Name: 투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양 방법으로 종양 분비 파라크린 리간드가 대식세포 활성화에 미치는 면역억제 효과를 연구하는 기술입니다. 이 방법은 세포 간 직접 접촉 없이 분비된 인자를 분석할 수 있어 종양 유래 면역 억제 메커니즘을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

에릭 우빌은 부분적으로 미국 암 학회 박사 후 펠로우십 (128770-PF-15-216-01-LIB)에 의해 지원되었습니다. 이 연구는 NIH(R01-CA205398)의 보조금과 유방암 연구 재단 상(BCRF-18-041)에서 HSE에 수여되었습니다.

유린 복막 대식세포의 수확 및 사용과 관련된 모든 절차는 채플 힐 (UNC)의 노스 캐롤라이나 대학에서 실시되었으며 UNC 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 대식세포 문화
참고: 이 절차는 1 차적인 맥기 대식세포 (아래에 자세히 설명함), 골수 유래 대식세포, 또는 J774 (ATCC) 또는 RAW264 (ATCC)와 같은 대식세포 세포주를 이용할 수 있습니다.
<ol><li>앞서 설명한 바와 같이 배차 후막대식세포(16,17 및 플레이트는 0.4 μm 폴리에스테르 막 삽입의 상부 챔버(들)로 직접 플레이트-배양 6웰 플레이트(도1A). 참고 : 각 격리에서 대식세포의 대략적인 수율은 총 1 x 106 셀이므로 웰 당 평균 세포 수는 6 개의 웰 플레이트에서 ~ 1.5 - 1.6 x 105 셀입니다.</li>
	<li>37°C에서 3일간 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)/F12, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1x 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)에서 수확한대식세포배양. 참고: 상부 챔버는 배양 배지 1 mL을 포함하고 하부 챔버는 1.5 mL로 채워집니다. 매개체를 각 챔버에 추가해야 합니다.</li>
</ol>2. 대식세포가 있는 종양 세포의 공동 배양
<ol><li>사용하기 전에, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 그들의 각각 배지에서 시판가능한 종양 세포를 배양한다.</li>
	<li>인산완충식염수(PBS)로 종양 세포를 한 번 세척하고, 0.05% 트립신 + 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양한다. 배지를 포함하는 FBS에 있는 세포를 다시 중단하고, 혈세포 계측기 또는 세포 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 정량화하고, 그 다음 펠릿에 220 x g에서 5 분 동안 원심분리기.</li>
	<li>원심분리 동안, 대식세포 함유 투과막 지지판의 상부 및 하부 챔버로부터 배지를 흡인하고 신선한 배지로 대체한다.<ol>
<li>종양 세포가 도금될 더 낮은 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 허용하기 위해 1.5 mL 대신 배지 1 mL로 채웁니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펠릿 된 종양 세포에서 배지를 흡인하고 DMEM / F12에서 10 % FBS, 1 x 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 3 x 105 세포 / mL의 농도로 20 ng / mL M-CSF로 세포를 재중단시냅니다.</li>
	<li>원하는 웰의 하부 챔버에 3 x 105 세포 / mL 종양 세포의 0.5 mL을 추가하십시오(그림 1B). 참고 : 세포는 즉시 치료 할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 공동 배양 세포의 치료
<ol><li>대식 세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도 하기 위해, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS를 추가 하 여 단일 또는 공동 배양 된 대 식 세포 치료.<ol>
<li>필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하고 일부 종양 매개 억제는 8h. 24h에 대한 공동 배양에 의해 발생하며 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 산출한다. 참고: 대안적으로, 대식세포는 인터류핀-10(IL10)과 같은 인자의 첨가를 통해 프로-상처 치유 표현형을 채택하도록 유도될 수 있고, 종양 분비 리간드의 효과 평가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>부정적인 통제로, 문화 대식세포는 개별적으로 처리되지 않은 둡니다. 긍정적인 대조군으로, 100 ng/mL IFNγ 및 50 ng/mL LPS로 싱어장배양된 대식세포를 치료하십시오.</li>
</ol>4. 공동 배양 세포의 다운스트림 분석
<ol><li>원하는 배양 시간이 경과한 후, 검사 필요에 따라 세포 가해 또는 컨디셔닝된 배양 배지를 원하는 대로 분리합니다.</li>
	<li>정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 세포 용해액을 분리하기 위해, 웰의 두 챔버에서 매질을 흡인하고 PBS의 2 mL로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 라해스 완충장치를 적용한다. 세포를 용해시키기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어 내고 RNA 절연 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 옮김을 전달합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서 제시된 공동 문화 분석법은 면역 세포 활성화에 종양 분비 요인의 연구를 허용하는 이전에 확립된 분석법의 수정입니다. 세포-세포 접촉은 면역 활동에 있는 변경을 유도하기 위하여 알려지는 동안, 면역 성 활성화를 조절하는 종양 분비 리간드의 기능은 잘 이해되지 않습니다. 우리는 직접적인 공동 배양과는 달리, 종양 유래 분비 요인이 접촉 매개 신호의 혼란스러운 특성 없이 면역 세포 활성화에 미치는 영향을 심문하는 데 사용될 수 있는 방법을 설명합니다. 면역 억제에 있는 종양 분비 된 리간드의 잠재적인 임상 중요성을 감안할 때, 이 방법은 직접적인 공동 문화에 의해 해결되지 않는 방법으로 이 기계장치를 공부하기 위하여 이용하기 쉬운 공구를 제안합니다.
본질적으로, 여기서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 종양 세포(세포주 또는 1차 세포)와 대식세포(1차 세포: 상주, 골수 유래 또는 대식세포 세포주)의 배양을 포함한다. 대식세포는 0.4 μm 크기의 폴리에스테르 멤브...

최근 연구는 면역 세포에 의한 검출을 피하고, 국소 면역 활성화를 억제하거나, 종양 미세 환경에서 내성 종양 허용 밀리를 생산하는 암세포의 능력에 초점을 맞추고 있다. 종양과 면역 세포 상호 작용의 2개의 넓은 종류는 이 효력을 촉진하는 기술되었습니다: 접촉 중재한 상호 작용 또는 종양 분비 한 리간드. 종양에 의해 이용되는 접촉 매개 면역 억제의 가장 잘 연구되고 임상적으로 견인가능한 메커니즘 중 하나는 그들의 활성화 및 기능을 억제하기 위해 T 세포에 PD-1과 상호 작용하는 PD-L1의 발현이다1,2. 다수의 활성화된 면역 세포에 의해 발현되는 인터페론 감마(IFNγ)에 반응하여, 종양 세포는 PD-L1의 발현을 증가시켜 활성 T 세포를 발현하여, 이를 효과적으로 종양 세포를 근절하지 못하게 한다3. PD-L1과 PD-1 사이의 상호 작용을 차단하는 항체의 사용은 현재 인간4에서여러 암 유형을 치료하는 데 사용된다. 이러한 임상적 성공 및 기타에 비추어, 종양 유래 면역억제 메커니즘의 식별 및 표적화는 점점 더 주목을 받고 있다.
적응 면역의 억제를 넘어, 종양은 또한 선천적인 면역 세포의 프로 염증 반응을 억제 하는 요인을 분 비 하는 것으로 알려져 있습니다. IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 및 콜로니 자극 인자(CSF-1)를 포함하는 종양 유래 또는 종양 유도 분비물, 종양 미세환경5,6,7에서자연살인자(NK) 세포, 과립구 및 수지상 세포의 항종양 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 종양 세포는 또한 종양 미세환경에서 골수성 유래 세포의 모집 및 분화를 왜곡하는 인자를 분비하여 T 세포활성화의억제를 촉진할 수 있다8,9.
종양 진행에 깊은 영향을 미치는 선천적인 면역 세포의 한 종류는 대식 세포입니다. 수년 동안, 종양 관련 대식세포(TAM)의 존재는 환자생존도 10의음성 예후로서 사용되어 왔다. 면역 억제 TAM이 종양의 면역 세포 매개 클리어런스를 약화시키는 개념은 40 년 전에11년 이상 소개되었습니다. 보다 최근에는, 대식세포 프로-염증 반응이 종양 미세환경에서 유도될 수 있는 동안 프로-종양 표현형이 하향 조절될 수 있음을 보여주었다. 이러한 면역억제 대식세포는 내성 반응에 기여할 수 있고, 종양 진행 및 화학요법및면역요법에대한 내성을 유도한다. 대식세포가 종종 종양과 함께 가장 풍부한 백혈구 중 하나라는 점을 감안할 때, 그들의 종양 특이적 면역 활성의 회복은 항암치료제(13)에대한 잠재적인 표적을 나타낸다.
종양 세포와 대식세포 사이의 접촉 매개 상호 작용은 직접 적인 공동 배양을 통해 모델링될 수 있는 동안, 투과성 막 지지체의 사용은 종양 분비 요인이 종양 면역 세포 세포 접촉의 잠재적으로 혼란스러운 영향 없이 면역 조절인 것을 해명할 수 있습니다. 다소 유사한 방법을 사용하여, 그 외는 중피 세포와 종양 세포뿐만 아니라 microglia/neuronal 상호 작용14에서 분비 된 인자를 식별할 수있는 잠재력을 입증했다15. 우리는 또한 LPS 및 인터페론 감마16을이용한 복막 대식세포의 자극 후 염증성 유전자 발현의 억제자로서 종양 분비 단백질, Pros1의 역할을 특성화하기 위해 이 공동 배양 기술을 성공적으로 사용하였다. 여기에서 우리는 종양 분비 요인이 대식세포 활성화에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 를 심문하기 위하여 이용될 수 있는 간단한 방법론을 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 합성 키트</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 배지</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>대장균 O111:B4의 지질다당류</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IFN&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX 키트</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>트랜스웰 투과성 서포트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

종양 유래 paracrine 신호는 국부적인 면역 억제의 간과된 분대이고 지속적인 암 성장 및 전이를 위한 관대한 환경으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라크린 신호는 T 세포의 표면에 PD-1과 직접 상호 작용하는 종양의 표면에 발현된 PD-L1과 같은 상이한 세포 유형 간의 세포 접촉, 또는 면역 세포에 영향을 미치는 종양 세포에 의한 리간드의 분비를 포함할 수 있다. 여기서 우리는 면역 세포(대식세포) 활성화에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 심문하는 공동 배양 방법을 설명한다. 이 간단한 절차는 시판된 0.4 μm 폴리 카보네이트 멤브레인 투과성 지지대 및 표준 조직 배양 판을 이용합니다. 기재된 과정에서, 대식세포는 하부 챔버 내의 상부 챔버 및 종양 세포에서 배양된다. 0.4 μm 장벽의 존재는 두 세포 유형이 파라크린 리간드에 동일한 배지 및 노출을 공유하기 때문에 물리적 접촉의 혼란스러운 변수없이 세포 간 신호의 연구를 허용합니다. 이 접근법은 대식세포(예를 들어, 유전적 녹아웃 마우스로부터의 분리) 또는 종양(예를 들어, CRISPR 매개 변경)의 유전적 변경과 같은 다른 사람들과 결합되어 특정 분비 된 인자 및 수용체의 역할을 연구할 수 있다. 이 접근법은 또한 두 세포 집단을 분리하기 위한 유동 선별없이 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 분자 생물학적 분석에 적합합니다. 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)은 유사하게 분비 된 리간드를 측정하여 다중 세포 유형 컨텍스트에서 세포 신호의 동적 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 활용될 수 있다. 동시 조절 된 사건의 연구를 위해 공동 배양 기간은 또한 다양 할 수 있습니다. 이 공동 배양 방법은 면역 문맥에서 종양 분비 된 신호의 연구를 용이하게하는 강력한 도구입니다.

대식세포 편광에 대한 종양 분비 리간드의 효과를 확인하기 위해, 기재된 절차를 활용하였습니다. 종양 세포의 부재에서 배양된 맥막 대식세포는 음성(치료되지 않은 = 멀리 왼쪽) 및 양성(IFNγ 및 LPS 자극 = 왼쪽으로부터2nd) 대조군(도2A)으로사용하였다. 대안적으로, 맥막 대식세포는 B16F10 흑색종 종양 세포(ATCC)와 공동 배양하였다(도1A). 도금 직후, 세포는 IFNγ 및 LPS로 처리하거나 치료되지 않은 상태로 방치하였다. 배양 24시간 후, 대식세포를 수확하고, RNA를 제조하고, qRT-PCR을 수행하여 염증성 유전자의 발현을 측정하였다. 여기에 기재된 공동 배양 시스템을 사용하여, 우리는 B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양된 맥막 대식세포가 활성화되지 않았지만 자극(LPS + IFNγ)을 활성화시키지 않고, 염증성-관련 유전자의 발현을 증가시키지 않았다는 것을<stron...

여기서, 우리는 종양 세포가 면역 반응을 억제하기 위해 사용하는 비접촉 파라크린 신호의 연구를 용이하게 하기 위해 투과막 지지대를 사용하는 방법을 제시한다. 시스템은 대식세포 활성화를 약화시키는 종양 분비 인자의 역할을 연구할 수 있습니다.

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

이러한 트랜스웰 공동 배양 방법은 종양 세포가 면역 반응을 억제하는 데 사용되는 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용된다. 이 방법은 새로운 분비 리간드뿐만 아니라 면역 억제 효과의 기계론적 기초를 발견하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 종양 분비 요인이 대식세포 프로 염증 유전자 전사를 약화시킬 수있는 방법을 보여주기 위해이 방법을 사용했다.우리는 이 공구가 종양 유래 면역 억제의 연구 결과에 있는 광범위한 연루가 있다고 믿습니다. 이 기술의 주요 장점 중 하나는 세포 대 세포 접촉의 잠재적으로 혼동 변수없이 종양 세포와 면역 세포 사이의 파라크리인 신호를 연구하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 플랫폼은 또한 다운스트림 분석을 위한 다양한 분자 생물학적 기술에 적합합니다.수막 대식대를 수확 한 후 0.4 마이크로 미터 폴리 에스테르 멤브레인의 상부 챔버로 직접 판화하여 공동 배양 6 웰 플레이트를 삽입하십시오. 그런 다음 상부 챔버에 1 밀리리터를 포함하고 하단 챔버는 1.5 밀리리터를 포함하도록 우물에 보충 DMEM을 추가했습니다. 이산화탄소 5%를 37도에서 3일간 배양합니다.첫째, ATCC 권장 조직 배양 방법에 따라 각각의 배지에서 상용화 가능한 종양 세포를 배양한다. 다음으로, PBS로 부착된 종양 세포를 한 번 씻는다. EDTA에 0.05%의 트립신을 추가하고 세포가 분리될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.그런 다음 FBS를 포함하는 매체에서 세포를 다시 일시 중단합니다. 혈혈계 또는 세포 카운터를 사용하여 총 세포 수와 원심분리기를 5분 동안 220배 G에서 양수화한다. 원심분리 하는 동안, 투과성 멤브레인 지지판을 포함하는 대식대식의 상부 및 하부 챔버에서 배지를 흡인하 고 신선한 매체로 대체 한다.종양 세포가 도금될 하부 챔버의 경우, 세포 첨가를 위한 충분한 부피를 남기기 위해 1.5 밀리리터 대신 배지 1밀리리터로 채우십시오. 원심분리가 완료되면, 펠릿 종양 세포로부터 배지를 흡인시키고 밀리리터당 300, 000세포의 농도로 보충DMEM에서 세포를 다시 중단한다. 원하는 우물의 하부 챔버에 이 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 추가합니다.대식세포 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기 위해 밀리리터 당 100 나노 그램의 농도에 인터페론 감마를 첨가하여 밀리리터 당 50 나노 그램의 농도로 심백성 또는 공동 배양 대식세포를 치료하십시오. 필요에 따라 문화에서 치료 시간의 기간을 변경합니다. 대식세포 활성화는 2시간 이내에 발생하며, 일부 종양 매개 억제는 8시간 이내에 발생합니다.24시간 동안의 공동 배양은 견고하고 일관된 종양 유래 억제를 낳습니다. 부정적인 제어로, 문화 대식세포는 노래하고 치료되지 않은 둡니다. 양수 조절으로, 시료에 사용되는 것과 동일한 농도에서 인터페론 감마 및 LPS로 노래배양 된 대식세포를 치료하십시오.원하는 잠복기 시간이 경과한 후, 테스트 요구에 따라 원하는 대로 세포 리세테 또는 조건 배양 배지를 분리한다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 위해 세포 용액을 분리하고, 우물의 양 챔버에서 배지를 흡인하고 PBS의 2밀리리터로 한 번 세척한다. 대식세포가 함유된 상부 챔버에 RNA 리시스 버퍼를 적용합니다.그 후, 세포를 용액을 방출하고 RNA 격리 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 추가 처리를 위해 수집 튜브로 전송하기 위해 멤브레인을 부드럽게 긁어낸다. 여기에서 기술된 공동 배양 방법은 물리적 접촉 없이 대식세포 및 종양 세포의 배양을 포함한다. 종양 세포의 부재에서 배양 된 회대식은 음수 및 양성 대조군으로 사용된다.B16F10 종양 세포의 존재에서 공동 배양되는 회대대세포는 자극을 활성화하지 않고 는 프로 염증 관련 유전자의 발현을 증가시키지 않는다. 이것은 종양 분비리 리간드가 스스로 프로 염증 성 유전자 발현을 유도하기에 충분하지 않거나 종양 분비에 의한 면역 활성화가있는 경우 파라크리네 리간드가 네이티브 수준으로 억제하기에 충분하다는 것을 의미합니다. 이러한 공동 배양 방법은 인터페론 감마 및 LPS에 의해 편광되는 대식세포가 종양 세포의 존재에서 배양될 때, 염증 관련 유전자 발현의 억제가 60%만큼 감소되었다는 것을 보여 주며, 뮤린 대식세포 세포주 J774가 코테톤 대식세포세포간을 대체할 때 유사한 수준의 대식세포증유전자 억제가 관찰된다.이전 연구는 단백질 S를 대식세포 활성화를 억제할 수 있는 종양 분비인자로 확인하였기 때문에 투과성 멤브레인 지원 공동 배양 모델은 lysA와 함께 24시간 후 조건부 배지에서 단백질 S의 농도를 분석하는 데 사용된다. 인터페론 감마 및 LPS 처리B16F10 흑색종 세포로부터 의 조건된 매체에서, 단백질 S는 밀리리터 당 대략 475 나노그램의 농도로 표현됩니다. 동일한 조건에서 치료된 회대대식은 밀리리터당 약 61 나노그램에서 단백질 S를 표현하였다.흥미롭게도, 공동 배양시, 인터페론 감마 및 LPS 처리 우물에서 단백질 S의 농도는 밀리리터 당 약 86 나노그램이었다. 이는 대식세포가 종양 분비 단백질 S를 섭취하거나 B16F10 세포에 의해 분비되는 단백질 S의 양이 대식세포의 존재시 실질적으로 감소한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 대식세포가 종양 세포와 공동 배양될 때 대식세포 활성화 및 파라크리안 신호의 심오한 변화를 강조한다.Transwell 공동 문화 방법은 파라크리인 신호와 관련된 다양한 질문에 대답할 수 있습니다. 서양 얼룩 분석은 종양 분비 단백질이 대식세포에 있는 각종 신호 통로를 변경하는 방법을 결정하기 위하여 실행될 수 있었습니다.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 공동 배양에서 대식세포 식세포작용의 중간엽 줄기세포(MSC) 조절을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. MSC를 대식세포와 공동 배양할 때, pH에 민감한 형광단에 접합된 비옵소니즈(non-opsonized) 자이모산 입자가 첨가되어 대식세포에 의해 식세포화됩니다. phagocytosis가 증가함에 따라 형광 강도가 증가하여 식세포 활성의 MSC 매개 조절을 결정할 수 있습니다.

중간엽 줄기세포에 의한 대식세포 식세포작용(macrophage phagocytosis)의 조절을 연구하기 위한 분석

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Paracrine juxtacrine 세포 상호 작용 종양 진행, 면역 반응, 신생, 개발 등 많은 생물 학적 과정에 중요 한 역할을 한다. 여기, 인접 문화 메서드 secreted 요소의 지역화 된 농도 세포에 직접 접촉을 방지 하는 동안 유지 됩니다 paracrine 신호 연구에 사용 됩니다.

Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

본 문서는 대식세포를 유치하기 위해 종양 세포로부터 조절된 배지의 능력을 평가하는 유용한 시험관내 분석방법을 나타낸다.

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

암세포, 특히 4T1 마우스 유방 암종 세포에 대한 대식세포 식세포 활성은 본 연구에서 영상화되었다. 살아있는 세포 동배 모델은 형광및 차동 간섭 대조 현미경의 조합을 사용하여 확립되고 관찰되었다. 이 평가는 이미징 소프트웨어를 사용하여 멀티포인트 타임랩스 비디오를 개발하는 데 사용되었습니다.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

여기에서는 3차원(3D) 콜라겐 I 매트릭스에서 1차 인간 단핵구 유래 대식세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 조사하기 위한 프로토콜을 제시하며, 미세환경의 용해성 및 물리적 특성이 세포 침입에 미치는 영향을 비교할 수 있습니다.

대식세포-종양 스페로이드 동시 침습 분석

인간 CART와 골수 세포 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 제한된 이종이식 모델을 감안할 때, 우리는 CART 세포에 대한 인간 대식세포의 영향을 이해하기 위해 시험관 내 및 생체 내 모델을 확립했습니다. 연구 결과는 종양 미세 환경에서 대식세포 역할을 평가하고 대식세포 표적 면역 요법을 테스트하기 위해 잠재적으로 일반화될 수 있습니다.

시험관 내 및 생체 내 골수 세포와 CAR T 세포 간의 상호 작용 연구

배우세요 투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양 방법으로 종양 분비 파라크린 리간드가 대식세포 활성화에 미치는 면역억제 효과를 연구하는 기술입니다. 이 방법은 세포 간 직접 접촉 없이 분비된 인자를 분석할 수 있어 종양 유래 면역 억제 메커니즘을 정밀하게 규명할 수 있습니다.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

더 많은 동영상 탐색