Name: 단백질 흡착 및 폴리머 역학의 석영 결정 미세 균형 측정시 시료 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 석영 결정 미세 균형(QCM)을 활용한 단백질 흡착 및 폴리머 역학 측정 방법을. 적절한 시료 두께와 정확한 모델링을 통해 연성 물질과 생체 재료의 기계적 특성을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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이 작업은 NSF (DMR-1710491, OISE-1743748)에 의해 지원되었다. J.R. 및 E.S.는 NSF(DMR-1751308)의 지원을 인정합니다.

QCM-D 콜라겐 흡착
1. 시료 준비 및 센서 사전 세척
<ol><li>0.1 M 아세테이트 버퍼의 20 mL를 준비하고 필요에 따라 HCl 및 NaOH로 pH를 조정하여 pH = 5.6을 달성합니다.</li>
	<li>멸균 조건하에서 20 mL의 아세테이트 버퍼에 쥐 꼬리 콜라겐 용액을 10 μg/mL의 최종 농도에 추가합니다.</li>
	<li>유기 및 생물학적 물질을 제거하기 위해 금 코팅 석영 센서를 청소25,26.<ol>
<li>센서 활성 측면을 UV/오존 챔버에 놓고 표면을 약 10분 동안 처리합니다.</li>
		<li>탈이온수(dH2O),암모니아(25%)를 5:1:1 로 가열합니다. 과산화수소 (30%) 75 °C로. 센서를 용액에 5분 동안 놓습니다.</li>
		<li>dH2O로센서를 헹구고 질소 가스 스트림으로 건조시면 됩니다.</li>
		<li>센서 액티브 사이드를 UV/오존 챔버에 놓고 표면을 10분 동안 처리합니다. 참고: 센서 표면의 환경 오염을 최소화하기 위해 측정 전에 세척 절차를 즉시 수행해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. QCM-D 측정 데이터 수집
<ol><li>펌프, 전자 장치 및 컴퓨터 소프트웨어를 포함하여 측정에 필요한 모든 장비를 켭니다.</li>
	<li>챔버 플랫폼에서 유량 모듈을 제거하고 큰 엄지 나사를 풀고 모듈을 엽니다.</li>
	<li>초기 세척 후 센서를 방치한 경우(단계 1.3.1-1.3.4 단계), 센서를 탈이온수(dH2O)로헹구고 질소 가스 스트림으로 건조하여 표면에 오염 물질이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>노출된 O-링의 유량 모듈에 센서를 장착하고 먼저 질소 가스 스트림으로 영역을 건조시키고 O 링이 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. 센서는 활성 표면 측면을 아래로 배치하고 흐름 모듈의 마커를 향지하는 앵커 모양의 전극을 배치해야합니다.</li>
	<li>엄지 나사를 돌려 유량 모듈을 밀봉하고 챔버 플랫폼에서 교체하십시오. 필요한 PTFE 펌프 튜브를 유동 모듈 및 외부 펌프에 부착하십시오.</li>
	<li>적절한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 유량 모듈의 온도를 37°C로 설정합니다. 10-15분 동안 변화하는 온도를 모니터링하여 원하는 값으로 평형이 되도록 합니다.</li>
	<li>센서의 초기 공진 주파수를 찾습니다. 소프트웨어에서 공진 주파수를 찾지 못하는 경우 플로우 모듈이 챔버 플랫폼에 올바르게 배치되었는지 확인하거나 유동 모듈에 센서를 다시 장착하여 중심이 되고 적절한 전기 접촉을 하는지 확인합니다.</li>
	<li>1x 인산완식염수(PBS) 용액에 입구 펌프 튜브를 놓습니다. 외부 펌프 흐름을 25 μL/min에서 시작하고 튜브를 육안으로 검사하여 유체가 튜브를 통해 흐르는지 확인합니다. 참고: 유체 흐름은 유체 유량을 100μL/min 이상으로 순간적으로 증가시킴으로써 더 쉽게 볼 수 있습니다. 유체가 튜브를 통해 이동하는 것처럼 보이지 않으면 유동 모듈의 두 부분이 적절한 씰을 생성하지 않을 가능성이 큽니다. 엄지 나사를 조이거나 튜브의 커넥터를 입구와 출구로 조이거나 센서를 다시 장착하여 O 링이 평평하고 중앙에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>유량 모듈을 통해 1x PBS의 유체 흐름이 최소 15분 동안 제대로 균형을 맞도록 합니다.</li>
	<li>컴퓨터 소프트웨어에서 측정을 시작하여 데이터 수집을 시작합니다. 안정적인 기준선을 보장하기 위해 주파수 및 소산 값을 최소 5분 동안 모니터링합니다.</li>
	<li>펌프를 중지하고 입구 튜브를 콜라겐-아세테이트 버퍼 용액으로 옮기고 유체 흐름을 재개합니다. 나중에 분석을 위해 이 이벤트의 시간을 기록해 둡것입니다.</li>
	<li>새 주파수 및 소멸 값이 안정 값과 평형화되도록 허용합니다. 여기서는 이 안정화가 8-12시간 이후에 발생할 것으로 예상합니다.</li>
	<li>펌프를 중지하고 입구 튜브를 다시 1x PBS 솔루션으로 이동한 다음 유체 흐름을 재개합니다. 나중에 분석을 위해 이 이벤트의 시간을 기록해 둡것입니다.</li>
	<li>새 주파수 및 소멸 값이 안정 값과 평형화되도록 허용합니다. 여기서, 이러한 안정화는 30분 후에 발생한다. 참고: 단계 2.13 및 2.14단계는 더 많은 스테이지를 가진 보다 엄격한 실험에서 유체 흐름의 새로운 기간마다 반복될 수 있습니다.</li>
	<li>측정의 데이터 수집을 종료하고 데이터를 저장합니다.</li>
	<li>QCM 장비를 청소하고 분해합니다.<ol>
<li>외부 펌프의 유체 유량을 500 μL/min 이상으로 높이고 입구 튜브를 2% Hellmanex 세척 용액에 20분 이상 사용합니다. 참고: 다른 실험의 경우 센서의 추가 분석이 필요한 경우 2.16.1단계 전에 센서를 제거하고 모듈에 다른 청소 센서를 배치합니다.</li>
		<li>펌프를 중지하고 입구 튜브를 dH2O로 이동하고 유체 흐름을 재개하여 시스템을 최소 20분 동안 더 플러시합니다.</li>
		<li>유체 흐름을 중지하고 유동 모듈에서 센서를 제거합니다. 센서와 플로우 모듈 내부를 질소 가스 스트림으로 건조시면 됩니다. 컴퓨터 소프트웨어, 전자 장치 및 연동 펌프를 끕니다. 참고: 금 코팅 센서는 1.3.1-1.3.4 단계에 자세히 설명된 대로 적절하게 세척할 수 있으며 여러 측정에 재사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 측정을 위해 센서를 더 이상 재사용할 수 없다는 표시에는 초기 공진 주파수의 큰 가변성 및 버퍼 흐름이 있는 기준선 측정의 상당한 드리프트가 포함될 수 있습니다. QCM-D 장비를 전문으로 하는 회사에서 제공하는 데이터를 포함하여 선호하는 소프트웨어에서 데이터를 열고 분석할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>QCM 폴리전해질 복합부종
3. 견본 준비
참고: 이 실험은 데이터 수집 및 분석을 위해 Shull 연구 그룹 내에서 개발된 MATLAB 프로그램을 사용하여 수행되었습니다.
<ol><li>먼저, 벡터 네트워크 분석기 및 컴퓨터에 연결된 샘플 홀더에 베어 쿼츠 크리스탈 센서를 배치합니다. 분석기를 켜서 센서에 진동 전압을 적용하고 공기 중의 센서에 대한 기준 전도도 스펙트럼을 수집합니다.</li>
	<li>증류수로 채워진 립리스 100 mL 비커에 샘플 홀더를 담그고 물 에서 베어 센서에 대한 기준 전도도 스펙트럼을 수집합니다.</li>
	<li>브로마이드 칼륨(KBr)의 0.5M 용액을 준비합니다.<ol>
<li>증류수 30 mL에 KBr 1.79 g을 녹입니다. 녹을 때까지 흔들어 주세요.</li>
		<li>작은 실리콘 웨이퍼를 KBr 용액에 비스듬히 삽입하여 어닐링 단계에서 석영 센서용 슬라이드를 생성하여 필름이 센서에서 떨어지도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>스핀 코팅을 위해 센서를 준비합니다.<ol>
<li>스핀 코트 매개변수를 10,000rpm, 8,000 가속 및 5초로 설정합니다.</li>
		<li>센서를 스핀 코터에 삽입하고 진공을 켭니다.</li>
		<li>에탄올로 센서 표면을 덮고 스핀 코터를 실행하여 센서 표면을 청소합니다.</li>
		<li>PEC를 추가 (PSS: PDADMA 는 사드만외. 22)센서의 표면에.<ol>
<li>복합체가 2상(중합체 풍부및 중합체 불량)인 경우, 용액에 피펫을 천천히 삽입합니다. 파이펫을 밀도가 높은 폴리머 리치 상으로 이동하면서 기포를 불어 피펫을 배출합니다.</li>
			<li>중합체 풍부상에서 몇 개의 기포를 방출한 후, 폴리머 가재가 풍부한 용액의 0.5-0.75 mL를 파이펫 내로 끌어낸다. 피펫 전구에 압력을 유지하여 중합체 불량 상이 파이펫에 진입하는 것을 허용하지 않고, 용액에서 파이펫을 꺼낸다.</li>
			<li>김와이프를 사용하여 파이펫 바깥쪽을 닦습니다. 석영 센서의 표면에 충분한 용액을 떨어뜨려 표면을 완전히 덮습니다. 센서 표면에 용액에 눈에 보이는 기포가 없는지 확인합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEC 샘플을 스핀 코팅하고 0.5 M KBr 용액에 센서를 즉시 잠수하여 필름상의 염분화를 방지합니다. 참고: 이 단계는 조정하기 어려운 경우도 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 KBr 솔루션 바로 위에 센서를 놓습니다.</li>
	<li>적어도 12 시간 동안 아닐레에 필름을 허용하십시오. 참고 : 실험을 쉽게 수행하려면 저녁에 4 단계를 준비하고 밤새 필름을 어닐로 허용하십시오.</li>
</ol>4. 공기와 물에서 필름의 측정
<ol><li>센서를 증류수로 채워진 비커로 옮겨 센서의 필름과 뒷면에서 과도한 KBr을 제거합니다. 30-60 분 동안 용액에 센서를 둡니다.</li>
	<li>공기 중 필름을 측정합니다. 공기 중의 베어 센서에 대한 참조. 필름 데이터가 평형화되도록 허용합니다.</li>
	<li>말린 황산칼슘을 100 mL 립리스 비커에 넣고 완전히 건조한 막 두께를 측정합니다. 비커에서 황산칼슘을 제거하고 비커를 증류수로 헹구어 보입니다.</li>
	<li>100 mL 립리스 비커에 30 mL의 증류수를 채웁니다. 물이 필름 주위를 순환하고 있는지 확인하기 위해 교반 막대를 삽입합니다. 약 30-45 분 동안 또는 필름 데이터가 평형 될 때까지 물로 필름을 측정하십시오. 물에 베어 센서에 대한 참조.</li>
	<li>증류수에서 3 M KBr의 15 mL 용액을 준비합니다. KBr 5.35 g을 그라디드 실린더에 넣고 증류수로 15 mL로 채웁니다. 녹을 때까지 소용돌이.</li>
	<li>0.1M 단위로 증류수를 사용하여 비커에 KBr 용액을 추가합니다. 표 1은 3M KBr 용액의 mL에서 0.1M 증분을 간략하게 설명합니다. 필름이 용해되지 않도록 KBr 용액이 물에 첨가되는 곳에서 필름을 향하십시오. KBr 솔루션을 추가하기 전에 시스템이 평형화되었는지 확인합니다.</li>
	<li>모든 데이터가 수집 된 후, 홀더에서 필름을 제거하고 증류수의 비커에 배치합니다. 소금이 필름(30-60분)을 남기고 필름을 공기 건조시키십시오.</li>
	<li>센서에서 PEC 필름을 청소하려면 비커에 KBr을 추가하고 용액을 부드럽게 돌루십시오. 5-10 분 동안 앉아 있게하십시오. 이 과정을 2-3 번 반복한 다음 증류수로 센서를 헹구어 보입니다. 참고: 센서의 반응이 여전히 양호한 경우 센서를 청소하고 재사용할 수 있습니다. 이것은 관심의 고조파 (&lt;100 Hz)에 대한 작은 절대 대역폭 판독값을 갖는 센서에 의해 확인 될 수있다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>[https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI]27에서만든 QCM-D 데이터 분석<a href="https://github.com/sadmankazi/QCM-D-Analysis-GUI" target="_blank">[27]</a> "QCM 로드"를 선택하여 공기 데이터 파일에서 필름을 엽니다. 참고 : Shull 그룹은 QCM<a href="https://github.com/shullgroup/rheoQCM" target="_blank">(https://github.com/shullgroup/rheoQCM)에</a>대한 데이터 수집 및 분석을위한 유사한 파이썬 GUI를 개발했습니다. 분석 코드의 일부는 데이터를 분석하고 이 백서에서 수치를 생성하기 위한 보충 정보에 제공된다.</li>
	<li>공기 아이콘에서 원하는 계산(3,5,3 또는 3,5,5), 감마및 필름을 선택합니다. 플롯 QCM을 클릭합니다.</li>
	<li>실험에서 가장 균형 이평이 조정된 데이터 포인트(일반적으로 마지막 데이터 점)를 사용하여 건조 필름의 두께를 결정합니다. 이 값을 기록합니다.</li>
	<li>물 데이터 파일에서 필름을 엽니다. 5.2단계에서와 동일한 매개변수를 선택하지만, 공기 중의 필름 대신 물에 있는 필름을 제외합니다.</li>
	<li>팽윤 실험의 각 평형 단계 후, 막 두께, 복잡한 전단 계수 및 점탄성 상 각을 결정한다. 이온 강도(0-1M 단위로 0-1M)와 함께 이러한 값을 기록합니다.</li>
	<li>백분율 부종을 결정합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60584/60584eq3.jpg">(3) 여기서 dp는 용액으로부터의 막 두께이고 dp건조는 건조필름 두께이다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

콜라겐 흡착 결과는 사우어브레이 및 점탄성 정권에 걸쳐 있습니다. 해당 고조파 수로 정규화된 주파수 시프트를 플로팅함으로써 Sauerbrey 한계가 측정의 처음 2시간 동안 유효합니다. 그러나 센서에 대한 질량 준수량이 증가함에 따라 세 번째 및 다섯 번째 고조파에 대한 정규화된 주파수 이동이 서로 이탈하기시작합니다(t &gt; 2 h)는 흡착 필름의 점탄성 특성을 결정하는 능력을 나타냅니다.
소프트웨어의 점탄성 모델링 결과와 Shull 그룹의 전력 법칙 모델링을 직접 비교하면 계산된 재료 특성이 눈에 띄는 차이를 나타냅니다. 측정 과정에서 상용 소프트웨어의 점탄성 모델링 데이터는 더 낮은 복잡한 전단 계수를 가진 더 두껍고 부드러운 층을 나타내었다(그림5). 이러한 모델 간의 점탄성 특성의 차이는 각 시스템에 대한 계산에서 가정했기 때문입니다. 한 가지 차이점은 점탄성 특성의 주파수 의존도에 대해 이루어져야 ...

석영 크리스탈 마이크로 밸런스 (QCM)는 표면에 부착 된 질량에 의존하는 공진 주파수를 모니터링하기 위해 석영 결정의 압전 효과를 활용합니다. 이 기술은 AT 컷 석영 결정 센서의 공진 주파수 및 대역폭(전형적으로 5MHz범위)의 공기 또는 유체를 필름증착 후 센서의 주파수 및 대역폭과 비교합니다. QCM을 사용하여 질량에 대한 높은 감도 및 점탄성 특성 변화(샘플 균일도 및 두께에 따라 다름), situ2에서연구를 수행할 수 있는 능력 및 기존 전단 유변학 또는 동적 기계적 분석(DMA)보다 훨씬 짧은 유변학 적 시량을 조사하는 기능을 포함하여 박막 특성 및 인터페이스를 연구하는 데는 몇 가지 이점이 있습니다. 짧은 유변학적 시간 척도를 조사하면 이 시점의 응답이 매우 짧은 (ms)3 및 긴(년) 기간 동안 어떻게 변경되는지 관찰할 수 있습니다4. 이 기능은 다양한 운동 과정의 연구에 유익하며 또한 전통적인 유변학 기술5,6의유용한 확장이다.
QCM의 높은 감도는 또한 극히 작은 생체 분자의 근본적인 상호 작용을 연구하는 생물학 응용에 있는 그것의 무거운 사용으로 이끌어 냈습니다. 코팅되지 않았거나 기능화된 센서 표면은 단백질 흡착을 조사하는 데 사용될 수 있습니다. 더욱이, 효소, 항체 및 압타머 사이의 복잡한 결합 이벤트를 통한 바이오센싱은 질량7,8,9의변화에 기초하여 조사될 수 있다. 예를 들어, 이 기술은 주파수 및점탄성(10)의상관관계를 관찰함으로써 유체-함유 소포를 경질 구조로 흡착하는 2상 과정으로서 평면 지질 이중층으로 소포의 변형을 이해하는 데 사용되어 왔다. 최근 몇 년 동안, QCM은 소포 또는 나노 입자(11)에의한 약물 전달을 모니터링할 수있는 강력한 플랫폼을 추가로 제공했다. 재료 공학 및 분자 및 세포 생물학의 교차점에서, 우리는 단백질, 핵산, 리포솜 및 세포와 같은 물질과 생리 활성 성분 사이의 주요 상호 작용을 해명하기 위해 QCM을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 생체물질에 대한 단백질 흡착은 염증과 같은 하류 세포 반응을 중재하고 생체 적합성의 긍정적인 지표로 자주 사용되며, 다른 경우에는 혈액과 접촉하는 코팅에 세포외 단백질 부착이 혈관12,13에서위험한 응고를 유도할 수 있다. 따라서 QCM은 다양한 요구에 적합한 후보를 선택하는 도구로 사용할 수 있습니다.
QCM 실험을 수행하기 위한 두 가지 일반적인 접근법은 실험으로부터 유사한 데이터를 수집합니다: 제1 접근법은 전도도 피크의 주파수 시프트 및 반대역폭(Γ)을기록합니다. 두 번째 접근법인 QCM(D)은 주파수 시프트와 발산 계수를 기록하며, 이는 방정식 1,14를 통해 Γ에 정비례합니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60584/60584eq1.jpg">(1)
여기서 D는 소멸 계수이고 θ는 주파수입니다. D와 Γ 는 필름이 센서에 미치는 감쇠 효과와 관련이 있으며, 이는 필름의 강성을 나타냅니다. 서브스크립트 n은 쿼츠 센서의 홀수 공진 주파수인 주파수 배음 또는 고조파를 나타냅니다(n = 1, 3, 5, 7...). 필름의 질량 및 점탄성 특성을 얻기 위해 다중 고조파를 사용하는 모델에 대한 추가 논의는 요한스만14 및 Shull 그룹15,16,17,18의이전 논문에 의한 검토에서 찾을 수 있다.
QCM 샘플을 준비하기 위한 한 가지 주요 고려 사항은 센서 표면에 박막을 적용하는 방법입니다. 몇 가지 일반적인 방법은 실험19,20동안 센서 표면에 필름의 스핀 코팅, 딥 코팅, 드롭 코팅, 또는 흡착을 포함한다. QCM 샘플에는 사우어브레이 한계, 점탄성 정권, 벌크 정권 및 과다 댐프드 정권의 네 가지 영역이 있습니다. 충분히 얇은 필름의 경우, 사우어브레이 한계가 적용되며, 여기서 주파수시프트(Δδ)는 필름의 표면 질량 밀도를 제공한다. Sauerbrey 한계 내에서 주파수 시프트는 공진 고조파, n 및 감쇠 계수(D 또는 Γ)의변화에 따라 선형으로 스케일링됩니다. 이 정권에서 충분한 정보는 추가 가정을하지 않고 계층의 유변학적 특성을 고유하게 결정할 수 없다. 이 정권의 데이터는 필름의 표면 질량 밀도(또는 밀도가 선험적이라고알려진 경우 두께)를 계산하는 데 사용됩니다. 결정과 접촉하는 매체가 충분히 두꺼운 벌크 정권에서, 전단 전단 파는 완전히 완충되기 전에 매체로 전파됩니다. 여기서, Δ를 사용하여 질량 정보를 얻을 수 없다. 그러나, 이 지역에서, 점탄성 특성은 Δδ 및 ΔΓ 15,18의조합을 사용하여 안정적으로 결정된다. 벌크 정권에서 매체가 너무 단단하면 필름이 센서의 공명을 축축하게하여 QCM에서 신뢰할 수있는 데이터의 수집을 방지합니다. 점탄성 정권은 필름이 필름을 통해 완전히 전파될 수 있을 만큼 필름이 충분히 얇을 뿐만 아니라 감쇠 계수에 대한 신뢰할 수 있는 값을 가지는 중간 정권입니다. 감쇠 계수 와 Δδ는 필름의 점탄성 특성뿐만 아니라 질량을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서, 점탄성 특성은 복합 전단 계수의 밀도 및 크기의 생성에 의해 주어진 | G*| p 및 Φ = 아크탄(G"/ G')에의해 주어진 위상 각도. 필름이 사우어브레이 한계에서 제조될 때, 단위 면적당 질량은21이하의 Sauerbrey 방정식에 따라 직접 계산될 수 있습니다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60584/60584eq2.jpg">(2)
여기서 Δ는공진 주파수의 변화, n은 관심의 배음이고, θ1은 센서의 공진 주파수이고, Δ m/A는 필름의 면적당 질량이고, Z q는 쿼츠의 음향 임피던스이며, AT 컷 쿼츠는 Zq = 8.84 x 106 kg/m2s이다. 점탄성 정권은 중합체 막의 연구에 가장 적합하며, 벌크 한계는 점성 중합체22 또는 단백질용액(16)을연구하는데 유용하다. 다른 정권은 관심있는 재료의 특성에 따라 달라지며, 전체 점탄성 및 질량 특성화를위한 최적의 두께는 일반적으로 필름 강성에 따라 증가합니다. 도 1은 필름의 아리얼 밀도, 복잡한 전단 계수 및 위상 각도에 대하여 4개의 영역을 설명하며, 여기서 우리는 위상 각도와 이러한 유형의 재료와 관련이 있는 것으로 나타난 필름 강성 사이의 특정 관계를 가정했습니다. 실용적인 관심의 많은 필름은 두께가 수십 에서 수백 미크론23의순서에있는 특정 생물 막과 같은 QCM을 사용하여 점탄성 특성을 연구하기에 너무 두껍습니다. 이러한 두꺼운 필름은 일반적으로 QCM을 사용하여 연구하기에 적합하지 않지만 훨씬 낮은 주파수 공진기(예:비틀림 공진기)(예: 비틀림 공진기)를 사용하여 측정될 수 있으며, 전단파가 필름 내로 더 전파될 수 있도록 한다.
주어진 QCM 샘플과 어떤 식이 관련이 있는지 를 결정하기 위해, 액영 결정 센서의 기계적 진동에 대한 필름두께(d)의비율인 d/λ n 파라미터를 이해하는 것이 중요하다(λn)15,16, 18. 이상적인 점탄성 정권은 d /λn = 0.05 - 0.218이며,여기서 0.05 미만의 값은 Sauerbrey 한계 내에 있고 0.2 이상의 값은 벌크 정권에 접근합니다. d/λ n에 대한 보다 엄격한 설명은 다른곳에서 15,18,제공되지만, 사우어브레이 한계 및 점탄성 한계를 delineating 하는 정량적 파라미터이다. 아래 에서 사용되는 분석 프로그램은 이 매개 변수를 직접 제공합니다.
QCM으로 박막을 분석하는 데는 몇 가지 추가 제한사항이 있습니다. Sauerbrey 및 점탄성 계산은 필름 두께 전체와 QCM의 전극 표면을 가로질러 필름이 균일하다고 가정합니다. 이 가정은 공극이나 필러가 존재하는 필름을 연구하는 것을 어렵게 만드는 동안, 접목 된 나노 입자6로구성된 필름에 대한 몇 가지 QCM 조사가 있었습니다. 전체 막 두께에 비해 이질성이 작으면 복합 시스템의 신뢰할 수 있는 점탄성 특성을 여전히 얻을 수 있습니다. 보다 이질적인 시스템의 경우 점탄성 분석에서 얻은 값은 항상 신중하게 보아야 합니다. 이상적으로는 알 수 없는 이질성이 있는 시스템에서 얻은 결과를 균질한 것으로 알려진 시스템에 대해 검증해야 합니다. 이 문서에서 설명하는 예제 시스템에서 수행한 접근 방식입니다.
이 백서에서 설명하는 중요한 점은 주파수 도메인(Γ가 보고되는 위치)에서 수행된 QCM 측정과 시간 도메인 실험(D가 보고되는 위치) 간의 정확한 대응입니다. 두 개의 서로 다른 QCM 실험( 일회성 도메인 및 하나의 주파수 도메인)의 결과가 각각 다르지만 개념적으로 관련된 모델 시스템을 수반하는 것으로 설명되어 있습니다. 첫 번째 시스템은 시간 영역(QCM-D) 측정 동안 시간에 걸친 대표적인 결합 역학 및 흡착의 평형을 설명하기 위해 센서에 콜라겐 부착의 간단한 예입니다. 콜라겐은 신체에서 가장 풍부한 단백질로, 결합 행동과 형태학의 다양성으로 알려져 있습니다. 여기서 사용되는 콜라겐 용액은 흡착을 유도하기 위해 센서의 금 표면의 추가적인 기능화를 필요로 하지 않는다9. 상기 제2 실험 시스템은 음이온성 폴리스티렌 설포네이트(PSS) 및 양이온폴리(diallyldimethylammonium)(PDADMA)로 구성된 다연화 복합체(PEC)가 사드만 등22와동일한 방식으로 제조된다. 이러한 재료는 팽창하고 염 (이 경우 KBr) 솔루션에 부드러운된다, 주파수 도메인 접근 방식을 사용하여 폴리머 역학을 공부하기위한 간단한 플랫폼을 제공 (QCM-Z). 각 프로토콜에 대해 측정을 준비, 복용 및 분석하는 프로세스는 그림 2에나와 있습니다. 회로도는 QCM-Z와 QCM-D 접근법간의 주요 차이점이 실험에 사용된 데이터 수집 단계와 계측에 있음을 보여줍니다. 언급된 모든 샘플 전처리 기법은 두 가지 접근법과 호환되며, 각 접근법은 도 1에도시된 세 가지 영역에서 샘플을 분석할 수 있다.
우리의 데이터는 측정 전이나 측정 중에 센서 코팅에 의한 시료의 제조가 시스템의 점탄성 특성을 추출하는 능력을 지시한다는 것을 보여줍니다. 실험의 초기 단계를 적절하게 설계하여 분석 단계에서 정확하게 수집할 수 있는 정보를 결정할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>콜라겐 흡착 용</td></tr> 수<tr><td>산화 암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221228</td><td>콜라겐 흡착</td></tr><tr><td>용 수성 QCM 프로브</td><td>AWSensors</td><td>CLS 00050 A</td><td>: 고분자 전해질 팽창</td></tr><tr><td>용 콜라겐 I 쥐 단백질, 꼬리</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td>콜라겐 흡착 용</td></tr><tr><td>증류수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EM3234</td><td>고분자 전해질 팽창용; 일반적으로 연구 실험실에서 쉽게 얻을 수 있지만 접근할 수 없는 경우를 대비하여 카탈로그 번호가 있습니다</td></tr><tr>.<td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793175-1GA-PB</td><td>고분자 전해질 팽창용</td></tr><tr><td>Gibco Phosphate Buffered Saline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012-027</td><td>콜라겐 흡착</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z805939</td><td>콜라겐 흡착용</td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td>콜라겐 흡착용</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-Ply</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>고분자 전해질 팽창용</td></tr><tr><td>NP2K VNA</td><td>Makarov 기기</td><td></td><td>고분자 전해질 팽창용</td></tr><tr><td>폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드), MW 200,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409022</td><td>고분자 전해질 팽창의 경우, 전체 합성 절차는 Sadman et al.을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>폴리(스티렌-설포네이트) 나트륨 염 30% 물에 중량</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>561967-500G</td><td>고분자 전해질 팽창용; 전체 합성 절차는 Sadman et al.을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>브롬화 칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>793604-1KG</td><td>고분자 전해질 팽창</td></tr><tr><td>용 QSense QCM 탐색기 시스템</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td>콜라겐 흡착</td></tr><tr><td>용 아세트산 나트륨, 무수</td><td>시그마 -알드리치</td><td>S2889</td><td>콜라겐 흡착</td></tr><tr><td>용 스핀 코터, 모델 WS-650MZ-23NPP</td> 고<td>분자 전해질 팽창 용</td> <td>로렐 기술</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 흡착 및 폴리머 역학의 석영 결정 미세 균형 측정시 시료 준비

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

이 연구에서는 석영 결정 미세 균형 실험에 대한 박막 준비가 데이터의 적절한 모델링을 알리고 필름의 특성을 정량화할 수 있는 방법을 결정하는 다양한 예제를 제시합니다. 석영 크리스탈 마이크로밸런스는 고주파로 진동하는 석영 결정의 기계적 공명 변화를 관찰하여 적용된 필름의 질량 및/또는 기계적 특성의 미세한 변화를 측정하기 위한 독특하고 민감한 플랫폼을 제공합니다. 이 방법의 장점은 실험적 다양성, 광범위한 실험 시간 길이에 대한 특성 의 변화를 연구할 수 있는 능력, 작은 샘플 크기의 사용 등이 있습니다. 센서에 증착된 층의 두께와 전단 계수를 기반으로 재료와 다른 정보를 얻을 수 있음을 입증합니다. 여기서, 이 개념은 특히 염 농도의 함수로서 팽창 시 금 및 다연산염 복합체에 흡착된 콜라겐의 질량 및 점탄성 계산을 초래하는 실험 파라미터를 표시하기 위해 이용된다.

단백질 흡착 시 시간에 따라 빈도의 변화는 도 3A-B에도시된 특징적인 곡선 및 고원을 나타낸다. 베어 센서 표면에 걸쳐 1x PBS의 초기 버퍼 세척은 주파수의 무시할 만한 변화만유도하여 향후 데이터 포인트에 대한 참조역할을 하는 안정적인 기준선을 제공합니다. 콜라겐 용액의 도입은 단백질 흡착을 시작하게 하고, 시간이 지남에 따라 고착된 콜라겐고원의 밀도가 안정된 기준선에서 감소할 때까지 관찰된다(그림3A). 정확한 주파수 와 질량 값은 센서의 순도와 표면 에너지에 크게 좌우됩니다. 이러한 파라미터를 감안할 때, 최종 버퍼 워시는 센서 표면에서 소량의 부착되지 않은 단백질만 제거하여 주파수가 약간 증가합니다. 우리는 항상 이 기간 동안 질량의 단지 약간 감소를 기대해야, 센서에 결합 된 단백질의 안정적인 양을 보여주는(그림 ...

석영 크리스탈 마이크로 저울은 생물 의학 및 환경 감지, 코팅 및 폴리머 과학의 조사와 관련된 미크론 또는 서브미크론 범위의 필름에 대한 정확한 질량 및 점탄성 특성을 제공할 수 있습니다. 샘플 두께는 센서와 접촉하는 재료로부터 정보를 얻을 수 있는 영향을 미칩니다.

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...

석영 결정 마이크로 밸런스는 다른 화합물의 작은 농도를 감지하는 데 유용하며 연질 물질 및 생체 재료 시스템의 역학에 관한 질문에 적용 될 수 있습니다. 주요 장점은 석영 결정 마이크로 밸런스가 작은 샘플 크기에 대한 매우 정확한 정보를 얻을 수 있다는 것입니다. 기계적 특성 정보를 추출할 때적절한 두께의 필름으로 작업할 필요가 있습니다.연구원은 분석 하는 동안 필름에 대 한 올바른 모델링을 적용 하는 신중 해야 합니다. 이 기술은 광범위한 재료 시스템을 연구하고 중합체 재료의 기계적 특성이 환경에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 적합합니다. 필요한 모든 장비를 켠 후 챔버 플랫폼에서 유량 모듈을 제거하고 큰 엄지 나사를 풀어 모듈을 엽니다.질소 가스 스트림으로 유량 모듈의 O-링을 건조시키고 O 링이 평평하게 놓여 있는지 확인합니다. 센서를 활성 표면 면을 아래로 배치하고 유동 모듈의 마커를 지향하는 앵커 모양의 전극을 배치하여 O 링에 센서를 장착합니다. 센서의 초기 공진 주파수를 찾습니다.입구 펌프 튜브를 1X PBS에 배치합니다. 분당 25 마이크로리터에서 외부 펌프 흐름을 시작하고 튜브를 육안으로 검사하여 유체가 튜브를 통해 흐르는지 확인합니다. 유체 흐름이 적어도 15분 동안 적절하게 평형화되도록 합니다.소프트웨어에서 시작 측정을 눌러 측정을 시작하고 데이터 수집을 시작합니다. 안정적인 기준선을 보장하기 위해 주파수 및 소멸 값을 최소 5분 동안 모니터링합니다. 펌프를 멈추고 유입구 튜브를 콜라겐 아세테이트 버퍼 솔루션으로 이동하고 유체 흐름을 재개합니다.이후 분석을 위해 이 이벤트의 시간을 기록합니다. 새로운 주파수 및 소멸 값을 안정적인 값으로 8~12시간 동안 평형화한 다음 펌프를 멈추고 입구 튜브를 1X PBS 솔루션으로 다시 이동하고 유체 흐름을 재개할 수 있습니다. 이후 분석을 위해 이 이벤트의 시간을 기록합니다.다시 말하지만, 새 주파수 및 소멸 값을 30분 동안 안정적으로 평형화할 수 있도록 합니다. 측정의 데이터 수집을 종료한 다음 데이터를 저장합니다. 먼저, 벡터 네트워크 분석기 및 컴퓨터에 연결된 샘플 홀더에 베어 쿼츠 크리스탈 센서를 배치한다.분석기를 켜서 센서에 진동 전압을 적용하고 공기 중의 센서에 대한 기준 전도스펙트럼을 수집한 다음, 증류수로 채워진 립리스 100 밀리리터 비커에 샘플 홀더를 침수하고 물 속에 있는 베어 센서에 대한 기준 전도 스펙트럼을 수집한다. 작은 실리콘 웨이퍼를 0.5 어금니 칼륨 브로마이드 용액에 삽입하여 아닐링 단계에서 석영 센서용 슬라이드를 만들어 필름이 센서에서 꺼지 않도록 합니다. 센서 표면에 PEC를 추가할 준비를 합니다.PEC 복합체가 2상에 있는 경우, 폴리머가 풍부한 상의 약 0.5 밀리리터를 파이펫으로 조심스럽게 끌어들입니다. 파이펫 전구에 압력을 유지하여 폴리머 가난한 위상이 파이펫에 진입할 수 없으며, 피펫을 용액에서 끌어낸다. 화학 닦아를 사용하여 파이펫의 외부를 닦아.석영 센서 표면에 충분한 솔루션 드롭을 추가하여 표면을 완전히 덮습니다. 센서 표면에 솔루션에 눈에 보이는 기포가 없는지 확인합니다. PEC 샘플을 스핀 코팅하고 필름의 염 결정화를 방지하기 위해 0.5 어금다 칼륨 브로마이드 용액에 센서를 즉시 침수합니다.필름을 최소 12시간 동안 음막으로 허용합니다. 센서를 증류수로 채워진 비커로 옮기면 필름과 센서의 뒷면에서 과도한 칼륨 브로마이드를 제거합니다. 센서를 30~60분 동안 솔루션에 둡니다.공기 중의 베어 센서를 참조하는 공기 중 센서 표면에 적용된 필름을 측정합니다. 필름 데이터를 평형화하도록 허용합니다. 다음으로 말린 칼슘 황산염을 100밀리리터 립리스 비커에 넣고 완전히 건조한 필름 두께를 측정합니다.비커에서 황산칼슘을 제거하고 증류수로 비커를 헹구는 다. 증류수 30밀리리터로 100밀리리터 립리스 비커를 채웁니다. 교반 바를 삽입하여 물이 필름 주위를 순환하고 있는지 확인합니다.물 속의 베어 센서를 참조하여 필름을 약 30~45분 동안 또는 필름 데이터가 평형화될 때까지 물에서 측정합니다. 브로마이드 칼륨 5.35그램을 졸업한 실린더에 넣고 증류수로 15밀리리터를 채우면 브로마이드 3개의 어금니 칼륨 15밀리리터 용액을 준비합니다. 용해 될 때까지 소용돌이.필름이 용해되지 않도록 브로마이드 칼륨 용액이 물에 첨가되는 곳에서 필름을 마주하십시오. 0.1 의 어금니 단위로 증류수를 가진 비커에 브로마이드 칼륨 용액을 추가합니다. 브로마이드 칼륨 용액을 추가하기 전에 시스템이 평형화되었는지 확인하십시오.모든 데이터가 수집 된 후, 홀더에서 필름을 제거하고 증류수의 비커에 배치합니다. 소금이 필름을 30~60분 동안 그대로 두고 공기를 건조시키십시오. 이 연구에서는, 콜라겐 용액의 도입은 단백질 흡수를 시작하여 안정적인 기준선에서 부착된 콜라겐 고원의 밀도가 될 때까지 시간이 지남에 따라 주파수의 꾸준한 감소와 소멸의 증가로 관찰되었다.주파수 변화는 필름의 질량과 상관관계가 있으며, 소멸은 필름의 에너지 소멸과 상관관계가 있습니다. 점탄성 특성을 정량적으로 얻기 위해서는 이론적 모델이 필요합니다. 전력법 모델을 이용한 콜라겐의 점성탄성 분석은 각각 공중 질량, 복잡한 전단 계수 및 점탄성 위상 각을 나타낸다.처음 10시간은 20시간 동안 완충세척이 수행되기 전에 평형 단계를 나타내는 10~20시간 사이의 기간으로 센서 표면에 콜라겐의 주요 흡착 단계를 나타낸다. 다음은 QCM을 사용하여 측정된 샘플의 일반적인 범위에 걸쳐 점성탄성 상 각 및 복잡한 전단 계수계계의 플롯이다. 녹색 선은 두 속성 간의 선형 관계를 나타냅니다.이 플롯은 PEC가 시스템의 폴리머, 물 및 소금의 비율을 기반으로 광범위한 기계적 특성을 입증할 수 있는 방법을 보여줍니다. 샘플 준비는 QCM 실험의 결과에 직접적인 영향을 줍니다. 샘플에서 배우고자 하는 데이터를 이해하면 샘플이 얼마나 두껍게 만들어야 하는지 알 수 있습니다.QCM은 환경 및 생물학적 프로세스를 감지하는 데 매우 유용합니다. 또한 재료의 점성을 특성화하기 위한 고주파 정권의 유변학적 거동을 조사할 수 있다.

sample-preparation-quartz-crystal-microbalance-measurements-protein

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이것은 목적, 운영, 그리​​고 소설 중력이 분석기의 결과를 보여주는 대표을 단계별로 안내합니다.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

무기 표면에 단백질이 아닌 구체적인 흡착을 모니터링하는 고체 nanopores를 사용하는 방법을 설명합니다. 방법은 실시간과 단일 분자 수준에서 탐색할 수 흡착 수있게 저항 펄스의 원칙을 사용합니다. 하나의 단백질 흡착 과정 멀리 평형에서이기 때문에, 우리는 양적 단백질 흡착의 상수 명백한 처음 주문 반응 속도의 결정뿐만 아니라 및 Langmuir 흡착 상수 사용, 합성 nanopores의 병렬 배열의 고용을 제안합니다.

고체 Nanopores와 모니터링 단백질 흡착

이 비디오는 단백질과 지질 이중층의 결합을 조사하기 위한 소산 미세중량 측정 기술을 보여줍니다. 작은 단층 소포(unilamellar vesicles)가 추가되어 마이크로 저울의 석영 센서 표면을 코팅합니다. 표적 인지질 결합 단백질의 이중층에 대한 칼슘 이온 의존적 결합을 활용하여 센서의 진동 빈도 변화와 진동의 소실을 모니터링하여 단백질-지질 이중층 결합의 특성을 결정합니다.

단백질-지질 이중층 상호작용을 연구하기 위한 소산 미세중량 측정 기법

이 동영상은 T7 파지 표시 펩타이드 라이브러리의 QCM 바이오센서 기반 바이오패닝을 사용하여 단백질-약물 상호작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. QCM 바이오센서에 특정 펩타이드를 표시하는 파지의 바이오패닝을 통해 친화성이 높은 펩타이드를 특이적으로 분리한 다음 아미노산 염기서열분석을 수행하여 표적 단백질의 특정 상호 작용 부위를 식별할 수 있습니다.

Quartz-Crystal Microbalance 바이오센서 기반 바이오패닝으로 단백질-약물 상호작용 연구

접촉 브러시에 대한 마찰력 현미경 실험을 수행하는 방법론이 제시됩니다 : (a) 기판과 (b) 콜로이드 프로브에서 접목 된 두 개의 폴리머 브러시를 슬라이딩하여 두 개의 접촉 비 혼화성 브러시 시스템을 사용함으로써 슬라이딩 접촉의 마찰이 혼합 브러시 시스템에 비해 감소한다는 것을 보여줍니다.

고분자 브러쉬를 반대 섞이지의 준비 및 마찰 힘 현미경 측정,

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

수성 시스템에서 금의 흡착 및 재활용에 대한 기본 정보를 얻기 위해 S층 단백질에서 Au(III) 및 Au(0) 나노 입자의 상호 작용을 조사했습니다. 단백질 고분자의 흡착은 ICP-MS에 의해, 단백질성 단층의 흡착은 QCM-D에 의해 조사되었습니다. 후속 AFM은 나노 구조의 이미징을 가능하게 합니다.

Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용<em&gt; Lysinibacillus 스패 리 쿠스</em&gt; JG-B53 - QCM-D, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 ICP-MS와 AFM

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

당사는 폴리전해질 복합 미셀, 폴리전해질 및 친수성 전하 충전되지 않은 블록 공중합체에 의해 형성된 코어 쉘 나노입자를 설계, 조립 및 특성화하기 위한 프로토콜 및 대표 데이터를 제공합니다.

폴리전해질 복합 미셀의 조립 및 특성화

본 프로토콜은 인간 건강에 중요한 역할을 하는 두 모델 단백질의 구조 및 역학을 조사하는 방법을 기술한다. 이 기술은 벤치 탑 생물 물리학 적 특성화와 중성자 스핀 에코 분광법을 결합하여 단백질 간 운동과 관련된 시간 및 길이 스케일의 역학에 액세스합니다.

중성자 스핀 에코 분광법을 통한 단백질 역학 연구

배우세요 석영 결정 미세 균형(QCM)을 활용한 단백질 흡착 및 폴리머 역학 측정 방법을. 적절한 시료 두께와 정확한 모델링을 통해 연성 물질과 생체 재료의 기계적 특성을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

단백질 흡착 및 폴리머 역학의 석영 결정 미세 균형 측정시 시료 준비

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