내의 이미징 챔버에 격리 된 blastomere를 전송합니다. 이제, 더 큰 개구부와 손으로 그린 모세관을 사용하여 커버 슬립에 화학적으로 기능화 된 구슬의 작은 볼륨을 분배.구슬이 분리된 blastomere에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관으로 불어서 구슬의 위치를 제어합니다. 중간 의 증발을 피하기 위해 커버 슬립을 마운트하고 반전 된 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행합니다. 이 연구에서는, GFP miosin-2및 M-cherihistone을 표현하는 형질 균주에 대한 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 0.005 마이크로 그램으로 처리 된 비드에서 형광 신호는 너무 약했다.다른 한편으로는, 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 5 마이크로 그램으로 처리 된 구슬에서 형광 신호는 너무 강했다. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 농도는 밀리 리터당 0.5 마이크로 그램으로 이 특정 형질 변형에 최적이었습니다. 라이브 이미징 중에 두 개의 중등골이 수직으로 정렬된 비행기가 확인되었습니다.이 비행기의 플러스 또는 마이너스 90도 각도를 가진 비행기는 스핀들 평면입니다. 사이토카네시스 후 세포/비드 접촉 인터페이스에 대한 스핀들 방향의 각도는 두 딸 세포가 두 접촉 시야를 통과하는 선에서 비드에 부착되어 접촉 방향으로 사용되었다는 것을 보여준다. 하나는 배아와 계란 껍질이 입 핍펫에 의해 적용 된 특정 외부 힘에 반응하는 방법을 배울 필요가있다.이론적으로, 모든 세포 반응은 연구될 수 있고, 예를 들어, 황산염 사양은 세포를 배양하고 더 긴 조건에 걸쳐 접착제 구슬과의 접촉에 의해 연구될 수 있다. 이 기술은 접촉 종속 세포 분열 방향 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. PTF 필터는 입 핍펫을 통해 하이포염소염 용액의 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

이 비디오는 초기 배아에서 C. elegans 할구를 분리하는 방법을 소개합니다. 그 결과로 생성된 세포는 세포 배양 또는 생체 외 실험에 적합합니다.

C. 예쁜꼬마선충 배반구 해부: 난자 껍질을 제거하고 배아 세포를 해리하는 방법

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

우리는 축 발달과 병행하여 자기 조직화, 대칭 파괴 및 신장을 표시하는 마우스 배아 줄기 세포의 응집체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 축 방향 발달 과정과 단층 배양에서 수행하기 어려운 세포 유형의 생성을 연구할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가<em&gt; 체외</em

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의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

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조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

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분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

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