Name: 인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 배우세요 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오잉크를 이용한 3D 바이오프린팅 기법으로 췌도 섬을 캡슐화하여 당뇨병 치료용 이식 가능한 조직 구조물을 제작하는 방법을 익히세요.

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이 연구는 한국 정부(MSIT)(2017M3A9C6032067)와 "ICT 융합 창의프로그램"(IITP-2019-2011-1-00783)의 지원을 받아 국립연구재단(NRF)의 바이오 및 의료기술 개발 프로그램을 지원받았습니다. IITP(정보통신기술기획평가연구원)의 감독을 받고 있습니다.

돼지 췌장 조직은 지역 도축장에서 수집되었다. 동물실험은 한국서울병원 동물보호위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 탈세포화
<ol><li>탈세포화를 위한 솔루션을 준비합니다. 참고: 모든 용액 제제에 사용되는 1x 인산염 완충식염수(PBS)는 증류수를 10x PBS에 첨가하여 희석됩니다.<ol>
<li>1% Triton-X 100 용액의 경우, 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL를 100% 트리톤-X 100 용액을 100% 트리톤-X 100 용액의 100mL을 100mL의 100mL용으로 용해하여 150rpm의 자석 교반 바를 사용하여 100mL의 100mL를 100% 트리톤-X 100 mL의 100mL 및 10% 트리톤-X 100mL의 40mL로 100mL, 100% 트리톤-X 100mL용으로 100mL, 100mL의 트리톤-X 100mL용을 100mL로 용해 PBS는 사용하기 직전에 준비되었습니다. 참고 : 10 % Triton-X 100 용액은 필요할 때까지 실온에서 보관 할 수 있습니다.</li>
		<li>0.1% 퍼라세산 용액의 경우, 사용 직전에 증류수 368.7 mL로 70% 에탄올의 22.8 mL로 4.7% peracetic acid의 8.5 mL를 희석하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>췌장의 말초 조직을 제거하고 탈세포화 전에 조직을 슬라이스하십시오.<ol>
<li>용해 된 돼지 췌장을 흐르는 수돗물로 씻고 멸균 된 가위를 사용하여 주변 조직을 제거하십시오.</li>
		<li>췌장을 집게가 있는 비닐 봉지에 옮기고 다음 단계를 위해 췌장을 효과적으로 자르도록 1시간 동안 -80°C에서 동결합니다.</li>
		<li>냉동 된 췌장을 강판을 사용하여 1mm 두께의 조각으로 자릅니다.</li>
		<li>슬라이스 된 조직 50g을 500 mL 플라스틱 용기에 옮긴다. 참고: 조직을 오염으로부터 보호하고 용액 증발을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 플라스틱 용기가 권장됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시약으로 치료. 참고: 전체 탈세포화 과정은 150rpm에서 디지털 궤도 셰이커에서 4°C에서 수행되어야 합니다. 모든 탈세포화 단계에서, 집게를 이용한 물리적 분리는 췌장의 조각이 서로 달라붙는 것을 막기 위해 요구된다. 용기에 잔류 시약을 완전히 제거하려면 증류수로 용기를 세척할 필요가 있습니다.<ol>
<li>시약 처리 전에 셰이커를 사용하여 300 mL의 증류수로 얇게 썬 췌장 50g을 씻으소서.</li>
		<li>흐린 물이 사라질 때까지 150rpm에서 조직을 계속 저어줍니다 (약 12 시간 후). 2시간마다 증류수를 교체하십시오. 참고: 효율성을 위해 매시간 증류수를 교체하여 흐린 물을 더 빨리 제거하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>물을 버리고 1x PBS 용액에 1% 트리톤-X 100의 400 mL로 50g의 조직을 84 시간 동안 치료하십시오. 참고 : 이 시점에서 세포 성분이 제거되기 시작하기 때문에 조직의 양이 감소합니다.</li>
		<li>400 mL의 이소프로판올 (IPA)으로 치료하여 2 시간 동안 췌장에서 남은 지방을 제거하십시오. 참고 : 이 과정에서 지방제거로 인해 조직이 단단해지는 것은 정상입니다.</li>
		<li>2시간 후, IPA를 제거하고 24시간 동안 1x PBS의 400 mL로 티슈를 세척합니다.</li>
		<li>탈세포조직을 살균하기 위해, 이전 용액을 버리고 400 mL의 0.1 % peracetic acid를 4 % 에탄올에서 2 시간 동안 치료하십시오.</li>
		<li>잔류 세제를 제거하려면 400 mL의 1x PBS로 6 시간 동안 조직을 씻으소서 2 시간마다 용액을 새로 고칩니다.</li>
		<li>집게와 50 mL 원추형 튜브에서 탈세포 조직을 수집합니다.</li>
		<li>샘플을 -80°C에서 1시간 동안 동결시키고 뚜껑 대신 보풀이 없는 물티슈로 원엽 튜브를 덮고 효율적인 동결 건조를 위해 고무 밴드로 고정합니다.</li>
		<li>4 d에 대한 -50 °C에서 탈세포화된 조직을 동구우성화시켰다. 참고 : 1.3 단계의 경우, 비 세포화 된 조직 1 g도 동일한 조건에서 동결 건조되어야합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 탈세포조직의 평가
참고: dsDNA, 글리코사미노글리칸(GAGs) 및 콜라겐의 잔류량을 네이티브 조직과 비교하여 탈세포화된 조직에서 평가하기 위해, 각각의 비세포화 조직(기본 조직) 및 탈세포화된 조직의 적어도 1g이 필요합니다. 일괄 평가. dsDNA, GAGs 및 콜라겐의 양은 조직의 건조 중량에 기초하여 계산될 수 있다.
<ol><li>생화학 분석을 위한 해결책을 준비하십시오.<ol>
<li>샘플 소화를 위한 파파인 용액을 준비합니다. 참고: 만들 버퍼의 양은 샘플 수에 따라 조정할 수 있습니다.<ol>
<li>119 mg의 용해 0.1 M M 나트륨 인산염 (모노 베이직), 18.6 mg의 0.5 mM Na2-EDTA, 8.8 mg의 5 mM 시스테인-HCl의 10 mL의 오토 클레이브 워터.</li>
			<li>10 M NaOH 용액을 추가하여 용액의 pH를 6.5로 조정합니다.</li>
			<li>위의 용액과 소용돌이에 10 mg/mL 파페인 스톡 솔루션 125 μL을 추가하여 각 요소가 고르게 혼합될 수 있도록 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>디메틸 메틸렌 블루(DMMB) 분석법을 위한 용액을 준비합니다.<ol>
<li>DMMB 염료를 만들려면, 8 mg의 1,9-디메틸-메틸렌 블루 염화물 이중 소금, 글리신 1.52 g, 그리고 500 mL의 오토클레이브 워터에 NaCl 1.185 g을 녹입니다. 벤치탑 pH 측정기를 사용하여 pH의 변화를 측정하면서 0.5 M HCl 용액을 추가하여 pH를 3으로 조정합니다. 그런 다음 500 mL 병 상단 진공 필터를 통해 이를 필터링합니다.</li>
			<li>15 μL의 10 mg/mL 콘드로이틴 황산염 용액을 표준용으로 만드세요.</li>
		</ol>
</li>
		<li>하이드록시프롤린 분석법을 위한 솔루션을 준비합니다.<ol>
<li>클로라민 작동 용액의 경우, 아세테이트 나트륨 2.4 g, 구연산 1 g, 수산화 나트륨 0.68 g을 증류수 24 mL에 용해하고 빙하 아세트산 240 μL, 톨루엔 10 μL 및 IPA 6 mL을 첨가합니다. 참고: 와류 믹서를 사용하여 용액에 있는 모든 분말을 용해시다. 클로라민 작업 용액은 최대 3 개월 동안 4 °C에서 보관할 수 있습니다.</li>
			<li>클로라민 T 용액의 경우, 클로라민 가공 용액 20 mL에 0.35 g의 클로라민 T를 용해시키고 2.5 mL의 IPA를 추가하십시오. 모든 구성 요소를 혼합하는 소용돌이. 참고: 사용하기 직전에 준비하십시오.</li>
			<li>P-DAB 용액의 경우, 3.75 g의 P-DAB를 6.5 mL의 과염산과 15 mL의 IPA에 넣습니다. 알루미늄 호일에 싸서. 참고: 사용하기 직전에 준비하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 10 mg의 용서 구성 조직에 파파인 용액 1 mL을 추가하고 튜브를 소용돌이로 하여 샘플을 더 잘 소화시십시오.</li>
	<li>1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 고무 랙에 놓고 16 시간 동안 60 °C에서 300 mL의 물을 포함하는 500 mL 비커에서 샘플을 소화합니다.</li>
	<li>20 분 동안 9,500 x g의 원심 분리기를 수집하고 상류를 수집하고 새 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>탈세포화된 조직에서 잔류 DNA 및 주요 단백질을 정량화합니다.<ol>
<li>소화된 시료 1μL을 분광계에 적재하고 제조업체의 지침에 따라 dsDNA의 양을 측정합니다. 참고: 실험자는 시료를 오염하지 않도록 머리를 다시 묶고 마스크를 착용해야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>DMMB 분석을 수행하여 탈세포화된 조직에 남아 있는 GGs의 양을 정량화합니다.<ol>
<li>콘드로이틴 황산염 A 용액 1 μL과 1x PBS 499 μL을 혼합하여 표준을 만듭니다. 콘드로이틴 황산염 A 용액을 0, 4, 8, 12, 16 및 20 μg/mL의 농도로 증류수로 희석합니다.</li>
		<li>표준 및 소화된 시료의 각 농도당 50 μL의 삼중량을 96웰 플레이트에 로드합니다.</li>
		<li>멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 DMMB 염료 200 μL을 추가합니다.</li>
		<li>즉시 마이크로 플레이트 리더에 525 nm에서 흡광도를 읽습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>하이드록시프롤린 분석기를 수행하여 콜라겐의 양을 정량화합니다.<ol>
<li>하이드록시프롤린 분석결과를 수행하기 위해, 16시간 동안 120°C에서 동일한 부피의 HCl로 250 μL의 소화된 시료를 배양한다.</li>
		<li>샘플을 냉각하기 위해 실온에서 잔류물을 3시간 동안 건조한 다음 샘플을 1mL의 1mL에서 다시 용해시도록 합니다.</li>
		<li>2,400 x g에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>100 μg/mL 하이드록시프롤린 솔루션을 표준으로 준비합니다.</li>
		<li>표준 용액을 위해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL의 농도로 증류수로 하이드록시프롤린 용액을 희석하십시오.</li>
		<li>50 μL의 샘플 및 표준 용액을 96웰 플레이트에 적재하십시오.</li>
		<li>클로라민 T 용액 50 μL을 넣고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>p-DAB 용액 50 μL을 넣고 60°C에서 30분 동안 배양합니다. 참고 : 어두운 방에서 알리 쿼트. 첨가 후, 알루미늄 호일로 플레이트를 감쌉다.</li>
		<li>실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>냉각 후, 마이크로플레이트 리더에서 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 바이오 잉크 준비
참고: pdECM 분말은 적어도 1년 동안 -80°C에서 안정적으로 보관할 수 있다. pH 조정 전에, 소화된 pdECM 용액을 -20°C에서 1개월 동안 저장할 수 있다. 사용하기 전에, 밤새 4°C에서 냉동 pdECM 용액의 샘플을 해동한다. pH 조절 pdECM 용액은 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있다. 소화된 pdECM 용액은 적어도 며칠 동안 4°C에서 보관될 수 있으나 1주를 초과해서는 안 된다.
<ol><li>동결 건조 된 pdECM을 펩신으로 소화시킵니다.<ol>
<li>바이오 잉크의 효과적인 소화를 위해, 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소로 동독 pdECM을 분쇄하십시오.</li>
		<li>50 mL 원엽 튜브에 pdECM 분말 200 mg을 수집하고 펩신 20 mg과 0.5 M 아세트산 8.4 mL을 추가합니다 (최종 농도는 2 w / v %).</li>
		<li>자기 교반 막대를 50 mL 원추형 튜브에 넣고 96 시간 동안 300 rpm에서 저어줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화된 pdECM 용액의 pH를 조정합니다. 참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하기 위해이 과정은 얼음에서 수행되어야합니다.<ol>
<li>얼음에 양성 변위 파이펫을 사용하여 40 μm 세포 스트레이너를 사용하여 pdECM 용액에서 소화되지 않은 입자를 걸레로 걸트리하여 부품의 최적의 소화를 얻습니다.</li>
		<li>NaOH를 사용하기 전에 10x PBS 및 소용돌이의 1 mL을 추가합니다.</li>
		<li>pH 를 pH 표시기 스트립으로 pH를 검사하는 10 M NaOH로 pH를 7로 조정합니다. 참고 : 바이오 잉크가 다른 시약과 철저히 혼합되도록 NaOH가 첨가 될 때마다 소용돌이.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 유변학 분석
<ol><li>실험 설정<ol>
<li>유변학적 특성을 평가하기 위해 pdECM 바이오잉크의 1.5%(w/v)를 준비한다.</li>
		<li>레오미터의 속도 제어 모드에서 20mm 콘 플레이트 형상(2°각도의 원뿔 직경 20mm)을 설정합니다.</li>
		<li>설치된 소프트웨어(TRIOS)에서 실험 시퀀스를 생성하여 pdECM 바이오잉크의 점도, 겔화 역학 및 동적 계수를 측정합니다.<ol>
<li>점도: 판에 pdECM 바이오잉크를 놓습니다. 15°C의 일정한 온도에서 1~1,000s-1의 전단 속도를 증가시켜 pdECM 바이오잉크의 복합 점도(Pa·s)를 측정합니다.</li>
			<li>겔화 역학: 판에 pdECM 바이오잉크를 놓습니다. 4-37°C에서 pdECM 바이오잉크의 저장 및 손실 계수를 측정하여 5°C/min(시간 스윕 모드)의 증분 증가율을 측정하여 복잡한 계수(G*)를 계산합니다.</li>
			<li>동적 계수: pdECM 바이오잉크를 측정 전 60분 동안 37°C에서 플레이트에 놓습니다. 2% 스트레인에서 0.1-100 rad/s의 범위에서 pdECM 바이오잉크의 주파수 의존적 저장 계수(G') 및 손실 계수(G'')를 측정합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 췌도를 사용하여 췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄
<ol><li>고립 된 섬의 준비<ol>
<li>전작5에기재된 프로토콜에 따라 쥐로부터 1차 섬을 분리한다.</li>
		<li>분리된 아일렛으로부터 파편과 죽은 세포를 분리하려면 70 μm 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 직경이 70 μm보다 작은 섬은 죽었거나 비정상으로 간주됩니다.</li>
		<li>RPMI-1640 매체에 고립 된 섬을 일시 중단하고 페트리 접시에 놓습니다. 생물 안전성 캐비닛에서 현미경(4x 대물 렌즈)에서 P200 볼륨 파이펫을 사용하여 직경 300 μm보다 큰 섬을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>pdECM 바이오 잉크로 의 아일렛 캡슐화<ol>
<li>pH 조절 된 pdECM 바이오 잉크 및 단리 된 아일렛을 준비합니다. 참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하려면이 과정을 얼음에서 수행해야합니다.</li>
		<li>pdECM 바이오잉크와 매염액(비율 3:1)을 균일하게 혼합할 때까지 양수 변위 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합한다. 참고: pdECM 바이오잉크의 최종 농도는 1.5%이고 pdECM 바이오잉크의 세포 밀도는 3,000 IEQ/mL이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄<ol>
<li>멸균 된 주사기와 22G 노즐을 준비하십시오. 참고: 이 게이지는 직경이 100-250 μm인 작은 섬을 인쇄하기 위해 선택되었습니다.</li>
		<li>주사기에 하중 아일렛 라덴 pdECM 바이오 잉크.</li>
		<li>격자 모양으로 18°C에서 최적화된 인쇄 조건(이송 속도: 150mm/min; 공압 압력: 15 kPa)으로 바이오잉크를 인쇄합니다.</li>
		<li>바이오잉크를 교차 연결하려면 인쇄된 구슬을 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.</li>
		<li>10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토미신을 보충한 RPMI-1640 배지인 아일레 배양 매체에 인쇄된 구성물을 담급감.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 패턴 구조의 췌장 구조의 3D 세포 인쇄
<ol><li>바이오 잉크의 두 가지 유형의 제조<ol>
<li>여러 개의 바이오잉크를 사용하여 인쇄 의 다양성을 검증하기 위해, pdECM 바이오 잉크 2 세트를 준비하고 각각 1:20의 비율로 각 pdECM 바이오 잉크에 0.4 % Trypan Blue 및 Rose 벵골 용액을 추가하여 얼룩을 지습니다. 참고 : pH 조정 전에 겔화를 피하려면이 과정을 얼음에서 수행해야합니다.</li>
		<li>pdECM 바이오잉크와 매염액(비율 3:1)을 균일하게 혼합할 때까지 양수 변위 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합한다. 참고: pdECM 바이오잉크의 최종 농도는 1.5%이고 pdECM 바이오잉크의 세포 밀도는 3,000 IEQ/mL이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다물질 계 췌장 조직 구조의 3D 세포 인쇄<ol>
<li>멸균 된 주사기와 25G 노즐을 준비하십시오.</li>
		<li>각 바이오잉크(파란색과 빨간색)를 각각 두 개의 서로 다른 주사기에 로드합니다.</li>
		<li>최적화된 인쇄 조건(이송 속도: 150mm/min; 공압 압력: 15 kPa)을 파란색과 빨간색의 교대선으로 격자 모양으로 18°C에서 인쇄합니다.</li>
		<li>바이오잉크를 교차 연결하려면 인쇄된 구슬을 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다.</li>
		<li>10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토미신을 보충한 RPMI-1640 배지인 아일레 배양 매체에 인쇄된 구성물을 담급감.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

이 프로토콜은 pdECM 바이오 잉크의 개발및 3D 세포 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 제조를 설명했다. 3D 엔지니어링 조직 구성에서 표적 조직의 미세 환경을 재환기시키기 위해 bioink의 선택은 매우 중요합니다. 이전 연구에서, 우리는 조직 특이적 dECM 바이오잉크가 줄기세포 분화 및 증식을 촉진하는 데 유익하다는 것을검증했다 10. 합성 중합체에 비해, dECM은 조직 특이적 조성물 및아키텍처(11)때문에 세포 유리한 환경으로서 작용할 수 있다. 따라서, 탈세포화 과정은 dECM에서 주요 성분의 높은 체류를 진지하게 고려되어야 한다.
췌장 조직의 탈세포화를 위한 상이한 세제의 선택은 잔류 ECM성분(12)을변화시다. 탈세포화 과정에서, 우리는 나트륨 도데실 황산염 (SDS)의 사용이 ECM 단백질(...

최근 췌도 이식은 제1형 당뇨병 환자에게 유망한 치료법으로 여겨지고 있다. 절차의 상대적 안전성과 최소 침습성은이 치료의 큰장점입니다 1. 그러나, 그것은 고립 된 섬과 면역 억제 약물의 부작용의 낮은 성공률과 같은 몇 가지 한계가 있다. 더욱이, 적대적인 환경으로 인해 이식 후 이식 후 이식된 작은 섬의 수는 꾸준히 감소한다2. 이러한 어려움을 극복하기 위해 알긴산, 콜라겐, 폴리(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다양한 생체 적합성 물질이 췌도 이식에 적용되어 왔다.
3D 세포 프린팅 기술은 큰 잠재력과 높은 성능으로 인해 조직 공학에서 부상하고 있습니다. 말할 필요도 없이, bioinks는 인쇄된 조직 구조물에 있는 세포 프로세스의 개선을 가능하게 하는 적당한 미세 환경을 제공하고 가능하게 하기 위한 중요한 분대로 알려져 있습니다. 피브린, 알긴산 및 콜라겐과 같은 전단 숱이 많은 하이드로겔은 바이오잉크로 널리 사용됩니다. 그러나, 이들 물질은 네이티브 조직에서 세포외 매트릭스(ECM)에 비해 구조적, 화학적, 생물학적, 및 기계적 복잡성의 부족을 보여준다3. 섬과 ECM 사이의 상호 작용과 같은 미세 환경 큐는 섬의 기능을 향상시키기위한 중요한 신호입니다. 탈세포화된 ECM(dECM)은 콜라겐, 글리코사미노글리칸(GAGs) 및 당단백질을 포함한 다양한 ECM 성분의 조직 특이적 조성물을 재현할 수 있다. 예를 들어, 그들의 말초 적혈구(예를 들어, 타입 I, III, IV, V, 및 VI 콜라겐, 라미닌 및 섬유넥틴)를 유지하는 원발성 섬은 낮은 세포자멸 및 더 나은 인슐린 감수성을 나타내며, 따라서 조직 특이적 세포-매트릭스 상호작용이 원래 조직과 유사하게 기능하는 능력을 향상시키는 데 중요하다는 것을 나타낸다4.
이 논문에서, 우리는 췌장 췌도의 활동 과 기능을 증폭하기위한 유익한 미세 환경 단서를 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포 질성 세포 간 매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 해명하고, 마이크로 압출 기반의 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구조를 생성하는 과정을 수행합니다(그림 1).

<table><tbody><tr><td>생물 안전 작업대</td><td>CRYSTE</td><td>PURICUBE 1200</td><td></td></tr><tr><td>Deep Freezer</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>디지털 오비탈 쉐이커</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>DH. </td><td></td>WSO04010</tr><tr><td>건조 오븐</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WON-155</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>LABCONCO</td><td>7670540</td><td></td></tr><tr><td>냉장고</td><td>SANSUNG</td><td>CRFD-1141</td><td></td></tr><tr><td>강판</td><td>ABM</td><td>1415605793</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>CRYSTE</td><td>PURISPIN 17R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan GO</td><td></td></tr><tr><td>Mini 원심분리기</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>CF-5</td><td></td></tr><tr><td>다중 핫플레이트 교반기</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SMHS-6</td><td></td></tr><tr><td>나노드롭</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>pH 탁상용 측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>레오미터</td><td>TA Instrument</td><td>Discovery HR-2</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Cirurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operating Scissors</td><td>Hirose</td><td>HC.13-122</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>HC.203-30</td><td></td></tr><tr><td>Materials </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10ml 유리 바이알</td><td>Scilab</td><td>SL. VI1243</td><td></td></tr><tr><td>40 &마이크로; m 셀 스트레이너</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5L 비커</td><td>동성 과학</td><td>SDS 2400</td><td></td></tr><tr><td>50mL cornical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>500mL 비커</td><td>한국 에이스 사이언티픽</td><td>KA.23-08</td><td></td></tr><tr><td>500mL 보틀탑 진공 필터</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>500mL 플라스틱 용기</td><td>LOCK& LOCK</td><td>INL301</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>팔콘</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>대교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>김와이프 Kimtech</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 바</td><td>한국 에이스 사이언티픽</td><td>BA.37110-0003</td><td></td></tr><tr><td>박격포 및 유봉</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SC. MG100</td><td></td></tr><tr><td>멀티 채널 피펫터</td><td>Eppendorf</td><td>4982000314</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>pH 지시자 스트립</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1095350001</td><td></td></tr><tr><td>체 필터 메쉬</td><td>DAIHAN Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decellularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x pbs</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>4.7% 과아세트산</td><td>오메가팜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>E0220 SAM</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPA</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>삼춘 I0348</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Biosesang</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>Biochemical assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,9-디메틸-메틸렌 블루 아연 클로라이드 이중 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2018</td><td></td></tr><tr><td>클로라민 T</td><td>시그마-알드리치</td><td>857319</td><td></td></tr><tr><td>콘드로이틴 설페이트 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Supelco</td><td>46933</td><td></td></tr><tr><td>시스테인-HCl</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>C1276</td><td></td></tr>, <tr><td>빙초산</td><td>메록</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>, 410225</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>H1758</td><td></td></tr>, <tr><td>Na2-EDTA</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>E5134</td><td></td></tr>, <tr><td>NaCl</td>, <td>삼춘화학제품</td><td>, S2097</td><td></td></tr>, <tr><td>파파인</td><td>시그마-알드리치</td><td>p4762</td><td></td></tr><tr><td>P-DAB</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2004</td><td></td></tr><tr><td>과염소산</td><td>시그마-알드리치</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>수펠코</td><td>SX0607N</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨(일염기성)</td><td>시그마-알드리치</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Bioink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charicterized FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7215</td><td></td></tr><tr><td>로즈 벵골</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198250</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

인쇄 3d 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

췌도의 이식은 저혈당증 및 이차 합병증을 동반한 타입-1 당뇨병 때문에 손해를 입는 환자를 위한 유망한 처리입니다. 그러나, 섬 이식은 여전히 가난한 섬 생착 및 적대적인 환경으로 인해 이식 된 작은 섬의 낮은 생존가능성과 같은 몇 가지 제한사항이 있습니다. 또한, 인간 만능 줄기세포로부터 분화된 인슐린 생성 세포는 혈당 수준을 조절할 수 있는 충분한 호르몬을 분비하는 능력이 제한되어 있다; 따라서 적절한 미세 환경 단서로 세포를 배양하여 성숙을 개선하는 것이 매우 필요합니다. 이 기사에서는 췌도의 포도당 민감도를 증가시킬 수있는 유익한 미세 환경을 제공하기 위해 췌장 조직 유래 탈세포화 세포 질매트릭스 (pdECM) bioink를 준비하기위한 프로토콜을 설명하고 설명합니다. 3D 췌장 조직 생성 과정은 마이크로 압출 기반의 바이오 프린팅 기술을 사용하여 구성됩니다.

췌장 조직의 세포화 우리는 3D 생체 인쇄 조직 구조에서 췌도의 기능을 향상시키기위한 췌장 조직 특이적 미세 환경을 제공하기 위해 pdECM bioink를 준비하는 과정을 개발했습니다(그림 2A). 탈세포화 과정 후, dsDNA의 97.3%가 제거되었고 콜라겐 및 GAGs와 같은 대표적인 ECM 성분은 각각 원어민 췌장 조직에 비해 1278.1% 및 96.9%로 유지되었다(도2B).
바이오잉크 제제 프린팅 공정에 pdECM을 적용하기 위해, pdECM 분말을 펩신으로 약한 산으로 용해시키고 10 M NaOH 용액을 사용하여 중화...

세포외 세포외 매트릭스(dECM)는 엔지니어링된 구조에서 표적 조직의 고유 기능을 재량화하기 위한 적절한 미세 환경 단서를 제공할 수 있습니다. 이 기사는 췌장 조직의 탈세포화, 췌장 조직 유래 dECM 바이오 잉크의 평가 및 생체 인쇄 기술을 사용하여 3D 췌장 조직 구성의 생성을위한 프로토콜을 설명합니다.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

pdECM 바이오잉크는 조직별 구성 요소와 아키텍처를 사용하여 췌장 섬에 유익한 미세 환경을 제공할 수 있으며 세포 사망을 줄이고 인쇄가능성을 높이는 최적의 신경학적 특성을 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직 별 조성물은 3D 췌장 조직 구조와 캡슐화 된 섬 사이의 건설적인 교차토크를 촉진하는 pdECM 바이오 잉크 내에서 보존 될 수 있다는 것입니다. pdECM 바이오잉크내의 암슬레 캡슐화의 개발은 제1형 당뇨병의 치료를 위한 이식 가능한 췌장 조직 구조의 제조에 적용될 수 있다.이 바이오잉크는 당뇨병, 당뇨병 관련 합병증 및 췌장암을 위한 체외 조직 모델뿐만 아니라 이식 가능한 구조물의 적용을 넓히는 데 사용될 수 있다. 냉동 돼지 췌장 조직 샘플의 탈세포화를 위해 강판을 사용하여 냉동 췌장을 1mm 두께의 조각으로 자르고 50 그램의 슬라이스 된 조직을 500 밀리리터 플라스틱 용기로 옮춥시킵니다. 디지털 궤도 셰이커에서 섭씨 4도에서 300밀리리터의 증류수로 조직을 분당 150회전에서 약 12시간 동안 세척합니다.흐린 물이 사라지면 PBS에서 1%트리톤-X 100의 400밀리리터로 84시간 동안 물을 교체하십시오. 세제 처리의 끝에서, 췌장에서 나머지 지방을 제거하기 위해 2 시간 동안 이소 프로파놀의 400 밀리리터와 조직을 배양하고, PBS의 400 밀리리터에서 24 시간 세척. 세척이 끝나면, 400 밀리리터의 0.1%의 폐체성산으로 탈세포조직을 4%에탄올로 2시간 동안 살균한 후 6시간 동안 400밀리리터의 신선한 PBS로 샘플을 세척하여 잔류 세제를 제거한다.세척이 끝나면 집게를 사용하여 조직 조각을 50 밀리리터 원뿔 관으로 옮기고 샘플을 영하 80도에서 1시간 동안 재고정합니다. 그런 다음 원물 튜브를 고무 밴드로 고정한 보풀이 없는 닦아로 덮고 4일 동안 섭씨 영하 50도에서 탈세포 조직을 lyophilize합니다. 바이오잉크를 준비하려면 200밀리그램의 동결 건조 pdECM을 새로운 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고 20밀리그램의 펩신과 8.4밀리리터를 조직 샘플에 첨가한다.그런 다음 자기 교반 바를 튜브에 넣고 분당 300 회전에서 96 시간 교반 인큐베이션을 합니다. 인큐베이션의 끝에서, 40 마이크로미터 세포 스트레이너와 긍정적 인 변위 파이펫을 사용하여 얼음의 새로운 튜브로 용액을 필터링하여 소화되지 않은 입자를 걸러내고 10X PBS의 1 밀리리터를 튜브에 추가합니다. 소용돌이 후 수산화 나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7개로 조정합니다.패턴 구조로 췌장 구조의 3D 세포 프린팅을 위한 바이오잉크를 준비하기 위해, 0.4%의 트라이판 블루와 로즈 벵골 용액1개의 알리쿼트1을 1대 20 비율로 염색한다. 그런 다음 양수 변위 파이펫을 사용하여 각 바이오잉크 용액을 중간 액트액과 3 대 1 비율로 최종 1.5 %의 바이오 잉크 농도 및 밀리리터 당 3 개의 아슬렛에 3 배 10의 세포 밀도를 부드럽게 혼합합니다. 다재료 기반 췌장 조직 구조의 3D 세포 프린팅을 위해 각 바이오잉크 슬렛 혼합물을 25개의 게이지 노즐과 3D 프린트가 장착된 개별 살균 주사기에 적재하고 각 바이오잉크를 최적화된 인쇄 조건하에서 18도의 최적화된 인쇄 조건하에서 블루와 레드의 교대선이 있는 격자 모양으로 로드합니다.바이오잉크를 교차 연결하려면 인쇄된 구조를 섭씨 37도, 이산화탄소 세포 배양 기배기 5%에 30분간 배치합니다. 그런 다음 인쇄된 구조를 RPMI 1640 배지에 담그고 페니실린과 연쇄절제술의 밀리리터당 100단위를 보충합니다. 탈세포화 과정 후, 이중 좌초 된 DNA의 97.3 %가 제거되고 콜라겐 및 글리코사미노 글리칸과 같은 대표적인 세포 외 매트릭스 성분은 각각 1278.1 %와 96.9 %로 유지됩니다.본 대표적인 분석에서, pdECM 바이오잉크는 초당 약 10개의 파스칼값을 초당 10개의 전단 속도로 나타내며, 이는 바이오잉크가 노즐을 통해 압출에 적합한 유변학적 특성을 입증했음을 나타낸다. 또한, 바이오잉크의 복잡한 변조기는 온도가 섭씨 15도에 도달했을 때 증가하기 시작했고, 온도가 섭씨 37도에서 유지되면 급격히 증가하여 용액의 솔겔 전이를 나타낸다. pdECM 바이오잉크의 동적 G 프라임 및 G 더블 프라임은 인쇄 과정 후의 안정성을 보장하기 위해 생리학적으로 관련된 온도에서 조사되어 주파수 스윕 조건하에서 안정적인 계수를 달성했습니다.멀티헤드 프린팅 시스템을 사용하여, 3D 바이오프린팅을 목적으로 pdECM의 다재다능함을 입증한 개발된 pdECM을 사용하여 입증된 바와 같이 다양한 유형의 3D 구체가 조직과 같은 배열로 두 가지 이상의 살아있는 조직을 조화시킬 수 있습니다. 기포의 존재가 인쇄 해상도를 낮추고 세포 생존가능성을 감소시키기 때문에 세포 죽음과 기포 형성을 피하기 위해 바이오잉크를 세포와 혼합할 때 부드럽게 하십시오. 3D 췌장 조직 구조 내의 캡슐화된 췌장 섬의 기능은 면역 형광 염색 또는 포도당 내성 시험에 의해 평가될 수 있다.이 pdECM 바이오 잉크 및 3D 바이오 프린팅 기술은 잠재적으로 조직 공학 분야에서 기능성 췌장 조직 구조의 개발에 사용될 수 있습니다. 연구원은 날카로운 강판 및 시약을 취급할 때 부상을 방지하기 위하여 적당한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.

pancreatic-tissue-derived-extracellular-matrix-bioink-for-printing-3d

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Cartesian bioprinter는 정밀하고 재현 가능한 형상으로 다중 재료 증착을 허용하는 동시에 환경 요인을 제어할 수 있도록 설계 및 제작되었습니다. 3차원 바이오프린터를 사용하면 복잡하고 실행 가능한 구조를 인쇄하고 쉽게 복제할 수 있습니다.

세 디스펜서 데카르트 프린터 사용 Bioprinted 세포를 구축의 생존

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

여기에 제시된 것은 혈관 및 기타 관 구조의 조직 공학에 적합한 중공 비계의 한 단계 제작을 위한 사용이 간편한 코어/쉘, 3차원 생체 인쇄 설정입니다.

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.

골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

배우세요 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오잉크를 이용한 3D 바이오프린팅 기법으로 췌도 섬을 캡슐화하여 당뇨병 치료용 이식 가능한 조직 구조물을 제작하는 방법을 익히세요.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

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