Name: 전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 격리된 돼지 심장 모델을 이용한 심장 역학 및 전기생리학 연구 방법을. 이 기법은 이중 방출 광학 매핑과 전기생리학을 결합하여 심장 전기 활동을 평가하고 질병 모델링 및 약리학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자들은 매튜 케이 박사에게 유용한 실험지도를, 마넬 라마단과 무하이민 차우두리가 기술 지원을 해주신 것을 감사하게 도모합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다 (NGP에 R01HL139472, R01 HL139712 NI에), 어린이 연구소, 어린이 국립 심장 연구소와 소아 외과 혁신을위한 셰이크 자이드 연구소.

저자는 공개 할 것이 없다.

심혈관 연구 모델은 세포에서 생체 내 제제에 이르기까지 다양하지만 임상 관련성과 실험 적 유용성 사이에는 내재된 절충안이 있습니다. 이 스펙트럼에, 고립 된 Langendorff-perfused 심장 심장 생리학 공부에 대 한 유용한 타협 남아48. 전체 심장 모델은 단일 세포 또는 조직 단층보다 더 높은 수준의 기능적 및 구조적 통합을 나타내지만 생체 내 모델과 관련된 혼란스러운 복잡성을 방지합니다. 이중 광학 매핑 실험 중 주요 장점은 분리된 심장의 후피나표면이 관찰될 수 있고, 막 전위와 칼슘 처리의 형광 이미징이 심장 생리학을 모니터링하는데 사용될 수 있다는 것이다34.
설치류 모델은 관련된 모든 요소(예: 용액 부피, 관류 회로, 염료 및 기계적 비커플러 수량)를 업사이징하는 관련 비용으로 인해 더 큰 동물과 는 반대로 고립된 심장 제제에 가장 일반적으로 사용됩니다. 큰 동물10,36,49에서부정맥에 대한 더 큰 불안정성과 성향과 함께. 돼지 하트를 사용하는 한 가지 장점은 구조, 크기 및 수축 속도에 있어 인간의 심장과 밀접하게 유사하므로 관상 동맥 혈류 및 심장 출력과 같은 혈역학적 매개 변수를 보다 정확하게 모델링한다는 것입니다. 마찬가지로, 인간과 돼지는 유사한 칼슘 처리, 심전도 간격37,및12,50,51을나타내는 기본 채널을 포함하는 행동 잠재적 인 형태를 가지고있습니다. 52. 이 프로토콜은 심근 기능을 포괄적으로 특성화하기 위해 재현 가능한 대형 동물 모델을 만드는 단계를 자세히 설명합니다. 확립된 전기 생리학적 프로토콜과 함께 사용되는 막외 전압(RH237)과 세포내 칼슘(Rhod2)의 동시 이미징은 심장 의 변화된 메커니즘을 정확히 파악할 수 있는 기회를 제공합니다. 함수. 기재된 방법론은 전임상 안전성 시험, 독성 학적 스크리닝 및 유전 적 또는 기타 질병 병리의 조사에 사용될 수 있다. 더욱이, 기재된 방법론은 특정 연구포커스53,54,55에따라 다른 심장 모델(예를 들어, 개, 인간)과 함께 사용하기 위해 수정 및 적응될 수 있다.
작은 설치류 모델에서 고립된 전체 심장 준비를 위한 더 큰 돼지 모델로 전환할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 수정 사항이 있습니다. 준비 및 설정 하는 동안, 우리는 온 코 압력을 유지 하 고 부 종 (플러스 안티 폼, 필요한 경우)56,57,58,59를줄이기 위해 향수에 알부민을 추가 하는 것이 좋습니다. 더욱이, 알부민을 함유하는 향수는 또한 매체60,61에지방산 보충을 요구하는 대사 연구에 도움을 주어 도포할 수 있다. 설치류 심장과 는 달리, 더 큰 돼지 심장은 더 나은 온도를 유지하는 관상 동맥 혈관을 통해 흐르는 온난화 매체의 증가 된 부피와 부피의 작은 표면으로 인해 따뜻한 매체에 잠길 필요가 없습니다. 앞서 언급했듯이, 우리는 우심실 내부와 우심실과 좌심실의 후두면 에피나얼 표면에 온도 프로브를 배치하여 연구 기간 동안 세 위치에서 1-2 °C의 약간의 온도 변동만 관찰했습니다. 중요한 것은, 이러한 빠른 유량은 또한 거품과 잠재적 인 색전증의 가능성을 증가시킬 수있다. 이 문제를 우회하려면 대동맥 캐뉼라로 곧장 이어지는 대형 보어 튜브가있는 버블 트랩을 사용하는 것이 좋습니다. 유사 하 게, 우리는 더 큰에 대류를 캐뉼을 위해 함께 작업 하는 두 개인을 가장 유용 발견 (그리고 무거운) 심장; 한 사람은 튼튼한 지혈대와 대류를 열고 다른 하나는 탯줄 테이프를 사용하여 카눌라에 대류를 고정합니다. 설명된 방법론에서, 우리는 심전도 및 제세동을 가진 관류가 설치류 심혼 준비에 반대되는 심장 회복에 생명이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 우리의 경험에서, 단지 몇 절제된 마음은 심장 전환없이 정상적인 부비동 구동 활동을 재개.
광학 화상 진찰 끝점을 향상시키기 위하여는, 매달려 심혼 준비는 침수한 심혼으로 생길 수 있는 눈부심의 효력을 제한했습니다. 더욱이, 매달려 있는 심혼은 또한 수직 화상 진찰을 위해 수평으로 심혼을 놓을 때 생길 수 있는 심혼의 후방 양상에 관상 동맥 혈관의 어떤 압축 또는 타협든지 피합니다. 우리는 또한 버블 트랩 (대동맥 캐뉼라에 가까운) 후에 형광 염료를 적재하는 것이 조직 염색 및 광학 신호를 크게 향상시켰습니다. 마지막으로, 심장 전기 생리학 종점을 개선하기 위해, 더 큰 동축 자극 전극의 사용은 성공적인 심방 진행을 촉진. 우리는 다양한 EP 매개 변수에 대한 캡처 및 캡처 손실을 식별하기 위해 심전도의 사용을 설명하지만, 심장 내 카테터 또는 양극성 기록 전극도 사용할 수 있습니다.
우리의 연구 결과는 고립된, 온전한 돼지 심혼 모형에 있는 이중 광학 매핑 및 심장 전기 생리학 평가를 위한 방법론을 개발에 집중되었습니다. 청소년 인간의 심장과 유사성으로 인해 돼지 심장은 소아 심장학 또는 선천성 심장 결함에 초점을 맞춘 연구를위한 인기있는 모델로 남아 있습니다. 중요한 것은, 설명된 접근법은 더 큰 크기의 성인 하트 및/또는 관심의 다른 종과 함께 사용하도록 적응될 수 있다. 실제로, 다른 실험실은 개 또는 인간의 마음 (기증자 또는 병든)의 사용이 그들의 특정 연구 초점53,54,55에더 적용 가능하다는 것을 발견 할 수있다. 이 연구의 또 다른 잠재적 인 제한은 이미징 중에 운동 아티팩트를 줄이기 위해 기계적 비커플러를 사용하는 것입니다. Blebbistatin은 심전도 매개 변수, 활성화 및 내화 기간41,62,63에대한 최소한의 효과로 인해 심장 이미징 응용 분야에서 선택의 비커플러가되었습니다. BDM은 더 많은 양의 이과 및 기계적 비커플러를 필요로 하는 대규모 동물 연구에서 특히 중요할 수 있는 덜 비싼 선택이지만, 작용 잠재력을 바꿀 수 있는 칼륨과 칼슘 전류에 더 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 형태64,65,66,67. BDM을 사용하는 경우 APD 단축은 충격 유발 아린스미아스68에대한 심장 취약성을 증가시킨다는 점에 유의하십시오. 반대로, blebbistatin을 사용하는 주요 제한은 광과민성 및 광독성이지만 이러한 효과를 감소시킨 대체 제형은69,70,71입니다. 마지막으로, 설명된 방법론은 이중 광학 매핑 실험을 위해 단일 카메라 시스템을 활용하지만 심실 세동 및/또는 상피 표면에서 전기파 추적에 초점을 맞춘 연구 결과에 유의해야 합니다. 다른 사람에 의해 설명 된 대로 3 차원 파노라마 이미징을 포함 하기 위해이 접근 방식을 수정 해야15,19,72,73,74, 75 .

심혈관 질환은 전 세계적으로 질병과 사망의 주요 원인입니다. 이와 같이, 1 차적인 연구 초점은 일반적인 심장 생리학 및 인간에 있는 이환율 그리고 사망에 기여할 수 있는 근본적인 기계장치를 공부하기 위하여 이용될 수 있는 방법론을 낙하하는 것입니다. 기본 심장 혈관 연구는 전통적으로 설치류와토끼를포함한 작은 동물 모델에 의존하고있다1,2,3,때문에 유전자 변형 종의 가용성4,5, 더 낮은 비용, 더 작은 실험 발자국 및 더 높은 처리량. 그러나, 돼지 모델의 사용은 보다 임상적으로 관련된 데이터를 제공할 가능성이있다 6. 실제로, 이전 연구는 인간과 돼지 사이의 심장 전기 생리학 (EP)에서 유사 이온 전류7,동작 전위 모양8및 약리학적시험에대한 반응을 포함하여 9. 더욱이, 돼지 심장은 설치류 또는토끼(10)보다인간과 더 유사한 수축성 및 이완 역학을 가지고 있다. 개 모델에 비해, 돼지 관상 동맥 해부학은 더 밀접하게 인간의 심장과 유사11,12 심장 발달에 초점을 맞춘 연구에 대한 선택의 모델입니다, 소아 심장학 및 / 또는 선천성 심장 결함 13. 돼지와 인간의 심장8사이에 차이가 있지만, 이러한 유사성은 돼지 심장을 심장 혈관 연구를위한 가치있는 모델로14.
심장의 역행 관류는 오스카 랑엔도르프16에의해 처음 설립된 이래로 심장 역학 ex vivo15를 연구하기 위한 표준 프로토콜이 되었다. 따라서, 랑엔도르프 관류는 자율적 영향이 없는 상태에서 고립된, 온전한 심장을 지원하는 데 사용될 수 있다. 이 모델은 심장 전기 생리학과 건강하지 않은 심장 사이의 수축성을 직접 비교하는 데 유용한 도구입니다. 심장 역학은 시간적으로 그리고 공간적으로 복잡하기 때문에, 한 지역에 있는 경미한 변경은 극적으로 syncytium17로 일하는 전체 심혼의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 파라미터 민감한 염료의 높은 시공간 화상 진찰은 심혼의 표면에 걸쳐 심장 기능을 감시하기 위한 유용한공구18,19. 실제로, 전압 및 칼슘에 민감한 형광 프로브의 동시 이중 이미징은 조직 수준20,21에서전기 활성, 칼슘 처리 및 여기 수축 커플링의 평가를 허용합니다. 22,23,24,25,26,27,28. 랑엔도르프 관류 및/또는 광학 매핑 기술은 이전에 노화 또는 유전 적 돌연변이로 인한 심장 성능 저하를 문서화하고 약리작용제 또는 환경 노출의 안전성을 평가하는 데 사용되었습니다29 ,30,31,32,33.
임상 환경에서, 침략적인 심장 전기 생리학 연구는 수시로 심장 리듬 소요를 조사하고, 병리학을 확인하고, 가능한 처리 선택권을 찾아내기 위하여 이용됩니다. 유사하게, 우리는 부비동 노드 기능을 평가하고, 방실 전도를 측정하고, 심근 조직의 내화성을 확인하는 데 사용될 수 있는 EP 프로토콜을 기술합니다. 기재된 EP 연구는 고립된 심혼에 있는 심장 생리학을 완전하게 특성화하기 위하여 광학 매핑, 또는 안과엽(34)과함께 수행될 수 있다. 기재된 프로토콜에서, 높은 시공간적 분해능 형광 이미징은 이중 방출 설정에서 전압(RH237) 및 칼슘(Rhod-2AM) 염료의 조합으로 수행되었다. 추가적으로, 심장 전기 생리학 파라미터는 부비동 리듬 및 프로그램된 전기 자극에 응하여 둘 다의 밑에 감시되었습니다.

<table><tbody><tr><td>(-)-블레비스타틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0560-5MG</td><td>기계식 언커플러</td></tr><tr><td>2,3-부탄디온 모노심(BDM)</td><td>시그마-알드리치</td><td>B0753-100G</td><td>기계식 언커플러</td></tr><tr><td>알부민</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>아날로그 신호 인터페이스</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>소포제</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>소포제 Y-30 에멀젼</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>대동맥 캐뉼라, 5/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>버블 트랩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>카메라, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>동축 자극 전극(심방)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td>제세동기</td><td>Zoll</td><td>M 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>이색성 미러</td><td>크로마 기술</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>차동 증폭기</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터, 칼슘</td><td>크로마 기술</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>방출 필터, 전압</td><td>크로마 기술</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>EP 자극기(블룸)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>여기 필터</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>여기 조명</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>필터</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>필터 카트리지, 폴리프로필렌</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>필터 하우징</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>유량 변환기</td><td>Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>가열 코일</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Hemofilter</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Image Splitter</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>대형 보어 튜빙, ID 3/8"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 50mm, 0.95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Image Alignment</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Mucasol 세제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, 세인트루이스, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>바늘 전극 29G, 2mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MLA1204</tr><tr><td>소음 제거기</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>압력 변환기</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT 바이오퀘스트 Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>자극 전극 (심실)</td> <td>Harvard Apparatus</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>외과 봉합</td>사 <td>McKesson 의료 외과</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>변환기 증폭기</td><td>세계 정밀 기기</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 플로우 콘솔</td><td>천음속</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>배꼽 테이프</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>수조/순환기</td><td>VWR</td><td>89400-970</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandage shears</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Lister 붕대 가위, 각진, 무딘/둔기, 42.0 mm 블레이드 길이, 17.0 cm</td></tr><tr><td>전기소작</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>BA2ALD001</td><td>모델: 200 기본</td></tr><tr><td>지혈</td><td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>St Vincent 튜브 오클루딩 펜치</td></tr><tr><td></td><td>하버드 장치</td><td>72-8960</td><td>Hartmann 지혈 집게, 곡선형, 톱니 모양 2.2 mm 팁 너비, 9.5 cm</td></tr><tr><td>지혈</td><td>장치 Harvard 장치</td><td>72-8985</td><td>Halstead-Mosquito 지혈 집게 곡선형, 톱니형, 2 mm 팁 14 cm</td></tr><tr><td>메이요 가위</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>14.5 cm, 직선</td></tr><tr><td>Metzenbaum 가위</td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11.5 cm, 직선</td></tr><tr><td>모기 집게</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8980</td><td>Halstead-Mosquito 지혈 집게 직선, 매끄러운, 2mm 팁 너비 12cm</td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8828</td><td>Webster 바늘 홀더, 직선, 매끄러운, 13.0cm 전체 길이 소</td></tr><tr><td>아용 십자가 클램프</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra 클램프 6.25" 5mm 교정</td></tr><tr><td>직각 집게</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>베이비 믹스터 지혈 집게, 14cm, 직각</td></tr><tr><td>메스</td><td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>메스 손잡이 No. 4, 13.7cm 스테인리스 스틸 및 10 No. 22 블레이드</td></tr><tr><td>가위</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8380</td><td>작동 가위, 스트레이트, 무딘/둔기, 42mm 블레이드, 12cm</td></tr><tr><td>스트레이트 톱니 모양의 집게</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>드레싱 집게 15.5cm</td></tr><tr><td>수건 클램프</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>백하우스 수건 클램프, 13cm, 곡선, 잠금 핸들, SS</td></tr><tr><td>Weitlaner 견인</td>기 <td>WPI</td><td>501314</td><td>Weitlaner 견인기, 자체 유지, 10.2cm, 2x 3 날카로운 갈래</td></tr><tr><td><강한>일회용</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 프롤렌 봉합사</td><td>다양한</td><td>공급 업체 다양한 공급</td><td></td></tr><tr><td>업체 선박 루프</td><td>아스펜 수술</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg; 혈관 루프, 0.8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>심정지 (플레지솔)</td><td>화이자</td><td>00409-7969-05</td><td>플레지솔; 세인트 토마스 결정질 심정지 용액 20mL/kg</td></tr><tr><td>헤파린</td><td>다양한</td><td>공급업체</td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>주사기 및 바늘</td><td>다양한</td><td>공급업체 다양한 공급업체</td><td>각각 60mL 및 18G</td></tr><tr><td>배꼽 테이프</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

작은 동물 모델은 더 큰 동물에 비해 유전자 변형 종의 가용성과 낮은 비용으로 인해 심장 혈관 연구에 가장 일반적으로 사용됩니다. 그러나, 더 큰 포유동물은 일반적인 심장 생리학, 병리생리학 및 치료제의 전임상 시험과 관련있는 번역연구 질문에 더 적합합니다. 심장 연구에서 더 큰 동물 모델을 사용하는 것과 관련된 기술적 장벽을 극복하기 위해, 우리는 고립된 랑엔도르프(Langendorff)가 주입한 돼지 심장에서 생리학적 매개 변수를 측정하는 접근법을 설명합니다. 이 접근법은 심장상태를 평가하기 위한 두 가지 강력한 실험 도구를 결합합니다: 전기생리학(EP) 연구와 파라미터 민감한 염료(RH237, Rhod2-AM)를 사용하여 막간 전압과 세포내 칼슘의 동시 광학 매핑. 기재된 방법론은 심장 전도 시스템, 활동 잠재적 형태, 칼슘 취급, 여기 수축 커플링 및 심장 교류의 발생률을 조사하는 번역 연구에 적합합니다. Arrhythmias.

도 1A는 튜브 회로, 펌프, 필터, 산소 공급기, 저수지 및 가열 요소를 포함하는 단리된 심장 관류 시스템의 다이어그램을 나타낸다. ECG(리드 II 구성) 및 진도 전극의 배치는 도 1B에도시되어 있으며, 이미징 설정은 도 1C에도시되어 있다. 광학 부품 및 광 경로의 회로도는 그림 1D에나와 있습니다.
실험 연구는 2.5-10.5 kg의 체중과 18-137 g의 심장 무게(그림 2A)에서크기 범위의 청소년 요크셔 돼지 (14-42 일, n = 18)에서 분리 된 온전한, 전체 심장에 수행되었다. 고립된 심장을 랑엔도르프 시스템(37°C)으로 옮긴 후, 심박수는 제세동 후 ~10분 이내70±4.5 bpm(평균 ±SEM)으로 안정화되고 연구 기간 내내 일정하게 유지되었다(도2B). 184±17 mL/min(평균 ±SEM)의 평균 유량을 측정하였고, 기계적 결합기를 함유하는 온난한 매체를 응비한 후 70±7.5 mL/min으로 둔화되었다(도2C).
리드 II 심실 방출기는 부비동 리듬 동안 연구 기간 내내 기록되었다(도3A)또는 외부 진도에 반응하여(그림 3B-E)전기 생리학적 파라미터를 정량화하였다. EP 평가를 위해, 동적 진도(S1-S1)는 WBCL 및 SNRT(S1-S1 개시 후 회복 시간, 도 3C)를정확히 찾아내기 위해 우측 심토리에 적용되었으며, 이때 WBCL은 심실 전도에 대한 심심을 개시한 가장 짧은 PCL로 표시되었다. S1-S2 진도 프로토콜은 좌심실 탈분극을 개시한 최단 커플링 간격을 식별하기 위해 좌심실상양극 전극을 사용하여 구현되었고, VERP(그림3D)를정확히 찾아냈다. 또는 그림 3E와같이 S1-S2 심방 pacing 프로토콜이 AVNERP(S1−S2)를 정확히 찾아내기 위해 적용됩니다. 돼지 심장 전기 생리학 매개 변수의 대표적인 예는 이전에 출판 된 것과 밀접하게 정렬37.
광학 매핑 실험은 부비동 리듬, 자발적 심실 세동(도4)또는 좌심실(LV)의 동적 진도(S1−S1) 동안 에 도시된 전기 및 칼슘 회복 곡선을 생성하는 동안 수행되었다. 그림 5. 염료가 장착된 돼지 심장의 대표적인 이미지는 에피카이어 표면에서 관심 있는 두 영역으로부터 수집된 해당 광학 작용 전위(Vm) 및 칼슘(Ca) 과도 상태(우심실 [RV] = 파란색, LV = 적색)와 함께 도 4에 도시되어 있습니다. . 처리되지 않은 신호는 부비동 리듬 과 심실 세동 중에 표시됩니다. 앞서 언급한 바와 같이, 동적 에피카디얼 간격(S1−S1)은 또한 광학 매핑 실험 중에 내재적 심박수의 약간의 차이를 정상화하는 데사용되었다(그림 5A-E). 원시 신호가 표시된다(RV=블루, LV = 적색), 이는 작용 전위를 나타내기 위해 사용되었다―칼슘 과도 커플링시간(도 5C),활성화 및 지속 시간(도5D),전기 및 칼슘 회복(도5E). 두꺼운 심근 제제의 경우, 커널 크기의 공간 필터링 ~ 3 mm x 3 mm는 상피 작용 전위 또는 칼슘 과도 분석19,47에적합합니다. 따라서, 고공간 해상도 이미지(설명된 설정 에서 1240 x 1024 총, 또는 채널당 620 x 512, 6.5 μm 픽셀 크기)는 종종 수집 후 또는 사후 수집 중에 공간적으로 비닝된다(도5C). 이미지 처리는 사용자 정의 알고리즘23,33,43,45 (그림 3D)를사용하여 활성화 및 재분극맵을 생성하기 위해 수행 될 수있다, 의 활성화 시간 심혼에 각 픽셀은 활동 전위 또는 칼슘 과도 업스트로크의 최대 유도체로 정의되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> 그림 1: 실험 설정. (a)단리된 심혼 관류 시스템의 다이어그램; 화살표는 흐름의 방향을 나타냅니다. (B)전극 배치와 함께 수축된 심장이 표시됩니다. RA = 오른쪽 심방, RV = 우심실, LV = 좌심실, 심전도 = 리드 II 심전도. (C)심장 조직에 가까운 이미징 플랫폼. (D)각 보상 프로브(전압, 칼슘)의 방출은 적절한 방출 필터및 이색 거울을 가진 이미지 분할 장치를 사용하여 파장에 의해 분리된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> 그림 2: 심장 무게, 속도 및 유량 측정. (a)연구에 사용된 각 새끼 돼지에 대한 체중 대 체중 비율(n=18). (B)제세동 후 ~10분 간 측정한 후, 연구 종료 후 다시 (약 1시간). (C)관상 동맥 유량은 산소 수요 감소로 인해 기계적 결합기 (+BDM)로 관류 후 급격히 떨어집니다. 배율 막대는 평균 ± SEM을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank">나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> 그림 3: 부비동 리듬 동안 또는 외부 진도에 반응하여 수집된 리드 II 심전도 기록의 대표적인 예. (A)정상 부비동 리듬. (B)이미징 실험에 사용된 400 ms(S1−S1)의 사이클 길이에서 에피카디얼 간격의 예. (C)상단: 심방 진행속도는 WBCL을 식별한다; 성공적인 캡처는 S1 = 250 ms에서 관찰되며 심실 전도에 대한 심방이 관찰됩니다. 심방 진도는 SNRT(외부 진도를 입력한 후 부비동 노드 방전 시간)를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 바닥: S1 사이클 길이가 205ms로 감소함에 따라 심실전도가 실패합니다. (D)상단: 에피카디얼 간격(S1−S2)을 식별하여 VERP를 식별합니다. 성공적인 캡처는 S1 = 450 ms, S2 = 300 ms. Bottom에서 관찰됩니다 : S2 주기 길이가 250 ms로 감소함에 따라 심실 조직이 캡처되지 않습니다. (E)심방 진도 (S1−S2) AVNERP를 식별합니다. 위: 성공적인 캡처는 S1 = 450 ms, S2 = 200 ms. Bottom: S2 사이클 길이가 199 ms로 감소함에 따라 심실전도가 실패합니다. 파란색 화살표는 속도 스파이크를 나타내거나 빨간색 화살표는 캡처('C') 또는 캡처 없음('NC')을 나타냅니다. S1-S1 = 동적 간격, S1-S2 = 외신 간격. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> 그림 4: 부비동 리듬 및 심실 세동 중 광학 데이터. 왼쪽: 염료로드 돼지 심장의 대표적인 이미지 (Vm = 전압, RH237; Ca = 칼슘, Rhod2), 전방 보기. 부비동 리듬 동안 돼지 심장에서 공간적으로 걸러진 막 간 전압 및 세포내 칼슘 형광 신호(중앙). 심실 세동 중 전압 및 칼슘 신호(오른쪽). 신호 영역 크기(15 x 15픽셀 = 2.4 x 2.4mm2,30 x 30 = 4.8 x 4.8mm2 커널 크기)는 빨간색과 파란색 사각형으로 표시됩니다. 단위 = ΔF/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> 그림 5: 랑엔도르프가 주입한 돼지 하트의 광학 데이터. 처리되지 않은 공간적으로 여과된(A)막 횡단 전압 및(B)세포내 칼슘 형광 신호는 정점에 전기적 진도 동안 우측 및 좌심실에서 신호한다. 필터링되지 않은 공간 평균 신호는 관심 영역의 광학 동작 전위 및 칼슘 과도 현상을 나타냅니다(신호 단위는 ΔF/F). (C)정규화된 과도의 오버레이는 동작 전위-칼슘 과도 커플링 시간(75Hz에서 필터링된 로우 패스)을 나타낸다. (D)주현부 표면을 가로질러 신호 처리는 활성화 시간(tact)및 80% 재분극 시간을 포함하는 시간파라미터의 등소크로날 맵을 생성한다. (e)통계 분석(오른쪽)을 사용하여 다중 주파수에서 생성된 전기 및 칼슘 과도 복원 곡선(오른쪽)을 통해 느린 속도 주기 길이에서 더 긴 재분극 시간을 보여줍니다. 배율 늘이기 막대 = 평균 ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>화학</td>
			<td>수식</td>
			<td>분자량</td>
			<td>g /L</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화나트륨</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>글루코네이트 나트륨</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>아세테이트 트리하이드레이트 나트륨</td>
			<td>C2H3NaO2•3H2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화칼륨</td>
			<td>KCl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>염화마그네슘 (무수)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8.4% 중탄산나트륨</td>
			<td>나코3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>만놀톨</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>황산 마그네슘</td>
			<td>MgSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>삼투압 (모스몰/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 수정된 델 니도의 심전도 레시피.

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

심혈관 오작동은 전 세계적으로 사망의 주요 원인입니다. 우리가 여기에서 제시하는 고립된 심장 모형은 인간 적인 심장 역학으로 실험적인 창 역할을 할 수 있습니다. 이 접근법은 고전적인 전기 생리학 연구와 세포 간 칼슘의 동시 광학 매핑을 결합하여 심장 상태를 평가합니다.이 방법론은 질병 모델링, 약리학 및 독성학 연구에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어, 우리의 초점 영역 중 하나는 심장 전기 생리학에 유리 크기가 미치는 영향을 특성화하는 것입니다. 이 방법론은 작은 동물 모델을 활용하는 프로토콜보다 기술적으로 더 어렵지만, 전체적으로 모든 조각이 제자리에 있으면 프로토콜이 비교적 간단합니다.이미징 및 관류 시스템의 모든 구성 요소를 텍스트로 설명하기가 어렵기 때문에 이 프로세스의 시각적 데모는 성공적인 준비를 재현하는 데 도움이 됩니다. 오름차순 대오르타로 심장을 고립시키고, 절제된 장기를 얼음 차가운 심폐진으로 급락시키고, 대오르타 벽을 잡기 위해 헤모스타 한 켤레를 사용한다. 혈관을 심장 위 약 95센티미터 에 매달린 얼음 차가운 심폐 배지 1리터에 연결된 튜브에 부착된 갈비뼈 캐뉼라에 미끄러지게 합니다.용기가 오버플로될 때까지 유체가 대자를 채우고 기포가 혈관에 유입되는 것을 방지하고 배꼽 테이프를 사용하여 대루를 캐뉼라로 고정시키도록 합니다. 조직을 더욱 확보하고 차가운 매체가 중력에 의해 70 밀리미터의 일정한 압력으로 심장을 역행할 수 있도록 캐뉼라에서 매달려 있는 심장의 무게를 견디기 위해 헤모스타를 묶습니다. 수통에 공기를 도입하지 않고 37도 랑엔도르프 시스템으로 청취를 전송합니다.그리고 정상적인 부비동 리듬이 남아있는 혈액과 심폐진의 혈관을 플러시 할 수 있습니다. 충격적인 부정맥의 경우, 외부 패들을 심장 정점과 바닥에 놓고 장기를 분해하고, 5개의 주들에서 단일 충격을 전달하고 50줄, 심장 전향 또는 충격이 없는 리듬까지 5개의 줄 단위로 증가합니다. 그런 다음, 어떤 잔류 혈액과 심폐질을 제거하기 위해 재순환없이 수정 된 크렙스 헨셀라이트 배지의 적어도 하나의 리터로 심장을 플러시.매체가 심장을 통해 선명하게 실행되면 순환 루프를 닫아 회부 루프를 다시 순환시화합니다. 연구 과정 전반에 걸쳐 심전도로 표준 리드를 기록하려면 정점 근처의 심실 에피카늄에 29 게이지 바늘 전극을 부착하고 오른쪽 아트리움에 다른 전극을 부착하십시오. 차동 생체 앰프의 양수 및 음수 입력을 각각 정점 및 오른쪽 아트리움에 연결하고, 오른쪽 아트리움에 양극성 자극 전극 1개, 측면 좌심실에 두 번째 양극성 자극 전극을 부착하여 진행을 목적으로 한다.초기 전류가 확장기 임계값의 두 배와 1밀리초 펄스 폭으로 설정된 전기 생리자극기를 사용하여 심장을 가속화합니다. 속도 임계값을 식별하려면 정의된 진행 주기 길이에 1밀리초 펄스 폭으로 1~2밀리amp 자극 전류를 적용하여 일관된 자극 반응을 보장합니다. S1, S1 또는 S1, S2 속도 조정 열차를 사용하여 추가 자극 속도를 수행합니다.S2 속도 주기 길이를 10밀리초 로 줄여 속도 조정이 캡처되지 않을 때까지 줄입니다. 그런 다음 두 번째 속도 주기 길이까지 단계화하여 1밀리초 간격으로 사이클 길이를 줄이면 캡처 가손실 전에 가장 정확한 속도 주기 길이를 결정합니다. 심실 유효 내화 기간을 설정하려면 측면 좌심실의 자극 전극을 사용하여 S2 조기 비트가 심실 탈극화를 시작하는 가장 짧은 S1, S2 간격을 식별합니다.Wenckebach 사이클 길이를 정의하려면 오른쪽 아트리움의 자극 전극을 사용하여 정상 전도 경로를 통해 일대일 대원 대원 전도가 전파되는 가장 짧은 S1, S1 간격을 찾습니다. 부비동 노드 복구 시간을 정의하려면 오른쪽 아트리움의 자극 전극을 사용하여 S1, S1 속도 학습을 적용하고 속도 학습의 마지막 임펄스 와 자발적인 시노어심 노드 중재 활성의 복구 사이의 시간 지연을 측정합니다. 대실 노드 유효 내화 기간을 설정하려면 오른쪽 아트리움의 자극 전극을 사용합니다.심실 탈극화를 의미하는 QRS 복합체를 유도하는 Hisbundle 잠재력이 선행되는 가장 짧은 S1, S2 커플링 간격을 찾습니다. 대막 전압과 세포내 칼슘의 광학 매핑을 위해 먼저 대동맥 캐뉼라에 새로 준비된 전압 염료 근교를 5밀리리터까지 천천히 추가한 다음 갓 준비된 칼슘 염료를 천천히 첨가합니다. 다음으로 이미징 하드웨어를 배치하여 적절한 시야에 초점을 맞추고 카메라를 워크스테이션에 연결합니다.노출 시간이 5~2밀리초인 선택한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득합니다. 원하는 영역을 분할 및 오버레이할 수 있는 소프트웨어의 도움으로 이미지 정렬을 수행하고 강조 표시 잘못 정렬에 회색 스케일 감산 또는 의사 색상 추가를 표시합니다. 주변 조명을 최소화하면 LED 조명을 테스트하여 센서의 깊이가 잘 결정된 균일하고 최대 상각 조명을 보장합니다.이어서, 좌심실 세동, 또는 좌심실에 배치된 자극 전극을 이용하여 심근세동, 또는 동적 속도 저하 시 심근을 이미지화하고, 350밀리초의 속도 주기 길이로 시작하여 10 내지 50밀리초 감소하여 배변 곡선을 생성한다. 실험 전반에 걸쳐 품질의 광학 신호 의 획득을 확인하려면 비디오 파일을 열고 관심 영역을 선택하고 시간이 지남에 따라 평균 형광을 플롯합니다. 실험이 끝나면 시스템에서 심장을 제거하고 난파를 배출합니다.그런 다음 시스템 튜브와 챔버를 정제된 물로 헹구는 다음 헹구는 것입니다. 일상적인 유지 보수를 위해 필요에 따라 세제 용액으로 시스템을 주기적으로 헹구세요. 이러한 대표적인 연구에서, 절차는 그대로 모델에 수행되었다, 입증 된 바와 같이, 그 크기에서 범위 2.5 받는 사람의 10.5 체중과 18 받는 사람의 137 심장 무게의 그램.랭엔도르프 시스템으로 고립된 심혼을 옮긴 후, 심박수는 제세동기의 약 10분 이내에 분당 약 70회 박동으로 안정화되고 연구 기간 내내 일정하게 유지됩니다. 분당 약 184밀리리터의 평균 유량은 일반적으로 측정됩니다. 기계식 커플러가 들어있는 온난한 매체를 사용한 후 분당 70밀리리터로 느려집니다.납 2개의 EKG는 부비동 리듬 도중 또는 전기 생리파라미터를 정량화하기 위하여 외부 적인 진보에 반응하기 위하여 연구 기간 내내 기록될 수 있습니다. 광학 매핑 실험은 부비동 리듬과 자발적인 심실 세동 중에 수행될 수도 있습니다. 염료로 적재된 심장의 대표적인 이미지는 해당 광학 작용 전위와 함께 얻을 수 있다.그리고 칼슘 과도는 상피 표면에 관심의 두 영역에서 수집 될 수있다. 또한, 동적 에피칼리온 속도는 광학 매핑 실험 중에 내장된 심박수의 약간의 차이를 정상화하는 데 사용될 수 있다. 원시 신호는 작용 잠재적 칼슘 과도 커플링 시간, 활성화 및 지속 시간 및 전기 및 칼슘 배상금을 묘사하는 데 사용할 수 있습니다.거품이 대어에 들어가거나 동물에서 시스템으로 옮겨지는 시간을 최소화하고 더 큰 심장을 지원하는 것이 중요합니다. 전기생리학 및 광학 신호 데이터는 수집 후 분석될 수 있다. 추가적으로, 심혼은 역사학, 면역학, 또는 유전자 발현 분석을 위한 연구 후에 보존될 수 있습니다.우리는 이 기술을 사용하여 청소년 심장 발달을 특성화하고 환경 노출이 심장 생리학에 미치는 영향을 검사합니다. 모션을 최소화하는 데 사용되는 기계적 분리기와 알부민 거품을 해결하는 데 사용되는 항폼 화학 물질은 모두 독성이 있으므로 적절한 개인 보호 장비를 사용하는 것은 절대적으로 필수적입니다.

optocardiography-electrophysiology-studies-ex-vivo-langendorff

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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Langendorff 역행성 심장 관류: 고립된 쥐 심장을 관류하는 생체 외 기술

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Langendorff 준비에서 신생아 뮤린 하트의 사용을위한 수정 된 기술

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설치류 심장에서의 바이러스 전이 유전자 발현 및 심장 부정맥 위험 평가

여기에 제시된 프로토콜은 체외 관류 시스템을 사용하여 냉간 보존 후 기증자 심장의 우심실 및 좌심실 기능을 안정적으로 정량화하기 위한 프로토콜입니다.

Langendorff 모델에서 생체 외 쥐 뇌실 기능 평가

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돼지 모델에서 Ex-Situ Heart Perfusion 중 관상 동맥 조영술

배우세요 격리된 돼지 심장 모델을 이용한 심장 역학 및 전기생리학 연구 방법을. 이 기법은 이중 방출 광학 매핑과 전기생리학을 결합하여 심장 전기 활동을 평가하고 질병 모델링 및 약리학 연구에 활용할 수 있습니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

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