Name: 광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 배우세요 광유전학적 도구 GtACR1을 이용한 토끼 심근세포의 전기기계적 특성 평가 방법입니다. 패치클램프와 탄소섬유 기법을 결합하여 심장세포 활동을 정밀 분석하고 광학적 제세동 가능성을 탐색합니다.

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우리는 우수한 기술 지원에 대한 스테파니 페레즈 펠리즈 감사합니다, 박사 요나스 비텍 (훔볼트 대학, 독일 베를린) pUC57-GtACR1 플라스미드를 제공하기 위한 pUC57-GtACR1 플라스미드, 마이클 슈프 박사(샤리테-유니버시티메디진 베를린, 베를린 인스티투트 파마콜로지, 베를린) 아데노바이러스 생산을 위한 교수, 아나스타샤 코클로바 박사(우랄 연방대학)는 세포 분리를 개선하기 위해 자신의 전문지식을 공유하기 위해 아데노바이러스 생산과 아나스타샤 코클로바(Ural Federal 대학)를 공유하기 위한 전문지식을 공유하기 위한 아데노바이러스 생산및 아나스타샤 코클로바(Ural Federal 대학)를 위한 전문 지식을 공유하기 위한 교수 마이클 슈프(Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie, 베를린)를 제공하기 위한 전문 지식을 공유하기 위한 아데노바이러스 생산및 아나스타샤 코클로바(Ural Federal University University)를 제공하기 위한 전문 지식을 공유하고, 아데노바이러스 생산을 위한 교수 마이클 슈프(Charité-Universitätsmedizin Berlin, Instituttsmedizin, Berlin, Berlin) 이 프로젝트는 독일 연구 재단 (SPP1926: SCHN 1486/1-1)에 의해 지원되었다; 에미 노에테르 펠로우십: SCHN1486/2-1) 및 ERC 어드밴스드 그랜트 카디오넥트.

<ol><li>Harz, H., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-regulated+calcium+currents+in+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-regulated calcium currents in Chlamydomonas.</a> Nature. 351, 489-491 (1991).</li>
<li>Litvin, F. F., Sineshchekov, O. A., Sineshchekov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+electric+potential+in+the+phototaxis+of+the+alga+Haematococcus+pluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor electric potential in the phototaxis of the alga Haematococcus pluvialis.</a> Nature. 271, 476-478 (1978).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-1%3A+A+Light-Gated+Proton+Channel+in+Green+Algae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bruegmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+heart+muscle+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).</li>
<li>Lozier, R. H., Bogomolni, R. A., Stoeckenius, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriorhodopsin%3A+a+light-driven+proton+pump+in+Halobacterium+Halobium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Bacteriorhodopsin: a light-driven proton pump in Halobacterium Halobium.</a> Biophysical journal. 15 (9), 955-962 (1975).</li>
<li>Schobert, B., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halorhodopsin+is+a+light-driven+chloride+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Halorhodopsin is a light-driven chloride pump.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (17), 10306-10313 (1982).</li>
<li>Inoue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-driven+sodium+ion+pump+in+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A light-driven sodium ion pump in marine bacteria.</a> Nature Communications. 4, 1678(2013).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Light+Sensitivity+Optical+Neural+Silencer%3A+Development+and+Application+to+Optogenetic+Control+of+Non-Human+Primate+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A High-Light Sensitivity Optical Neural Silencer: Development and Application to Optogenetic Control of Non-Human Primate Cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Grimm, C., Silapetere, A., Vogt, A., Bernal Sierra, Y. A., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+properties%2C+substrate+specificity+and+optogenetic+potential+of+the+engineered+light-driven+sodium+pump+eKR2%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electrical properties, substrate specificity and optogenetic potential of the engineered light-driven sodium pump eKR2.</a> Scientific Reports. 8, 9316(2018).</li>
<li>Wietek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+channelrhodopsin+into+a+light-gated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 409-412 (2014).</li>
<li>Berndt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-Guided+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure-Guided Transformation.</a> Science. 344 (6182), New York, N.Y. 420-424 (2014).</li>
<li>Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+light-gated+anion+channels%3A+A+family+of+microbial+rhodopsins+for+advanced+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics.</a> Science. 349 (6248), 647-650 (2015).</li>
<li>Mohamed, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+inhibition+of+larval+zebrafish+behaviour+with+anion+channelrhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Optical inhibition of larval zebrafish behaviour with anion channelrhodopsins.</a> BMC Biology. 15 (1), 103(2017).</li>
<li>Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Neuronal+Silencing+in+Drosophila+during+Visual+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Neuronal Silencing in Drosophila during Visual Processing.</a> Scientific Reports. 7, 13823(2017).</li>
<li>Govorunova, E. G., Cunha, S. R., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+channelrhodopsins+for+inhibitory+cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Anion channelrhodopsins for inhibitory cardiac optogenetics.</a> Scientific Reports. 6, 33530(2016).</li>
<li>Kopton, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Electrophysiological+Effects+of+Light-Activated+Chloride+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac Electrophysiological Effects of Light-Activated Chloride Channels.</a> Frontiers in Physiology. 9, 1806(2018).</li>
<li>Peyronnet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Load-dependent+effects+of+apelin+on+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Load-dependent effects of apelin on murine cardiomyocytes.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 333-343 (2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+mechanics+of+rat+cardiomyocytes+under+isometric%2C+unloaded%2C+and+physiologically+loaded+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single cell mechanics of rat cardiomyocytes under isometric, unloaded, and physiologically loaded conditions.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (1), 196-202 (2004).</li>
<li>Mitcheson, J. S., Hancox, J. C., Levi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials%2C+ion+channel+currents+and+transverse+tubule+density+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes+maintained+for+6+days+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potentials, ion channel currents and transverse tubule density in adult rabbit ventricular myocytes maintained for 6 days in cell culture.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 43 (6), 814-827 (1996).</li>
<li>Burton, R. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolae+in+Rabbit+Ventricular+Myocytes%3A+Distribution+and+Dynamic+Diminution+after+Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Caveolae in Rabbit Ventricular Myocytes: Distribution and Dynamic Diminution after Cell Isolation.</a> Biophysical Journal. 113 (5), 1047-1059 (2017).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Janssen, P. M., Hunter, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force%2C+not+sarcomere+length%2C+correlates+with+prolongation+of+isosarcometric+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Force, not sarcomere length, correlates with prolongation of isosarcometric contraction.</a> The American Journal of Physiology. 269 (2), 676-685 (1995).</li>
<li>Monasky, M. M., Varian, K. D., Davis, J. P., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+force+decline+from+calcium+decline+by+preload+in+isolated+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dissociation of force decline from calcium decline by preload in isolated rabbit myocardium.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 456 (2), 267-276 (2008).</li>
<li>Kleinlogel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca+2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca 2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Schneider-Warme, F., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+to+fight+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Using light to fight atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 635-637 (2018).</li>
<li>Chow, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li>
<li>Bernal Sierra, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channel-based+optogenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Potassium channel-based optogenetic silencing.</a> Nature Communications. 9 (1), 4611(2018).</li>
<li>Oda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+red+light-activated+channelrhodopsin+Chrimson%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson.</a> Nature Communications. 9 (1), 3949(2018).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

광유전학 적 도구는 비 침습적 인 방식으로 흥분 성 세포 전기 생리학의 변조를 가능하게하는 반면, 그들은 특정 실험 설계에 가장 적합한 도구를 선택할 수 있도록 다른 세포 유형 (예 : CM)에서 철저한 특성화가 필요합니다. 패치 클램프 기술은 세포 전기 생리학을 평가하기위한 표준 방법입니다. 전체 세포 구성에서, 그것은 하나의 광 자극 / 억제 다음 플라즈마 멤브레인 또는 멤브레인 전압의 시간 적 변화를 통해 사진 활성화 전류를 기록 할 수 있습니다. 전기 여기의 광유전학 조작은 또한 CM 수축에 영향을 미칩니다. 당사는 sarcomere 추적 및 탄소 섬유 보조 힘 측정을 사용하여 광 심문이 근세포의 기계적 활동에 미치는 영향을 정량화합니다.
우리는 CM에서 빛 문이 염화물 채널, GtACR1의 기본 효과를 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 모델 시스템으로서, 우리는 그들의 전기 생리학적 특성 (예를 들어, AP 모양 및 내화 기간)이 설치류 CM보다 인간 CM에서 더 밀접하게 관찰 된 것과 유사하기 때문에 토끼 CM을 선택했습니다. 더욱이, 토끼 CM은 며칠 동안 배양될 수 있고, 충분히 오래 아데노바이러스 전달 및 GtACR1-eGFP의 발현을 위해 배양될 수 있다. 특히, 단리CM은 세포 종말의 반올림 및 교차 줄무늬의 점진적 손실을 포함하여, 배양에서 그들의 구조적 특성을 변화시키고, T-관 계통 및 카베올라23,24. 이에 따라, 기능적 변화는 배양 된 CM에서보고되었습니다 : 휴식 막 전위, AP의 연장 및 셀룰러 Ca2 + 취급의 변화. 문화에서 세포 적응의 검토를 위해, 참조 하시기 바랍니다 Louch등. 25. 보충 도 2는 본원에서 관찰된 CM(도 6, 도 7)에서 관찰된 것과 비교하기 위해 새롭게 단리된 CM의 예시AP 및 수축 측정을나타낸다(도 6, 도 7)는여기에 제시된 프로토콜을 이용하여.
전체 셀 패치 클램프 레코딩을 사용하면 광전류 특성(예: 진폭 및 역학)과 높은 시간적 해상도에서 멤브레인 전위 또는 AP 특성의 빛 유발 변화를 직접 측정할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기록은 몇 가지 한계가 있다: 첫째, 시토솔은 이온 전기 화학 그라데이션을 제어하는 것이 유리하지만, 세포 소기관, 단백질 및 기타 화합물을 세척하는 본질적인 단점을 가지고, 따라서 잠재적으로 세포 전기 반응에 영향을 미치는 전체 세포 기록에서 파이펫 용액으로 대체된다. 둘째, 비생리학적으로 긴 탈분극(예: 빛 문이 있는 이온 채널의 느린 시간 상수)으로 인한 추가 이온 채널의 활성화와 같은 부작용은 APD의 변화를 감지할 수 있지만 전기 생리학적으로 관련된 세포 구획에서 이온 농도의 직접 측정을 수행하지 않기 때문에 평가하기가 어렵습니다. 이는 형광 표시기(예:Ca2+ 센서) 또는 이온 선택전극으로 수행할 수 있습니다. 추가 특성화는 광강도 적정, pH 의존성의 결정, 상이한 막 전위에서의 광전류 역학, 반복적인 광 자극 동안의 회복 역학을 포함할 수 있다.
패치 클램프 기록과는 달리, 단세포 힘 측정은 세포 내 밀리에 영향을 미치지 않고 손상되지 않은 근세포의 세포 수축을 분석할 수 있게 합니다. 이온 농도에 대한 이차 효과(예:Ca2+)는생성된 힘 진폭 및 역학(예: 수축 및 이완의 최대 속도; 여기서 는 분석되지 않음)을 결정하여 간접적으로 평가될 수 있습니다. 탄소 섬유 기술을 사용한 힘 측정은 사전 로드된 셀의 수동 및 활성 힘에 대한 직접적인 정보를 제공하기 때문에 자유롭게 수축하는 세포에 비해 장점이 있습니다(즉, 내부 또는 생체 내 설정과 더 유사한 조건에서). 기계적 사전 로드는 세포 수축성을 분석 할 때 특히 중요합니다, 스트레치 힘 생산 및 이완에 영향을 미치는26,27.
광유전학적 접근법은 단일 CM 및 손상되지 않은 심장 조직 모두에서 세포막 전위를 일시적으로 정밀하게 조작할 수 있게 합니다. 고전적으로, ChR2, 빛 게이트 양이온 비 선택적 채널, 멤브레인 전위탈화에 사용 되었습니다., 반면 빛 구동 양성자 및 염화물 펌프 막 과분극에 대 한 사용 되었다. ChR2는 본질적으로 낮은 단일 채널 전도도28및 광 구동 펌프가 흡수된 광자당 1개의 이온을 최대로 운반하는 특징이기 때문에 광유전학 액추에이터의 두 그룹 모두 높은 발현 수준을 요구합니다. 더욱이, CM에서 ChR2의 장기간 활성화는 Na+ 및/또는Ca2+ 과부하로 이어질 수 있으며, 경구동 펌프는 트랜스-사콜렘H+ 또는 Cl-그라데이션 29,30을변경할 수 있다. CM 활동의 광유전학적 제어를 위한 대체 도구를 찾기 위해, 우리는 최근 ChR2와 같은 양이온 ChR에 비해 우수한 단일 채널 전도도와 높은 광 감도를 특징으로 하는 천연 음이온 채널러호독신 GtACR1을 테스트했습니다. 우리는 GtACR1 활성화가 CM을 탈분극하고 광 펄스 타이밍 및 기간에 따라 광학 속도 및 억제에 사용될 수 있음을 발견했습니다. 양이온 ChR 대신 ACR을 사용하는 또 다른 장점은 Cl의 더 부정적인 반전 전위일 수있습니다-Na+에 비해 인위적으로 도입된 이온 전류를 감소시킵니다. 우리가 이전에 보여 준 바와 같이, GtACR1와 광학 속도는 빠른 GtACR1 돌연변이를 사용하여 극복 할 수있는 GtACR1 채널 폐쇄의 느린 구성 요소의 결과로 AP 연장으로 이어질 수있습니다 19. 그러나, AP 연장은 더 낮고, 더 생리학적인 세포내Cl-농도를 사용할 때 훨씬 덜 두드러진다(도 6참조). 더욱이, GtACR1-중재된 억제는 장기간 조명에 의한 억제를 초래하여 심도 있는 막 탈분극을 초래하며, 이는 다시 이차 Na+ 및Ca2+ 유입을 활성화시켜 전압 게이트 채널의 활성을 변화시킬 수 있다. 우리의 측정에서, 우리는 AP 및 수축 파라미터가 1 분 동안 빛 유도 된 억제 후 40 초 이내에 기준선으로 회복된다는 것을 발견했습니다 (Kopton et al. 2018, 그림 6, 그림 7참조). 라이트 게이트 K+ 채널은 CM 안정 멤브레인 전위31에영향을 주지 않고 CM을 침묵시키는 강력한 대안을 제공합니다.
미래에 우리는 심장 활동을 억제하는 그들의 잠재력에 대한 다른 광유전학 적 도구를 정량적으로 비교하고 싶습니다. 이를 위해, 우리는 ACR, ChR2 및 적색 이동 ChR변이체(32)를포함하는 다양한 광 게이트 이온 채널뿐만 아니라 할로호돕신 또는 발압 식 아데닐릴 사이클라제 bPAC와 같은 과극화 액추에이터를 칼륨 채널 SthK(PAC-K)(PAC-K)와 조합하여 시험한다.
여기서 제시된 프로토콜은 CM의 전기기계적 특성의 심층적 특성화에 사용될 수 있다. 그것은 주로 다른 종에서 CM에 적용, 그리고 CM병에 걸린 심근에서 분리. 광 자극을 통해 서로 다른 주파수에서 CM 속도를 조절할 수 있으며 탄소 섬유 수축 실험 중에 다양한 프리로드를 테스트할 수 있습니다. 흥미로운 실험은 질병 진행 동안 심장 조직 리모델링의 발달 중에 관찰 될 수있는 바와 같이, 휴식 막 전위점진적 증가를 모방하기 위해, 하위 임계 값 탈분극에 대한 낮은 강도 조명을 사용하는 것입니다. 마지막으로, 기능적 측정은 Ca2+ 이미징과 결합하여 여기 수축 커플링에 대한 추가 통찰력을 제공하거나 약리학적 개입으로 CM 활동에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다.

ChR 매개 광전류는 단세포 녹조류1,2의안구에 처음 기록되었다. 클라미도모나스 라인하르티ChR1 및 ChR2의 유전자 복제 및 이종 발현 직후, ChR은 제노푸스 난모세포 및 포유류 세포의 막 전위를 빛3,4에의해 변화시키는 도구로 사용되었다. 양이온 비선택적 ChR은 ChR의 반전 전위에 부정적인 휴식 막 전위를 가진 세포의 막을 탈분극화한다. 그(것)들은 이렇게 광학 간격5,6를허용하는 뉴런 및 CM를 포함하여 흥분성 세포에 있는 AP를 이끌어 내는 것을 이용될 수 있습니다.
양이온 ChR, 광구동 양성자, 염화물 및 나트륨 펌프7,8,9에 대한 상보체는 신경 활성을 억제하는 데 사용되어왔다 10,11,12. 그러나, 후자는 하나의 이온이 흡수 된 광자 당 수송으로, 높은 빛 강도와 지속적인 조명을 필요로 한계가있다. 2014년, Wietek 외 및 Berndt et al.에 의한 2개의 독립적인 연구에서는 채널 기공13,14의돌연변이를 통해 양이온 전도 ChR을 ACR로 의전환을 기술하였다. 1 년 후, 자연 ACR은 암호 기야르디아 세타 (GtACR)15에서발견되었다. 엔지니어링 된 ACR은 잔류 양이온 전도도를 보였듯이, 그들은 큰 단일 채널 전도도 및 높은 빛 감도15를특징으로하는 천연 ACR로 대체되었습니다. GtACR은 염화물16,17의반전 전위를 향해 막 전위를 편광시킴으로써 뉴런 활성을 침묵시키는 데 사용되었다. 고보루노바 등은 배양된 랫트 심실 CM에 GtACR1을 적용하고 양성자 펌프아치(Arch) 18과같은 이전에 이용 가능한 억제 도구를 활성화하기에 충분하지 않은 저조도 수준에서 효율적인 광 억제를 보였다. 우리 그룹은 최근 CM의 GtACR1 매개 광 억제가 탈분극을 기반으로하고 GtACR1도 CM19의광학 적 진도에 사용될 수 있다고보고했다.
여기에서, 우리는 배양된 토끼 심실 CM에 대한 GtACR1 광활성화의 전기생리학적 및 기계적 효과를 연구하기 위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 먼저 세포 격리, 배양 및 변환을 설명합니다. 전기 생리학적 효과는 전체 셀 패치 클램프 기록을 사용하여 측정됩니다. 주어진 멤브레인 전압에서 광 매개 전류는 V 클램프 모드에서 평가됩니다. 멤브레인 전위 역학은 전기적 또는 광학적으로 진도CM(I-클램프 모드)를 측정하는 동안 측정됩니다. 전기적으로 트리거된 AP의 광학 적 억제는 지속적인 광 응용 프로그램을 사용하여 테스트됩니다. 기계적 효과는 탄소 섬유를 사용하여 sarcomere 길이의 이미징 기반 추적과 함께 측정됩니다. 이를 위해 광학 적으로 보운세포는 반대쪽 세포 끝 근처의 플라즈마 멤브레인에 두 개의 탄소 섬유를 부착하여 기계적으로 미리 로드됩니다. Sarcomere 길이 변화는 광학 또는 전기 적 간격 동안 기록됩니다. 마지막으로, 광억제는 세포의 전기장 자극 중에 측정되고, 생성된 힘이 분석된다.
이 프로토콜은 도 1의순서도에 나타난 다음 단계를 포함합니다: 토끼 깊은 마취, 티오펜탈 과다 복용 주입, 심장 절제, Langendorff-관류 및 조직 소화, 세포를 방출하는 조직의 기계적 해리, CM 수율의 현미경 분석, CM의 배양, 아데노바이러스 유형 5의 배율, 인큐베이션 및 기능 실험.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig1a.jpg"> 그림 1: 전기 및 광학 적 보속 CM을 얻기 위해 사용되는 프로토콜의 순서도. 하트는 9-10 주 된 토끼에서 절제되고, 심장 조직은 랑엔도르프 설정을 사용하여 관영되는 동안 소화됩니다. 세포는 기계적 교반에 의해 방출됩니다. CM 수율은 현미경으로 계산됩니다. CM은 배양되고, 아데노바이러스 타입 5로 트랜스듀렉션되고, 기능적 실험은 48-72시간 후 트랜스덕션을 수행한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>장비 - 세포 분리/배양/형질전환</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adeno-X Adenoviral System 3 CMV</td><td>TaKaRa, Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, California, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대동맥 캐뉼라</td><td>Radnoti</td><td></td><td>4.8 OD x 3.6 ID x 8-9 L mm</td></tr><tr><td>커버슬립 &oslash; 16 mm, 두께 No. 0</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>631-0151</td><td>붕규산 유리</td></tr><tr><td>그리핀 실크, 검정, 2m 길이, 크기 3, 0.5mm</td><td>Samuel Findings, 런던, 영국</td><td>TSGBL3</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>New Brunswick, Eppendorf, Sch&ouml; nenbuch, 스위스</td><td>갤럭시 170S</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff-관류 설정</td><td>Zitt-Thoma Laborbedarf Glasbl&auml; serei, 프라이부르크, 독일</td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>Langendorff-pump</td><td>Ismatec, Labortechnik-Analytik, Glattbrugg-Z&uuml; 부자, 스위스</td><td>ISM444</td><td></td></tr><tr><td>메쉬 : 나일론 Monodur 필터 천</td><td>Cadisch Precision Meshes Ltd</td><td></td><td>800 &micro; m 구멍, 1m 너비</td></tr><tr><td>Neubauer 챔버</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>717806</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, New Zealand White</td><td>Charles River</td><td>스트레인 코드 : 052</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td><td>BC774R</td><td>Bauchdeckenschere ger. 18cm</td></tr><tr><td>멸균 필터, 0.22 &micro; m</td><td>Merck, 다름슈타트, 독일</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Equipment - Patch-clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplfier</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip &oslash; 50 mm, Thickness No. 1</td><td>VWR International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>631-0178</td><td>붕규산 유리</td></tr><tr><td>디지타이저 Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, 미국</td><td>1550A</td><td></td></tr><tr><td>Filter (530/20)</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>11513878</td><td>BZ:00</td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>AxonInstruments, Union City, CA, United States</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Interface</td><td>Scientifica, 영국 Uckfield</td><td>1U 랙, 352036</td><td></td></tr><tr><td>LED 525nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LED 제어 소프트웨어</td><td>Essel Research and Development, 토론토, 캐나다</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 제어 시스템</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>현미경 반전</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>전동 미세 조작기</td><td>Scientifica, Uckfield, UK</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>광학 파워 미터</td><td>Thorlabs, Newton, NJ, 미국</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>RS 부품, Corby, UK</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>A-M Systems, Sequim, WA, United States</td><td>787500</td><td>실버, 베어 0.015'', 코팅 0.0190'', 길이 25피트</td></tr><tr><td>소다 라임 유리 모세관</td><td>Vitrex Medical A/S, Vasekaer, Denmark</td><td>160213 BRIS, ISO12772</td><td>1.55 OD x 1.15 ID x 75 L mm</td></tr><tr><td>소프트웨어 Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, United States</td><td>버전 10.5</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td><td>1 mm</td><td></td></tr>Equipment - <tr><td>Prof. Jean-Yves Le Guennec</td><td></td><td>BZ:00</td><td></td></tr> <tr><td>Digitizer Axon Digidata</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, United States</td><td>1550B</td><td></td></tr> 필터(530/20)<tr><td></td>에서 제공하는 탄소 섬유<td></td><td></td><td></td></tr>Carbon fibers <tr><td></td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, 독일</td><td>11513878</td><td></td></tr><tr><td>Filter (630/20)</td><td>Chroma Technology, Bellows Falls, Vermont, United States</td><td>227155</td><td></td></tr><tr><td>형광 시스템 인터페이스</td><td>IonOptix, Milton, MA 미국</td><td>FSI-800</td><td>2.0 OD x 1.16 ID x 100 L mm</td></tr><tr><td>Force Transducer System</td><td>Aurora Scientific Inc., Ontario, Canada</td><td>406A</td><td></td></tr><tr><td>힘을 위한 유리 모세관 측정</td><td>하버드 장치, Holliston, Massachusetts, United States</td><td>GC200F-10</td><td></td></tr><tr><td>인터페이스 National Instruments</td><td>National Instruments, 부다페스트, 헝가리</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>LED 525 nm</td><td>Luminus Devices, Sunnyvale, CA, United States</td><td>PT-120-G</td><td></td></tr><tr><td>LED control box</td><td>Essel Research and Development, 토론토, 캐나다</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED 제어 시스템</td><td>맞춤형</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로컨트롤러</td><td>Parallax Inc., Rocklin, California, United States</td><td>Propeller</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Narishige Co., Tokyo, Japan</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inverted</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>DMI4000B</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S camera</td><td>IonOptix, Dublin, Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S 카메라 전원</td><td>IonOptix, Milton, MA, 미국</td><td>MCS-100</td><td></td></tr><tr><td>MyoPacer 필드 자극기</td><td>IonOptix Cooperation, Milton, MA, 미국</td><td>MYP100</td><td></td></tr><tr><td>Piezo Motor</td><td>Physik Instrumente (PI) GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>E-501.00</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Grease</td><td>RS Components, Corby, UK</td><td>494-124</td><td></td></tr><tr><td>Software Axon pClamp</td><td>Molecular Devices, San Jos&eacute;, CA, 미국</td><td>버전 10.5</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 IonWizard</td><td>IonOptix, 더블린, 아일랜드</td><td>버전 6.6.10.125</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 MatLab2017</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Graticules Optics LTD, Tonbridge, UK</td><td>1 mm</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td><td>21114-1L</td><td></td></tr><tr><td>L-카르니틴 염산염</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>C9500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type 2, 315 U/mg</td><td>Worthington, Lakewood, NJ, USA</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Creatine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>C0780-50G</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine-&beta;- D-아라비노푸라노사이드</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, 칼스루에, 독일</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>에스케타민 염산염, Ketanest S 25 mg/mL</td><td>Pfizer Pharma PFE GmbH, 베를린, 독일</td><td>PZN-07829486</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin 50 mg/mL</td><td>Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>헤파린-나트륨, 5,000 IU/mL</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>PZN-03029843</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>인슐린(소 췌장)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>I6634-50MG</td><td></td></tr><tr><td>K-aspartate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A6558-25G</td><td></td></tr><tr><td>KCl VWR</td><td>International GmbH, Leuven, Belgium</td><td>26764.260</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Honeywell Fluka, Muskegon, MI, USA</td><td>35113-1L</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm 쥐 육종의 라미닌 기저막</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>M199-Medium</td><td>Sigma-Aldirch, St. Louis, Missouri, United States</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>A9187-1G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NaCl Fisher Scientific, Loughborough, Leics., UK</td><td>10428420</td><td></td></tr><tr><td>NaCl-용액 0.9%, Isotone Kochsalz-L&ouml; sung 0.9%</td><td>Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>AppliChem GmbH, 다름슈타트, 독일</td><td>A6579</td><td>Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Na-pyruvat</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>P2256-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)</td><td>Sigma, Poole, UK</td><td>192066</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV from Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>T0625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental Inresa 0.5 g</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany</td><td>PZN-11852249</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 염산염, Rompun 2%Bayer</td> <td>Vital GmbH, 레버쿠젠, 독일</td><td>PZN-01320422</td><td></td></tr></tbody></table>

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

Electromechanical Assessment of Optogenetically Modulated Cardiomyocyte Activity

지난 2 년간, 광유전학 공구는 심혼을 포함하여 흥분한 조직에 있는 세포 모형 특정 활동을 조절하는 강력한 수단으로 설치되었습니다. Channelrhodopsin-2 (ChR2)는 심근 세포 (CM)에서 막 전위를 탈분극하는 일반적인 도구이지만, 잠재적으로 행동 전위 (AP)를 유도하는 것은 CM 활동의 신뢰할 수있는 침묵에 대한 효과적인 도구가 누락되었습니다. 그것은 광과 성 억제에 대 한 항이온 채널로도 프 린스를 사용 하 여 제안 되었습니다 (ACR) 여기서, 우리는 배양된 토끼 CM에서 길라르디아 세타로부터 자연 ACR GtACR1을 활성화시키는 효과를 평가하는 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜에는 토끼 심장으로부터의 CM 분리, 최대 4일 동안 세포의 파종 및 배양, 광문이 있는 염화물 채널에 대한 아데노바이러스 코딩을 통한 전달, 패치 클램프 및 탄소 섬유 설정의 준비, 데이터 수집 및 분석이 포함됩니다. 전체 셀 구성에서 패치 클램프 기술을 사용하면 광 활성화 전류(전압 클램프 모드, V-클램프) 및 AP(전류 클램프 모드, I-클램프)를 실시간으로 기록할 수 있습니다. 패치 클램프 실험 외에도, 우리는 세포 내 밀리외를 방해하지 않고 CM 활성의 기능적 평가를 위한 수축성 측정을 수행합니다. 이를 위해, 세포는 탄소 섬유를 사용하여 기계적으로 미리 로드되고 수축은 sarcomere 길이와 탄소 섬유 거리의 변화를 추적하여 기록됩니다. 데이터 분석에는 I-클램프 기록의 AP 지속 시간 평가, V-클램프 기록의 피크 전류 및 탄소 섬유 측정의 힘 계산이 포함됩니다. 기재된 프로토콜은 CM 활성에 대한 다른 광유전학 액추에이터의 생물물리학적 효과의 시험에 적용될 수 있으며, 이는 심장 조직 및 전체 심장에서 광유전학적 실험에 대한 기계적 이해의 개발을 위한 전제 조건이다.

GtACR1-eGFP는 배양된 토끼CM(도 6 인서트)에서 발현되었고, 광전류는 패치 클램프 기술로 측정하였다. GtACR1의 광활성화는 -74 mV에서 큰 내부 방향 전류를 보여줍니다. 도 6에서피크 전류(IP)는4 mW /mm2에서 245 pA입니다. AP는 전류 주사가 임계값의 1.5배, 또는 10 ms의 짧은 탈편극광 펄스를 가진(도 6B)또는 광학적으로(도6C)각각 트리거되었다. APD 값을 분석하면, 전기적으로 진행된 CM은 0.24±0.08 s의 APD 20과 0.75±0.17s의 APD 90을 나타내고, 광학적으로 진행된 CM은 APD 20의 0.31±0.08 s 및 APD 90의 0.81±0.19 s(SE, n= 5, N=2) 여기서 제시된 예에서 APD 20전기 = 0.17s; APD 20광학 = 0.27 s 및 APD 90전기 = 0.61 s; APD 90광학 = 0.68 s; 그림 6D). 광학적으로 진행되는 CM은 느린 AP 발병을보여준다(도 6D). CM 활성화는 염화물의 반전 전위를 향한 멤브레인 전위를 편광시킴으로써 지속적인 조명(64s, 4 mW/mm2)에 의해 억제되었고, 여기서 -58 mV(도 6E). 임계치의 1.5배 이상인 전류 주사는 AP 생성을 유도하지않는다(도 6F). 생성된 피크 힘은 탄소 섬유 굽힘으로부터 결정되었다(도7B, C, E). CM은 전기 적 진도에 따라 232 μN/mm2를 생성했습니다(그림 7B)및 광학 적 간격(그림 7C)에따라 261 μN /mm2. 연장된 녹색 광 펄스는 수축을 억제합니다(그림 7E). 64s에 대한 광학 억제에 이어, 재발 수축은 더 낮은 수축력을 생성하고, 힘 값은 토끼 CM에서 확장기 칼슘 손실에 따라 ~ 10 수축 후 기준선으로 회복 (0.25 Hz에서 속도, 그림 7D).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig6a.jpg"> 그림 6: 전기 및 광학 적 진행/억제 CM의 대표적인 패치 클램프 기록. (A)300 ms, 4 mW/mm2의광 펄스를 사용 하 여 -74 mV에서 대표적인 광 전류. IP는 피크 전류를 나타낸다. 인서트는 GtACR1-eGFP 양성 세포를 나타낸다. (B)대표 AP 레코딩은 10 ms의 전류 램프를 사용하여 0.6 nA의 전류 램프를 사용하여 CM을 전기적으로 페이스를 유지합니다.(C)대표 AP 기록은 10 ms, 0.4 mW/mm2의 광 펄스를 사용하여 0 pA에서 기록한다. (D)상단 그래프는 전기적으로(blue) 및 광학적으로 활성화된 CM. AP의10번째 AP의 오버레이를 나타내고 AP는 멤브레인 전위(dV/dt max)의 최대 변화에 의해 정렬되었다. 하단 그래프는 광학적으로 트리거된AP(E광학-E전기)의멤브레인 전위 차이를 나타낸다. (e)전기적으로 트리거된 AP는 64s, 4 mW/mm2의지속적인 빛 하에서 억제되었다. (F)AP는 지속된 빛 하에서 임계치(0.7 nA에서 0.7 nA에서 2.2 nA단계)보다 높은 전류 주사에 의해 억제된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig6alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60490/60490fig7a.jpg"> 그림 7: 광학 및 전기적 진행/억제 된 CM의 탄소 섬유 기록의 대표 데이터. (A)데이터 수집 소프트웨어에 표시합니다. 이미지(I)는 사르카망 길이를 계산하기 위한 창과 함께 측정된 CM을 나타낸다. 셀 너비는 주황색으로 표시됩니다. (1) 관련 주파수의 범위. (2) FFT 파워 스펙트럼은 세포 상에서 의 자폐 간격의 주파수를 나타낸다. 평균 sarcomere 길이는 피크 주파수에서 계산됩니다. (3) 사오레 길이 추적 창. (4) 강도 추적. (5) 강도 추적에 해밍 창이 곱한 강도 추적은 창이 있는 강도 추적입니다. 계획(II)은 셀의 타원형 단면을 나타낸다. 주황색 너비와 두께가 파선 파란색입니다. 이미지(III)는 각각의 검출 박스와 함께 탄소 섬유의 위치를 나타내고, 녹색으로 적색 및 우측으로 좌측을 나타낸다. (6) 강도 추적. (7) 강도 추적의 첫 번째 미분 (데이터 수집 소프트웨어 설명서 참조). (B)전기적으로 유도된 수축의 대표적인 흔적. 패널(I)은 사르카망 길이 단축, 패널(II) 두 탄소 섬유 사이의 거리를 나타낸다. (C)광학 유도 수축의 대표적인 흔적 (525 nm, 0.25 Hz, 10 ms, 6 mW / mm2). 패널(I)은 사르카망 길이 단축, 패널(II) 두 탄소 섬유 사이의 거리를 나타낸다. (D)AP 발생의 억제에 의한 일시 정지 후 수축 1 에서 11까지 피크 힘이 발생하였다. (E)지속적인 조명하에서 수축의 광학 억제의 대표적인 흔적 (525 nm, 64 s, 6mW / mm2). 패널(I)은 두 탄소 섬유 사이의 길이 단축, 패널(II) 길이를 나타내고 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490fig7alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>A.</td>
			<td>영역</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acr</td>
			<td>아니온 채널로독신</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ap</td>
			<td>작업 잠재력</td>
		</tr>
<tr>
<td>Apd</td>
			<td>작업 잠재적 인 기간</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cfu</td>
			<td>콜로니 형성 유닛</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chr</td>
			<td>채널로독신</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cm</td>
			<td>심근세포</td>
		</tr>
<tr>
<td>eGFP</td>
			<td>향상된 녹색 형광 단백질</td>
		</tr>
<tr>
<td>Esd</td>
			<td>끝 수축기 세포 변형</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eu</td>
			<td>내독소 단위</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>강제로</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fft</td>
			<td>빠른 푸리에 변환</td>
		</tr>
<tr>
<td>GtACR</td>
			<td>기야르디아 세타 음이온 채널로호도프신</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gui</td>
			<td>그래픽 사용자 인터페이스</td>
		</tr>
<tr>
<td>I 클램프</td>
			<td>전류 클램프</td>
		</tr>
<tr>
<td>Iu</td>
			<td>국제 단위</td>
		</tr>
<tr>
<td>모이</td>
			<td>감염의 복합성</td>
		</tr>
<tr>
<td>폴리 헤마</td>
			<td>폴리 (2-하이드록시틸 메타크릴레이트)</td>
		</tr>
<tr>
<td>V 클램프</td>
			<td>전압 클램프</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: 약어 목록입니다.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1a.jpg"> 추가 그림 1: 광학 전력 계측기의 광강도 측정. (A)4 mW/mm2에서10 ms 빛 펄스의 측정. (B)4 mW /mm2에서64 s의 지속적인 조명의 측정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig1alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2a.jpg"> 보충 그림 2: 갓 분리된 CM의 특성 및 배양에서의 구조적 적응. (a)새로 단리된 CM의 AP 기록(APD 20 의 1.11±0.34 s, APD 90 의 1.96±0.32 s, n=7, N=2). -79.3 ±0.8 mV의 평균 휴식 막 전위 (n= 7, N = 2). (b)전기적으로 단리된 CM. 평균 피크 력 205±78 μN/mm2(n=7, N=2)의 탄소 섬유 기록. (C)갓 단리된 CM(I)의 공초점 이미지; 48시간 후에 트랜스듀스(II) 및 트랜스듀시(III) CM을 배양한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/60490suppfig2alarge.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 자료: APD 및 휴식 멤브레인 전위를 결정하는 MatLab 스크립트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60490/SupplementalMaterial.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 토끼 심근 세포에서 GtACR1 활성화의 전기 기계적 효과를 평가하기위한 프로토콜을 제시한다. 당사는 세포 격리, 배양 및 아데노바이러스 전이, 패치 클램프 및 탄소 섬유 기술로 기능적 실험에 대한 자세한 정보를 제공합니다.

Over the past two decades, optogenetic tools have been established as potent means to modulate cell-type specific activity in excitable tissues, including ...

심근세포 활성에 대한 상이한 검소성 액추에이터의 생체 물리학 적 효과로 프로토콜을 사용하여 심장 조직 및 전체 심장에서 광유전학 실험의 발달을 돕기 위해 테스트 할 수 있습니다. 패치 클램프 기술과 사코메레 추적 및 탄소 섬유 보조 힘 측정을 결합하여 GtACR1 광활성화가 심실 심근세포의 전기 및 역학에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 광유전학 적 억제는 잠재적으로 광학 제세동에 사용될 수 있습니다.GtACR1은 심장 활동의 침묵을 가능하게 하는 광유전학 공구입니다. 이 기술은 매끄러운 및 단세포 근육 세포 연구와 같은 다른 연구 분야에 완전히 적용 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량 스크리닝에 사용될 수 없지만 심근세포 전기 및 기계적 기능의 포괄적인 분석을 위한 수단을 제공합니다.속담이 진행됨에 따라 그림은 천 단어 이상을 말합니다. 비디오에서 얼마나 많은 정보를 얻을 수 있습니까? 단일 심낭 스트레칭 및 프로브 준비에 관련된 도구와 기술 중 일부는 매우 복잡하며 설명에 비해 비디오에서 전달하는 것이 훨씬 쉽습니다.9에서 10 주 된 뉴질랜드 흰 토끼에서 식염수에서 심장을 씻어 낸 후, 저칼슘, 높은 칼륨 용액으로 배설물을 전환하고 심장박동이 멈춘 후 2 분 동안 심장을 퍼프합니다. 효소 용액을 흡수하고, 2분간의 소화 후 효소 용액을 다시 저수지로 재순환하고, 소화 5분 후 분당 16밀리리터로 속도를 줄입니다. 40-50분간의 소화 후 조직이 부드러워지면, 심장을 잘라내고 즉시 심장을 차단용액에 놓습니다.조직이 완전히 다뤄질 때까지 차단 용액을 추가합니다. 오른쪽 심실과 중격을 잘라 왼쪽 심실을 분리합니다. 유두 근육을 제거하고 미세 한 집게와 파이펫을 사용하여 조직을 부드럽게 분리하여 기계적 해리에 의해 세포를 방출합니다.1밀리미터 제곱 모공과 원심분리에 의한 퇴적물로 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. 그런 다음 심근세포 펠릿을 신선한 차단 용액으로 다시 중단합니다. 패치 클램프 실험을 위해, 세포 배양 직전에 라미닌 밀리리터 당 100 마이크로그램으로 페트리 접시에 오토클레이브 커버립을 코팅합니다.탄소 섬유 실험을 위해 페트리 접시에 폴리-HEMA 밀리리터 당 0.12그램을 95-5에 대수 용액으로 코팅하십시오. 심근세포를 다시 중단한 후 10~15분 동안, 상체를 제거하고 배양 배지에서 세포를 재연한다. 계산 후, 밀리리터 당 4개의 세포에 1.75배의 표적 밀도로 페트리 접시의 커버슬립에 세포를 시드한다.섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3~4시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 75의 감염의 복합성에서 GtACR1-eGFP에 대한 아데노바이러스 유형 5 코딩을 포함하는 신선한 배지로 커버슬립 배양에서 배지를 교체한다. 문화를 인큐베이터에 48시간 동안 되돌려 보입니다.패치 클램프 실험을 수행하려면 마이크로파이펫 풀러를 사용하여 소다 라임 유리 모세혈관에서 1.7~2.5메가옴 패치 파이펫을 끌어당겨 데이터 수집 소프트웨어를 초기화합니다. 외부 용액을 포함하는 측정 챔버에 세포가 있는 커버슬립을 넣고 eGFP 형광에 기초하여 심근세포를 선택합니다. 다음으로 패치 파이펫을 내부 용액으로 채우고 피펫을 피펫 홀더에 부착하여 실버 염화물 코팅 실버 레코딩 와이어를 내부 솔루션에 삽입합니다.멤브레인 테스트를 설정하여 10밀리볼트 펄스를 15밀리초 동안 0 밀리볼트의 기준선으로 적용합니다. 셀 부착 된 구성에 도달 한 후 데이터 수집 소프트웨어에서 마이너스 60 밀리볼트의 보유 잠재력을 가진 전체 셀 모드로 전환하십시오. 그런 다음 음압을 부드럽게 적용하여 멤브레인을 파열하여 전체 세포 구성에 액세스합니다.성공적인 파열은 측정된 커패시턴스의 즉각적인 증가에 의해 입증될 것입니다. 전압 클램프 모드에서 300밀리초의 광 펄스 또는 제로 피코암페어의 동작 잠재력을 기록합니다. 탄소 섬유를 생산하려면 먼저 파이펫을 풀러의 파이펫 홀더에 장착하십시오.유리 모세 혈관을 총 테이퍼 길이약 11mm와 약 30 마이크로미터의 최종 내지름으로 두 개의 파이펫으로 당깁니다. 다음으로, 스테레오 현미경을 사용하여 방향 원에 하나의 모세관을 정렬하고 벤더로 모세관의 끝을 아래로 밀어 최대 45도 구부립니다. 모세관이 벤더를 제거한 후에도 45도 각도를 유지할 때까지 필라멘트를 가열합니다.모세관을 구부린 후 부드러운 튜브가 장착 된 미세 한 포셉을 사용하여 튜브에서 탄소 섬유 1 개를 꺼내 모세관의 미세 한 끝에 맞춥시게하십시오. 모세관의 섬유를 굴곡까지 밀어 넣습니다. 탄소 섬유를 잘라서 모세관 끝에서 2 밀리리터를 투사하고 시아노아크라일레이트 접착제를 사용하여 섬유를 각 모세혈관의 전면 섹션에 고정시하십시오.섬유를 보정하려면 미세 조작기와 압착기 모터에 의해 제어되는 홀더에 하나의 모세관을 부착하십시오. 모세관을 센서쪽으로 이동하고 센서를 기준으로 정렬합니다. 힘을 생산하지 않고 힘 센서와 접촉섬유의 끝을 배치합니다.압제 모터의 총 움직임은 60 마이크로미터입니다. 압전 모터를 6개의 10마이크로미터 단계로 힘 센서쪽으로 이동합니다. 센서는 볼트당 0.05 밀리뉴턴의 감도와 0~0.5밀리뉴턴의 힘 범위를 가지고 있습니다.각 단계에 대한 측정 된 전압을 읽고 센서에서 탄소 섬유를 제거합니다. 수축 심근세포의 힘을 기록하려면 폴리-HEMA로 커버글래스 표면을 코팅하고 측정 챔버에 놓습니다. 외부 목욕 용액으로 챔버를 채웁니다.탄소 섬유가 적재된 모세혈관을 모두 단계 미세 조작기에 부착하고 각도로 정렬하여 탄소 섬유가 측정 챔버의 표면과 수평에 가깝게 되도록 합니다. 섬유가 올바르게 정렬되었는지 확인하려면 측정 챔버의 표면에 초점을 맞추고 첫 번째 섬유를 낮추고 섬유를 수평으로 이동하십시오. 섬유의 끝은 측정 챔버의 표면에 슬라이딩해야합니다.두 번째 섬유에 대해 동일한 절차를 따르십시오. 조명이 꺼지면 챔버에 배양 된 셀 서스펜션 몇 방울을 추가하고 짧은 녹색 광 펄스를 적용하여 녹색 광 자극에 반응하여 수축되는 세포를 선택합니다. 첫 번째 섬유를 부착하려면 섬유를 낮추어 세포를 부드럽게 압축한 다음 압력을 방출합니다.두 섬유 사이에 최대 수의 사코프레를 갖기 위해 심근세포의 다른 쪽 끝에 있는 제2 섬유를 평행하게 부착한다. 두 섬유가 부착된 후, 세포가 더 이상 챔버 표면과 접촉하지 않도록 섬유를 들어 올립니다. sarcomeres를 초점으로 가져오고, 섬유 사이에 sarcomere 길이 추적 창을 설정하고, 가장자리 감지 모듈을 사용하여 섬유 굽힘을 추적합니다.빨간색 및 녹색 창으로 감지 영역을 설정하고 광 강도 추적의 첫 번째 유도체에서 임계값을 정의합니다. 사컴레 길이와 섬유 굽힘 추적하면서 셀의 전광적으로 속도를 내립니다. 이 경우, 우리는 0.25 헤르츠에서 진행.적어도 15개의 광학적으로 유도된 수축을 기록한 후, 필드는 전적으로 세포를 자극한다. 수축을 유도하기 위한 임계값을 찾아 전기 적 속도의 임계값 전압의 1.5배를 적용합니다. 억제 프로토콜의 경우, 수축을 유도하기 위해 전기 자극을 적용한 다음 다양한 광 강도에서 지속광 펄스에 세포를 노출시한다.빛 유도 억제 후 적어도 15 수축을 기록한다. GtACR1은 배양된 토끼 심근세포로 표현된다. 300밀리초 동안 제곱된 밀리미터당 4밀리와트의 광도에서 GtACR1 광활성화는 245피쿠암페어의 측정된 피크 전류로 마이너스 74 밀리볼트의 큰 내향 전류를 생성합니다.이 대표적인 실험에서, 작용 잠재력은 현재 주사로 전기적으로 트리거되거나 임계값의 1.5배 또는 10밀리초 광 펄스를 가진 광학적으로 발동되었다. 광학적으로 진행된 심근세포는 느린 작용 전위 발병을 입증했습니다. 전기적으로 트리거된 작용 잠재력은 지속적인 빛 하에서 억제되었다.높은 전류 주사 및 1.5 지속적인 빛 응용 프로그램 동안 임계값의 배도 작업 잠재력을 유도하지 않습니다. 심근세포는 전기 적 도면에 제곱 밀리미터 당 232 마이크로 뉴턴의 수축 력을 생성하고 광학 적 도면 에 따라 제곱 밀리미터 당 261 마이크로 뉴턴. 장기간 된 녹색 빛 펄스는 토끼 심근 세포에서 확장칼슘 손실에 따라 낮은 수축력을 생성 하는 후 억제 재발 수축수축을 억제.실험을 수행하기 전에 기술을 연습하는 것이 좋습니다. 근구 세포 수축을 분석할 때 매우 중요합니다. 등소 및 보조 수축 해석에도 다양한 후하가 적용될 수 있다.이 기술은 각 실험에 가장 적합한 광유전학 공구를 선택하는 데 중요한 심근세포에서 새로 개발 된 광유전학 액추에이터를 활성화시키는 생물 물리학적 효과의 특성화를 허용합니다. 아데노바이러스 트랜스듀션및 트랜스듀션 다음의 모든 단계는 생물안전 수준 II 조건하에서 수행되어야 합니다.

electromechanical-assessment-optogenetically-modulated-cardiomyocyte

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

그대로 고립 Langendorff에 transmembrane 잠재력 (VM)과 일시적인 세포 내 칼슘 (CAT)의 광학 매핑하는 동안이 종이 자세히 해부 절차를, 수단 설치, 그리고 실험 조건 마우스 마음을 perfused.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

여기 우리는 특히 심 실 같은 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes에에서 광학 이미지 활동 전위, 하는 방법을 제시. 메서드를 사용 하면 전압에 민감한 형광 단백질의 발기인 기반 식을 기반으로 합니다.

하위 형식 관련 광학 활동 전위 녹음 인간의 유도 만능 줄기 세포 유래 심 실 Cardiomyocytes

여기 선물이 심장 생리학을 모방 하는 전기 및 기계적 자극을 사용 하 여 셀 인구를 교육 하기 위한 프로토콜. 이 전기 자극 치료 세포의 cardiomyogenic 잠재력을 강화 하 고 더 세포 치료, 질병 모델링 및 의약품 심사를 위한 유망한 전략 이다.

셀의 Cardiomyogenic 잠재력 향상을 동시 전기 및 기계적 자극

우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.

고립 된 뮤린 심실 근세포의 광학 이미징

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

여기서는 고속 모듈식 광혈약 시스템을 사용하여 유도된 다능줄기 세포 유래 심근세포로부터의 작용 잠재력의 광학 획득 및 특성화를 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

이 연구는 마이크로 LED 어레이를 사용한 국소 광 자극 및 심 외막 전위의 동시 광학 매핑을 사용하여 트랜스 제닉 채널 로돕신 -2 (ChR2) 마우스의 손상되지 않은 뮤린 심장의 심장 리듬을 제어하는 방법을보고합니다.

쥐 심장에 광유전학적 다중 부위 광자극을 적용하여 고급 심장 리듬 관리

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

이 프로토콜은 전임상 개발 중 약물에 의한 수축성 변화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼인 MyoBLAZER 시스템을 사용하여 기증자 심장에서 성인 인간 원발성 심근세포의 수축성을 측정하는 방법을 설명합니다.

고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

이 프로토콜은 형질전환 마우스 심장에서 내재적 심장 뉴런의 광유전학적 자극 방법을 보여줍니다. 설명된 접근 방식은 생체 외 관류 심장에서 갑작스러운 심장 뉴런 활성화의 동역학과 콜린성 및 카테콜아민성 활성 간의 상호 작용을 조사하는 데 사용됩니다.

절제된 관류 마우스 심장에서 내재적 심장 자율 뉴런의 광유전학적 활성화(Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts)

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

배우세요 광유전학적 도구 GtACR1을 이용한 토끼 심근세포의 전기기계적 특성 평가 방법입니다. 패치클램프와 탄소섬유 기법을 결합하여 심장세포 활동을 정밀 분석하고 광학적 제세동 가능성을 탐색합니다.

광유전학적으로 변조된 심근세포 활동의 전기기계적 평가

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