후성유전학 기반 정량적 PCR을 이용한 면역 세포 정체성 및 순도 측정
February 19th, 2020
여기에서 우리는 정량적 PCR (qPCR)를 사용하여 검출된 후생유전학 서명을 통해 면역 세포 정체성 및 순도를 결정하는 강력한 방법을 기술합니다. 특정 궤적에서의 DNA 탈메틸화는 특정 세포 유형에 대한 고유 식별자역할을 하며 CD8+, 조절 또는 Th17 T 세포의 식별을 허용합니다.
이 프로토콜은 면역 세포 정체성 과 순도를 결정하는 표준화 된 방법을 제공하고, 큰 샘플 요구 사항, 사용자 가변성 높은 사용자 및 주관적인 데이터 분석과 같은 흐름 세포측정의 한계를 해결합니다. 이 분석에는 사용자가 면역 세포 정체성과 순도를 객관적으로 평가할 수 있는 자동화된 데이터 분석 템플릿이 포함되어 있습니다. 이것은, 다중 분석 대조군과 더불어 면역 세포 정체성 및 순도를 평가하기 위한 턴키, 쉽게 표준화된 방법을 제공합니다.
이 기술을 시연하는 것은 우리 실험실의 과학자 인 제리 구즈만 (Jerry Guzman)이 될 것입니다. 관심있는 조혈 세포 샘플에서 게놈 DNA 절연 후, 260, 280 및 230 나노미터에서 광학 밀도를 얻어 분광계에 샘플의 순도를 측정하기 위해 게놈 DNA의 마이크로 리터를 사용합니다. 다음으로 게놈 DNA 샘플의 400~1200나노그램을 유전체 DNA 격리 키트로부터 용출 버퍼를 가진 142마이크로리터의 최종 부피에 희석한다.
교정 버퍼 67마이크로리터에 교정기 75마이크로리터를 추가합니다. 및 1200 나노그램의 기준 게놈 DNA를 용출 완충제를 가진 142마이크로리터의 총 부피로 희석한다. 그런 다음 튜브를 56도에서 5분 동안 배양하고 열 믹서에서 분당 900회전을 배양합니다.
비설피트 변환을 위해 모든 튜브에 270 마이크로리터의 암모늄 비설피테와 90 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 철저한 혼합을 보장하기 위해 튜브를 소용돌이. 샘플을 잠시 회전하여 액체를 수집하고 튜브를 45분 동안 섭씨 80도, 분당 900회전으로 배치합니다.
그런 다음 샘플을 다시 잠시 회전시키고 3~5분 동안 실온으로 식힙니다. 양성환 변환 다음 DNA 정제를 위해 DNA 격리 파라자성 구슬을 30초 동안 소용돌이시다. 병에 나열된 볼륨에 따라 세척 버퍼에 에탄올과 이소프로판올을 추가합니다.
구슬이 완전히 다시 중단될 때까지 다시 소용돌이가 되고 870 마이크로리터의 용해 결합 완충제와 각 튜브에 대한 DNA 결합 파라마그네틱 비드의 105 마이크로리터에서 다시 소용돌이합니다. 샘플을 잠시 회전하기 전에 튜브가 섞여 소용돌이합니다. 각 튜브에 570 마이크로리터2프로판올을 넣고 소용돌이에 섞습니다.
실내 온도에서 7분, 분당 50RPM의 튜브를 배양한 후 튜브를 다시 잠시 회전시키고 5분 동안 자기 랙에 놓습니다. 인큐베이션의 끝에서 구슬을 방해하지 않고 슈퍼네이트를 제거합니다. 버퍼 1로 샘플을 씻고 튜브를 소용돌이시다.
간단한 원심 분리 후 튜브를 3 분 동안 랙에 다시 배치하고 구슬을 방해하지 않고 슈퍼네이트를 제거합니다. 세척 버퍼 2로 샘플을 두 번 씻고 튜브를 섭씨 65도에서 15 분 동안 건조시하십시오. 다음으로 각 튜브에 60개의 마이크로리터 진화 버퍼를 추가합니다.
실온에서 7분 동안 인큐베이션을 하고 분당 1400회 회전한 후, 튜브를 잠시 회전시키고 튜브를 자석으로 2분 동안 되돌린다. 배양 전달의 끝에서 55 비설피테의 마이크로 리터는 구슬을 방해하지 않고 새로운 튜브로 함유 된 DNA를 변환. 샘플에서 정량적 PCR을 실행하려면 양량 PCR 소프트웨어에 각 표준작업 표준을 할당하고 테이블에 따라 최종 복사 번호를 지정합니다.
표준 DNA의 직렬 희석을 준비하고 대상 세포 유형에 대한 1 개의 정량적 PCR 마스터 믹스 칵테일을 준비합니다. 그리고 테이블에 따르면 GAPDH에 대한 하나의 정량적 PCR 마스터 믹스 칵테일. 템플릿 DNA의 마이크로리터 3개를 96개의 잘 둥근 하단 플레이트의 적절한 우물에 적재한 다음 마스터 믹스의 7마이크로리터를 넣습니다.
모든 우물이 적정 PCR 필름으로 플레이트를 밀봉하고 정량PCR 기기에 적재하기 전에 플레이트를 잠시 회전시합니다. 그런 다음 테이블에 표시된 대로 반응을 실행합니다. 실행 완료시 정량적 PCR 데이터를 txt 또는 xlsx 파일로 내보냅니다.
양성환을 정화한 후, DNA의 25 마이크로리터를 입증한 바와 같이, 파라자성 비트로 DNA를 변환하였다. 비설핏변환 된 DNA를 새로운 튜브로 옮기고 샘플의 마이크로리터 2개를 개별 PCR 스트립 튜브에 추가합니다. 템플릿 제어 튜브에 두 개의 마이크로리터를 추가하고 테이블에 따라 모든 샘플에 대한 사전 증폭 마스터 믹스를 준비합니다.
각 튜브와 캡, 소용돌이에 마스터 믹스 23 마이크로리터를 추가하고 튜브를 잠시 회전시합니다. 그런 다음 가열된 뚜껑을 사용하여 열 사이클러에서 사전 증폭 프로토콜을 실행합니다. 실행이 완료되면 튜브를 잠시 회전시키고 증폭 된 DNA의 마이크로 리터로 새로운 튜브로 옮습니다.
그런 다음 78 마이크로 리터의 물로 샘플을 1 ~ 40 농도로 희석하고 입증 된 바와 같이 시료의 정량적 PCR을 실행합니다. 여기서, 유동 세포측정및 메틸화 분석제를 모두 사용하여 3개의 상이한 기증자로부터 말초 혈액, 단핵세포 및 T 세포를 모두 분석하여 얻은 CD8+T 세포 분석에서 대표적인 데이터가 나타난다. 두 세포 모형에 있는 모든 기증자에 걸쳐 2개의 방법 사이 동향은 유사했습니다.
Treg 분석기의 이러한 대표적인 데이터는 메서드 간에도 유사한 결과를 보여 준다. 그러나, 모든 경우에, 이 메틸화 분석 자극 및 자극 되지 않은 조건 에서 더 높은 값을 산출. 각 분석의 민감도 및 특이성은 공백 제한, 탐지 제한 및 수량 제한 값에 의해 입증되었습니다.
이 분석은 자동화된 데이터 분석 템플릿을 제공하므로 객관적인 분석을 개선하고 표준화 기능을 향상시킵니다. 이것은 일관된 세포 치료 제품을 만드는 데 표준화된 방법이 중요한 세포 치료 제조에 이상적입니다.
개요
이 기사는 정량적 PCR(qPCR)으로 검출된 후성 유전 서명을 사용하여 면역 세포의 정체성과 순도를 결정하는 표준화된 방법을 제시합니다. 이 방법은 유세포 분석의 한계를 해결하고 객관적인 평가를 위한 자동화된 데이터 분석 템플릿을 제공합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포 생물학
- 후성 유전학
배경
- 유세포 분석과 같은 전통적인 방법에는 높은 가변성과 많은 샘플 요구 사항과 같은 한계가 있습니다.
- 후성 유전 서명은 특정 면역 세포 유형의 고유 식별자로 사용될 수 있습니다.
- 세포 분석의 표준화는 연구 및 치료에서 일관된 결과를 얻는 데 중요합니다.
- 이 방법은 면역 세포 특성화의 신뢰성을 향상시킵니다.
연구 목적
- 면역 세포의 정체성 및 순도를 식별하고 평가하는 견고한 방법을 개발합니다.
- 사용자 가변성을 최소화하는 유세포 분석의 대안을 제공합니다.
- 세포 치료 제조 시 분석의 표준화를 강화합니다.
사용된 방법
- 조혈 세포 샘플로부터 유전체 DNA 분리.
- DNA 메틸화 분석을 위한 비설파이트 전환.
- 후성 유전 서명을 측정하기 위한 정량적 PCR.
- 결과의 객관적인 평가를 위한 자동화된 데이터 분석.
주요 결과
- 메틸화 분석은 다양한 세포 유형에서 유세포 분석에 비해 더 높은 값을 보였습니다.
- CD8+ T 세포 및 조절 T 세포에 대한 분석에서 유사한 추세가 관찰되었습니다.
- 분석은 높은 민감도와 특이성을 보였습니다.
- 자동화된 분석은 결과의 객관성과 표준화를 개선했습니다.
결론
- 이 방법은 면역 세포 분석을 위한 신뢰할 수 있는 대안을 제공합니다.
- 표준화는 연구에서 결과의 재현성을 향상시킵니다.
- 이 접근 방식은 세포 치료 제조의 응용에 유익합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Accurate immune cell identity and purity assessment is critical for cell therapy development, impacting both product consistency and regulatory compliance. This epigenetic-based qPCR method addresses the limitations of flow cytometry by enabling objective, high-throughput, and standardized quantification of immune cell subtypes. Its robust, automated analysis supports reliable in-process and product release testing, enhancing predictive confidence at key manufacturing inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of immune cell subtypes for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by leveraging cell-type specific epigenetic markers.
- Supports predictive confidence in immune cell-based therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated immune cell populations for downstream assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through automated data analysis.
- Enables high-throughput, quantitative assessment of cell identity and purity.
- Supports reliable evaluation of cell therapy product attributes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell characterization with translational biomarker requirements.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by standardizing cell identity assessment.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative purity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the cell therapy pipeline from early discovery through manufacturing quality control, supporting both lead identification and product release.
- Discovery Biology: Provides quantitative, cell-type specific data for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, reproducible outputs suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Generates quantitative purity and identity metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for immune cell analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in cell therapy development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in immune cell characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, objective data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomic DNA isolation, bisulfite conversion, and qPCR analysis.
- Needs access to spectrophotometry, thermal mixers, magnetic racks, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis templates.
- Adaptation may be needed for different immune cell subtypes or sample sources.
- Assay sensitivity and specificity are defined by established limits of blank, detection, and quantitation.
