Name: 인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 HIV-1 ASP 반의전사체를 검출하는 가닥 특이적 RT-PCR 방법을 통해 중첩 유전자 발현을 연구하는 기술을. 바이오틴화 프라이머와 고온 RNA 변성을 활용하여 비특이적 산물을 최소화합니다.

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우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.

이 연구는 센터 병원 대학 Vaudois의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (CHUV).
1. HIV-1HXB2 균주를 가진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감염
<ol><li>
1일차: PBMC 자극
	<ol>
<li>건강한 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리합니다.</li>
		<li>전체 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니크를 포함하는 1640 배지에서 1x106/ mL의 농도로 PBMC를 카운트하고 다시 일시 중단하십시오. illin/연쇄상 구균 (R-10), 인터류핀-2 (IL-2) 및 3 μg/mL 피토헤마글루티닌 (PHA)의 50 U/mL를 첨가합니다.</li>
		<li>양세포를 6웰 플레이트 2개(셀 서스펜션/웰 3mL)로 위아래로 피펫을 분리합니다.</li>
		<li>37°C 및 5%CO2에서3일 동안 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3일차: PBMC 감염 참고: 1.1.3 단계에서와 같이 두 플레이트 중 하나를 음성 대조군으로 사용하십시오(이 세포를 감염시키지 마십시오). 주의: 생체 안전 수준 III 실험실(P3)에서 전체 절차를 수행합니다.<ol>
<li>한 접시에서 50 mL 팔콘 튜브와 원심 분리기를 300 x g에서 10 분 동안 풀.</li>
		<li>상급체를 버리고 IL-2 의 20 U / mL 및 2 μg / mL 폴리브렌을 포함하는 R-10의 2.2 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.</li>
		<li>HIV-1HXB2 바이러스를 함유하는 바이알을 해동하고 세포에 1.8 mL의 바이러스 성 현탁액 (0.376 ng/μL)을 추가합니다.</li>
		<li>37 °C에서 2 시간 동안 세포를 배양하고 30 분마다 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오.</li>
		<li>세포를 300 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>상급체를 버리고 IL-2 (50 U /mL)를 포함하는 R-10에서 1x106/mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액을 1 mL/well의 농도로 24웰 플레이트로 옮기고 37°C 및 5%CO2에서5일 동안 배양한다.</li>
		<li>수확 1 잘 매일 과 전지 1.5 mL 튜브에 전송 (감염의 날로 표시). 참고: 원심분리 전에, PBMC 감염 품질 관리를 위해 150 μL의 세포 현탁액을 유세포 측정 튜브로 옮기십시오(1.3단계 참조)</li>
		<li>튜브를 400 x g에서 10 분 동안 원심 분리하고 상한체를 버립니다.</li>
		<li>사용할 때까지 세포 펠릿을 -80°C에서 동결합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PBMC 감염: 품질 관리
	<ol>
<li>감염의 매일, 감염된 PBMC의 150 μL를 수집하고 유세포 측정 튜브로 전송합니다.</li>
		<li>인산염 완충 식염수 1mL(PBS)와 원심분리기를 400 x g에서 5분 동안 넣습니다.</li>
		<li>상급물질을 버리고 아쿠아 라이브/죽은 염료 1μL을 함유한 PBS 50 μL을 추가합니다(이전에 는 PBS로 1:10 희석).</li>
		<li>4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급을 폐기합니다.</li>
		<li>250 μL의 고정/퍼메아빌화 용액을 추가하고 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>1mL의 1mL(FBS와 사포닌을 모두 함유한 10x 스톡 용액)과 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가합니다.</li>
		<li>상판액을 버리고 HIV 개그 p24 플루오레세인 이소티오차네이트(FITC)-공액 항체(희석 1:10)를 함유하는 PBS의 50 μL을 첨가한다.</li>
		<li>어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>PBS 1mL, 원심분리기를 400 x g에서 5분 간 추가하고 상급기를 버립니다.</li>
		<li>x CellFIX 150 μL (포름알데히드 10%, 메탄올 3.55%, 아지드 나트륨 희석 0.93% 1:10)를 넣고 유세포분석으로 세포를 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 항 CD3/CD28 항체를 가진 인간 CD4+ T 세포의 자극
<ol><li>HIV-1 감염 환자와 건강한 기증자 모두의 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분리하십시오.</li>
	<li>PBS에서 안티 CD3 (1:100) 및 안티 CD28 (1:50)을 희석하여 인간 항 CD3/CD28 항체 혼합을 준비합니다.</li>
	<li>48-웰 플레이트를 적절한 수의 웰에 웰당 200 μL의 항체 혼합물을 첨가하고 2시간 동안 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>항체 용액을 흡인하고 1x10 6/mL에서 CD4+T 세포 1 mL을 항 CD3/CD28 항체 코팅 웰에 추가합니다. 참고: CD4+ T 세포를 최대 5일까지 자극하십시오.</li>
</ol>3. 역 전사
참고: 환자 특이적 프라이머를 얻기 위해, 각 환자로부터 CD4+T 세포로부터 분리된 프로바이러스 DNA를 HIV-1HXB2 팬 ASP 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 환자 특이프라이머는 팬 ASP 프라이머 내부에 프로바이러스 서열을 사용하여 설계되었다. 이 연구에 사용된 모든 프라이머및 프로브는 표 2에나열되어 있습니다.
<ol><li>
세포에서 총 RNA를 분리
	<ol>
<li>RNA를 정량화하고 DNase로 샘플을 처리하여 DNA 오염을 제거합니다.</li>
		<li>50 μL의 부피에서 RT 반응을 수행. 96 웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 총 RNA의 0.1-1 μg을 전송합니다. RNA에 다음 성분을 추가하여 RNA 혼합물을 준비합니다. 5 μL의 생체측화 ASP 역프라이머 (20 μM) 2.5 μL의 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTPs) (10 mM) 25 μL의 디에틸피로카보네이트 (DEPC) 처리 된 증류수 (dH2O). 생체생리화된 ASP 역프라이머 대신에 5 μL의 뉴클레아제 없는 물을 첨가하여 내인성 RT 대조군을 준비한다.</li>
		<li>96웰 PCR 플레이트를 열사이클러에 넣고 RNA 혼합물을 94°C로 5분 동안 가열합니다.</li>
		<li>즉시 적어도 1 분 동안 아이스 워터에서 RNA 혼합물을 식힙니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가하여 반응 혼합물을 준비하십시오 (총 샘플 개수와 1 을 계산하십시오). 5x RT 버퍼의 10 μL 2.5 μL 의 0.1 M 의 1,4-디티오트레이톨 (DTT) 2.5 μL 의 RNase 아웃(40 단위/μL) RT 효소 2.5 μL (200 단위/μL)</li>
		<li>이 혼합물의 17.5 μL을 RNA 함유 웰각각에 전달한다. 역전사를 2.5 μL의 뉴클레아제 없는 물로 대체하는 RT-마이너스 대조군을 준비한다.</li>
		<li>부드럽게 혼합하고 열사이클러를 사용하여 60 분 동안 55 °C에서 플레이트를 배양.</li>
		<li>70°C에서 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ASP 생체 정제 cDNA의 친화력 정제
참고: RT-마이너스 반응을 정화하지 마십시오.
<ol><li>10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM 에틸렌디아미네테트라 아세트산 (EDTA) 및 2 M NaCl을 포함하는 2x 세척 /결합 완충제 1 L을 준비합니다. 솔루션을 필터링합니다.<ol>
<li>PCR 등급의 물을 사용하여 1x 세척/결합 버퍼 50mL를 준비합니다.</li>
		<li>각 반응에 대해 스트렙타비딘 접합자 비드 10 μL을 사용하십시오. 반응 의 수에 따라, 1.5 mL 튜브에 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다.</li>
		<li>15s에 대한 2 x 세척 / 바인딩 버퍼와 소용돌이의 동일한 볼륨을 추가하여 구슬을 씻어.</li>
		<li>튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 상류를 제거하고 구슬의 초기 볼륨과 같은 세척 / 바인딩 2x 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다.</li>
		<li>30s에 대한 소용돌이 및 10 μL의 비드 현탁액을 적당한 수의 1.5 mL 튜브로 이송한다.</li>
		<li>튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>상급제는 버리고 세척/결합 2x 완충액 50 μL을 추가합니다.</li>
		<li>비드를 포함하는 해당 튜브에 50 μL의 생체 티니레이트 cDNA를 추가합니다.</li>
		<li>실온에서 30분 동안 배양하여 부드럽게 회전합니다.</li>
		<li>상판에서 비드를 자석 분리 랙으로 실온에서 3분 동안 분리합니다.</li>
		<li>1x 세척/결합 버퍼의 200 μL을 추가하여 구슬을 세척합니다. 튜브를 자석 분리 랙에 실온에서 3분 동안 놓고 상판을 버립니다. 두 번 반복합니다.</li>
		<li>PCR 등급의 물 10 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 표준 PCR
참고 : 표준 PCR의 목적은 ASP 유전자의 전체 ORF를 증폭하는 것입니다. 증폭 제품은 pCR2.1 플라스미드로 복제되어 실시간 PCR에 의한 ASP RNA 정량화를 위한 표준 곡선을 개발합니다(단락 실시간 PCR 참조).
<ol><li>총 부피 50 μL에서 표준 PCR을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다. 1 μL 10 μM ASP 프라이머(전진 및 후진) 1μL 의 10 mM dNTP 염화 마그네슘 (MgCl2)(농도는 사용되는 프라이머에 따라 다름) dH2O에서 49 μL의 최종 부피<ol>
<li>잘 혼합하고 신속하게 내용물 스핀다운하고 PCR 마스터 믹스의 49 μL/well을 96웰 PCR 플레이트로 옮김을 더합니다.</li>
		<li>ASP cDNA 친화도 정제에 사용되는 비드를 함유하는 튜브를 15초 동안 조심스럽게 소용돌이치게 한다.</li>
		<li>해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가하고 다음 프로그램을 사용하여 PCR을 실행합니다: 2분 동안 95°C, 30s의 경우 95°C의 40사이클, 30초의 경우 55°C, 40초의 경우 68°C, 68°C에서 7분 동안 실행합니다.</li>
		<li>PCR 제품을 1 % 아가로즈 젤에 분리하고 밴드를 자르고 증폭 된 제품을 pCR2.1 플라스미드로 복제하십시오.</li>
		<li>각 클론의 시퀀스를 시퀀스 및 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 실시간 정량적 PCR (qPCR)
참고: 3단계 "역전사"에 기재된 접근법을 사용하여 환자 별 프라이머 및 프로브를 개발한다. qPCR의 경우 표준 곡선에 대한 ASP 플라스미드 희석을 포함합니다. 환자 특이적 인서트를 함유하는 플라스미드는 5단계 "표준 PCR"의 시작 부분에서 노트에 언급된 바와 같이 개발된다.
<ol><li>1:10 ASP 플라스미드 직렬 희석을 사용하여 표준 곡선을 3 x 106 복사/μL에서 3복사/μL까지 준비합니다.<ol>
<li>
첫 번째 라운드 PCR (프리 앰프). 총 부피 25 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다. ASP 또는 env 프라이머 믹스 0.5 μL (최종 농도 0.2 μM 각) (전진 및 후진) 0.5 μL 의 dNTPs 혼합 (최종 농도 0.2 mM 각) MgCl2 (농도는 프라이머 쌍에 따라 다름) dH2O에서24 μL의 최종 부피</li>
		<li>PCR 마스터 믹스의 24 μL을 96웰 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰로 전송합니다.</li>
		<li>조심스럽게 15 s에 대한 cDNA와 구슬을 포함하는 튜브를 소용돌이.</li>
		<li>해당 웰에 1 μL의 구슬을 추가합니다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.</li>
		<li>다음 알고리즘을 사용하여 PCR을 실행 : 95 °C에서 2 분 동안 변성; 95°C에서 30s, 55°C에서 30s, 18사이클동안 68°C에서 40s; 68 °C에서 7 분 동안 연장하십시오.</li>
		<li>PCR 등급의 물로 1:5 의 첫 번째 라운드 PCR 반응을 희석합니다.</li>
		<li>
두 번째 라운드 qPCR. 총 부피 20 μL로 반응을 수행합니다. 각 샘플에 대해 1.5mL 튜브에 다음 구성 요소를 추가합니다. 1.8 μL 10 μM 프라이머(전진 및 후진) 1 μL 의 5 μM 프로브 6.2 μL 의 dH2O</li>
		<li>19 μL의 qPCR 마스터 믹스를 96웰 qPCR 플레이트의 적당한 수의 웰로 옮기고 희석된 1라운드 PCR 반응의 1 μL을 해당 웰에 첨가한다. 플라스미드 희석에 대해동일한 작업을 수행합니다.</li>
		<li>다음 알고리즘으로 qPCR을 실행: 95°C에서 10분 동안 변성; 95°C에서 15s, 40 사이클동안 60°C에서 1분.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 '끝에서 역 프라이머를 태그하는 것은 가닥 특이적 증폭6,8,9를달성하는 데 효과적임이 입증되었습니다. 그러나, 이 접근은 단지 비특이적인 DNA 제품의 증폭을 일으키는 원인이 되는 PCR 반응으로 새는 그것의 리스크와 함께 그것을 피하기 보다는 오히려 그것을 피하기 위하여 거짓 프라이밍 된 cDNA를 검출할 수 있게 합니다 (즉, ASP 대신 env).<...

안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.
ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법은 유전자 특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 오른쪽 극성의 상보성 DNAs(cDNAs)를 합성합니다. 그러나 이러한 접근법은 초기 RNA 템플릿의 배향(감각 또는 안티센스)을 결정하는 것을 허용하지 않으며, RNA 헤어핀 또는 루프가프라이머(10)가없는 상태에서 양방향으로 RT를 프라임할 수 있기 때문에, RT 자체 프라이밍으로 알려진 현상이다. 대부분의 ASP 조사자들은 HIV-111,12와관련이 없는 시퀀스로 태그가 지정된 프라이머를 사용하여 RT 자체 프라이밍의 문제를 회피한다. 그러나 이러한 전략은 현상의 발생을 제거하지 않으며, 비특이적 cDNA를 PCR11로잠재적으로 이월시킬 수 있다.
우리는 최근에 안티센스 RNA의 연구 를 위한 새로운 가닥 특이적 RT-PCR 분석기를 개발하고 우리는 표 1에도시된 바와 같이 6명의 HIV 감염한 환자의 코호트에서 ASP RNA 검출을 위해 그것을 이용했습니다. 아래에 설명된 절차는 이전에 안토니오 만카렐라 외13에의해 출판되었습니다. 프로토콜에서는 이중 접근 방식으로 비특정 cDNA의 생산을 방지합니다. 첫째, 우리는 고온 (94 °C)에서 RNA를 분해하여 RNA 이차 구조를 제거하고, 둘째, 우리는 생체 별 ASP 특이적 프라이머를 사용하여 ASP RNA를 역전시키고 결과 cDNA를 정화합니다. 이 접근법에 의해, 우리는 다른 비특이적 RT 제품이 생성되는 것을 방지하거나 (RNA의 고온 변성) 또는 PCR (선호도 정제) 이전에 제거되기 때문에 우리의 목표 cDNA만 증폭할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BD LSR II</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v1.1 사이클 염기서열분석 키트</td><td>, Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 세트(100 mM)</td><td>인비트로젠, Thermo Fisher Scientific</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4+ T Cell 분리 키트</td>, <td>Stemcell Technologies</td><td>19052</td><td></td></tr>, <tr><td>소태아, 혈청</td>, <td>Biowest</td>, <td>S1010-500</td><td></td></tr>, <tr><td>고정/투과화 솔루션 키트</td>, <td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>HIV, Gag p24, 유세포 분석 항체 - Kc57-FITC</td>, <td>Beckman Coulter</td><td>6604665</td><td></td></tr>, <tr><td>Human IL-2</td>, <td>Miltenyi, Biotec</td><td>, 130-097-743</td><td></td></tr><tr><td>Phaseolus vulgaris(PHA)의 렉틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61764-1MG</td> LIVE/DEAD <td></td></tr><tr><td>고정성 황색 사세포 염색 키트, 405nm 여기용</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>L34967</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD28</td><td>Becton Dickinson</td><td>55725</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-Human CD3</td><td>Becton Dickinson</td><td>55329</td><td></td></tr><tr><td>프라이머 및 프로브</td><td>통합 DNA 기술 (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymererase High Fidelity</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌 감염 / 형질주입 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 역전사효소</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4369016 Subcloning용 TOPO TA 클로닝 키트, One Shot TOP10 화학적 적성 대장균 세포</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>K450001</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase(2 U/&micro; L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (hiv-1) 안티 센스 단백질 (asp) 가닥 특정 rt-pcr에 의해 환자에서 rna 전사체의 검출

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3' 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.

생체 연화 cDNA의 친화도 정제에 결합 된 고온 RNA 변성은 체외 및 환자로부터 분리 된 CD4 + T 세포에서 감염된 PBMC에서 PCR 동안 비 특이적 ASP 제품의 증폭을 방지합니다. RT 셀프 프라이밍은 안티센스 RNAs10,14,15,16,17의역전사 중에 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을 방지하기 위해, 우리는 원래 Heist et al.10에의해 설명된 기술을 사용하여 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 절차는 RT 이전에 RNA의 고온 변성을 포함하고 RT를 수행하기 위해 생체 용 프라이머를 사용하고, 스트렙타비딘 코팅 자기 비드<sup class="xre...

RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.

인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

기존의 RT-PCR은 겹치는 유전자에 의해 인코딩된 RNA를 검출하는 데 사용될 때 감각과 반감각 서열 사이의 차별을 허용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하면 특히 안티 센스 RNA를 감지 할 수 있습니다. 높은 RNA 데니션 온도와 함께 생체 화 프라이머를 사용하면 안티 센스 cDN의 증폭을 허용하여 비특이적 RT 제품의 형성을 방지합니다.우리는 ASP가 RNA 항감각 또는 단백질 전구체로서, 새로운 HIV 항원, 잠재적으로 치료를 위한 새로운 HIV 표적을 한다는 것을 보여주기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 이 방법은 겹치는 유전자에서 반감각 RNA가 검출될 수 있는 어떤 시스템에도 적용될 수 있습니다. PanASP 프라이머 내부의 프로 바이러스 DNA 서열을 사용하여 환자 특정 프라이머를 설계하여 시작합니다.다음으로, RNA를 정량화하고 DNase로 견본을 취급하여 DNA 오염을 제거합니다. 총 RNA의 0.1 과 1 마이크로그램 사이를 96 개의 잘 PCR 플레이트에 적합한 우물로 옮기. 그런 다음 원고 방향에 따라 역 전사 또는 RT 반응을 설정합니다.ASP 역 프라이머 대신 뉴클레아제 프리 워터 5마이크로리터를 추가하여 내인성 RT 컨트롤을 준비한다. 플레이트를 열순환기로 넣고 RNA를 섭씨 94도로 5분간 가열합니다. 그런 다음 즉시 적어도 1 분 동안 차가운 물에 식힙니다.텍스트 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 튜브에서 반응 혼합물을 준비한 다음, 17.5 마이크로리터를 각 RNA에 우물을 함유한다. RNA 데니션은 섭씨 94도에서 수행해야 합니다. 총 내성 없이, 감각 RNA로부터 비특이적 제품의 합성이 발생할 수 있으며, 이는 비특이적 cDNA의 증폭으로 이어질 수 있다.우물의 내용물들을 부드럽게 섞고 접시를 섭씨 55도에서 60분간 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 70도까지 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다. 원고 방향에 따라 2X 세척 및 바인딩 버퍼 1리터를 준비하고 용액을 필터링합니다.다음으로 PCR 급수를 사용하여 1X 세척 및 바인딩 버퍼 50 밀리리터를 준비합니다. 적절한 수의 스트렙타비딘-유도 마그네틱 구슬을 1.5밀리리터 튜브로 옮은 다음, 2배의 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 15초 동안 튜브를 소용돌이시켜 세척합니다. 튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.그런 다음, 구슬을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 구슬의 초기 부피와 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 구슬을 30초 동안 소용돌이게 하고 서스펜션의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 적절히 옮겨냅니다. 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.그런 다음 상체를 버리고 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 50 마이크로리터의 생체분해된 cDNA를 구슬로 해당 튜브에 추가하고 부드럽게 회전하면서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 3분 동안 자기 분리 랙에 튜브를 놓고 1X 세척 및 바인딩 버퍼의 200 마이크로리터로 구슬을 세척한 다음 분리 랙에 3분 배양을 합니다.상체를 버리고 두 번 씻는 것을 반복하십시오. 그런 다음, PCR 급수의 10 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 원고 방향에 따라 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.잘 섞어서 빠르게 회전한 다음 잘 하면 49마이크로리터를 96개의 PCR 플레이트로 옮기습니다. 15초 동안 정제된 cDNA로 튜브를 조심스럽게 소용돌이치게 하고 해당 우물에 서스펜션의 마이크로리터 1개를 추가합니다. PCR을 실행하고 1 % 아가로즈 젤에 제품을 분리합니다.젤에서 밴드를 잘라 PCR 2.1 플라스미드로 증폭 된 제품을 복제합니다. 그런 다음 클론을 시퀀스하고 각 시퀀스를 분석합니다. 초기 RT 반응은 일반 비생물학적 안티센스 프라이머로 수행되었고 ASP의 성공적인 증폭을 초래했다.그러나, 동일한 분자량및 프라이머 마이너스 대조군의 밴드도 증폭되었다. 이러한 문제점을 우회하기 위해, 특정 반센스 프라이머는 비오틴으로 표지되었고, 그 결과 반감각 cDNA는 PCR 이전에 정제되었다. 이를 통해 프라이머 마이너스 컨트롤에서 비특이적 cDNA로부터의 오염이 크게 감소하여 ASP 서열을 증폭시킬 수 있었습니다.이 방법의 추가 최적화는 RT 이전에 섭씨 94도에서 RNA의 완전한 내포화에 의해 달성되었고, 얼음 물에 즉각적인 냉각을 거쳐 ASP 대역의 효과적인 증폭과 비특이적 제품이 발생하지 않았다. ASP RNA의 운동학은 검출 가능한 viremia및 항 CD3/CD28로 자극다음 치료의 부재를 가진 3개의 HIV 양성 과목에서 분리된 CD4 세포를 측정하고 CD4 세포. ASP RNA의 정량화는 또한 비 검출 가능한 viremia를 가진 ART를 겪고 있는 환자에서 가능했습니다.3명의 환자 중 2개에서 ASP RNA는 3~5일 후에 낮은 수준에서 자극을 받았다. 2명의 환자는 ASP와 env RNA를 위해 분석되었습니다, 1개는 치료되지 않고 1개 취급되었습니다. 치료되지 않은 환자를 위해, 둘 다 RNA를 검출할 수 있었습니다.치료된 환자를 위해, ASP및 env는 자극의 며칠 후에 거의 검출될 수 있었습니다. 이 절차를 시도할 때, 탈고가 RNA를 선형화하여 RT를 프라임할 수 있는 이차 구조물이 파괴된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 반면, 구슬의 세척은 비 생물학적 cDN을 씻어낸다.정확한 극성으로 cDNA를 정제한 후, qPCR은 유전자 발현을 분석하기 위해 수행될 수 있다. 또한 cDNA는 시퀀스 분석에도 복제되고 사용될 수 있습니다. 이 방법은 반대 방향으로 겹치는 유전자를 연구할 수 있게 해주며, 일부 유형의 암을 포함한 박테리아및 바이러스 관련 질병의 조절 및 병발생을 해명하는 데 유용할 수 있다.

detection-human-immunodeficiency-virus-type-1-hiv-1-antisense-protein

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

nanomole 친화력과 HIV - 1Ba - L gp120에 대한 몇 가지 2' - 플루오로 RNA의 aptamers는 RNA 라이브러리에서에 의해 고립...

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

플라즈마 및 시퀀싱에서 HIV - 1 RNA 수준을 Quantifying하면 단일 HIV - 1 검출 한계 (50-75 사본 / ML) 아래 바이러스성로드와 개인의 genomes가 어렵습니다. 여기 우리는 안정적으로 0.3 복사 / ML에 HIV - 1 RNA를 측정하고 매우 낮은 바이러스성로드와 샘플에서 단일 게놈 시퀀싱에 의해 바이러스 genomes를 증폭하는 방법을 실시간 PCR 분석을 사용하여 플라즈마 바이러스 RNA를 추출하고 계량하는 방법에 대해 설명합니다.

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

항 레트로 바이러스 치료 (ART)를 실패한 HIV-1에 감염된 개인에 대한 약제 내성 검사는 미래의 치료법을 안내하고 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 높은 HIV의 유행하지만 자원 제한 설정에서 최적화 개인과 집단의 건강 결과는 궁극적으로 저렴하고 접근 약제 내성 유전자형과 해석 방법이 필요합니다.

자원 제한 설정에 대한 경제적 인 HIV-1 약제 내성 모니터링 방법

머리와 목의 종양 조직에서 고위험 HPV의 존재는 유리한 결과와 관련이 있습니다. RNAscope라는 현장 하이브리드 기술에서 최근에 개발 된 RNA는 FFPE 조직 섹션에서 HPV E6/E7 mRNA를 직접 시각화 할 수 있습니다.

에 RNAscope<em&gt; 현장에서</em&gt; 헤드 전사적으로 활동 인간 Papillomavirus의 탐지와 목 편평​​ 상피 세포 암

거의 동종발생 바이러스 간의 성장 경쟁은 상대적 복제 적합성을 결정하기 위한 민감한 측정을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 재조합 HIV-1 클론의 구축, 바이러스 전파 및 성장 경쟁, 민감하고 일관된 결과를 산출하도록 최적화된 분석 방법이 포함됩니다.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

Provided는 열 순환기 또는 현미경 및 스테이지 히터를 사용하여 DNA 샘플의 초기 농도를 정량화하기 위한 실시간 재조합효소 중합효소 증폭 분석을 개발하기 위한 프로토콜입니다. 또한 내부 양성 대조군의 개발도 설명되어 있습니다. 원시 실시간 형광 데이터를 처리하기 위한 스크립트가 제공됩니다.

내부 양성 대조군과 양적 재조합 효소 중합 효소 증폭 분석 개발

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

학습하세요 HIV-1 ASP 반의전사체를 검출하는 가닥 특이적 RT-PCR 방법을 통해 중첩 유전자 발현을 연구하는 기술을. 바이오틴화 프라이머와 고온 RNA 변성을 활용하여 비특이적 산물을 최소화합니다.

인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출

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