Name: 초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: 배우세요 Drosophila 유충의 oenocyte 해부와 BODIPY 493/503을 이용한 지질 물방울 염색법. 이 방법은 정상 및 스트레스 조건에서 지질 대사를 연구하고 유전적·환경적 영향을 조사하는 데 활용됩니다.

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1. 계란 누워
<ol><li>계란 누워 표준 옥수수 가루 음식을 준비합니다. 참고: 여기에서 사용되는 표준 옥수수 가루 식품에 대한 조리법 및 조리 절차는 이전에 게시 된 세부사항 15를참조하십시오.</li>
	<li>50 mL 원심 튜브에 활성 건조 효모 4g에 증류수 6 mL을 추가하여 신선한 효모 페이스트를 준비합니다. 주걱을 사용하여 섞어서 페이스트를 만듭니다.</li>
	<li>옥수수 가루 음식을 병에 채우고 약 1 g의 효모 페이스트를 주걱으로 옥수수 가루 음식의 표면에 펴서 계란 누워 병을 만듭니다.</li>
	<li>원하는 유전자형의 파리를 계란 누워 병에 놓고 25 ° C의 일정한 온도와 60 %의 습도로 인큐베이터에 놓습니다. 참고: 이상적인 십자가는 일반적으로 150 처녀 파리와 적어도 75 남성으로 구성되어 있습니다. 계란 누워 병 위에 방대한 상자를 배치하여 어두운 파리를 유지하는 것은 재생 속도를 증가시킬 것이다.</li>
	<li>계란 수집 하기 전에, 파리 여성 난관에 저장 남아 있는 모든 오래 된 계란의 제거를 허용 하기 위해 1 시간 동안 계란을 낳을 수 있습니다.</li>
	<li>파리가 1 시간 동안 새로운 계란 누워 병에 계란을 낳고 병에서 성인을 제거하자. 참고: 계란 누워 시간을 제어하여 정확하게 제어된 발달 단계 내에서 애벌레를 얻기 위해 발달 범위를 최소화한다.</li>
	<li>계란이 12 h/12 h의 빛/어두운 주기로 25°C에서 인큐베이터에서 세 번째 인스타 애벌레로 84시간 동안 발달하도록 허용합니다.</li>
</ol>2. 애벌레에 대한 기아 치료
참고: 위에서 언급한 바와 같이, 제3의 instar 애벌레에서는, 정상적인 수유 조건 하에서 에노세포에서 검출 가능한 지질 방울이 거의 없거나 전혀 없지만, 수많은 큰 지질 방울은 기아와 같은 스트레스 조건 하에서 에노세포에서 유도될 수 있다. 이 방법을 추가로 확인하려면 이러한 유충을 퇴각하여 에노세포에서 지질 방울 생물 발생을 유도할 필요가 있습니다. 여기서, 12 시간, 24 시간 및 36 시간의 기아 시간 코스가 패러다임으로 선택되었습니다. 특히, 짧은 기간의 기아(예를 들어, 3시간)는 에노세포에서 검출 가능한 지질 방울을 유도하기에 충분하다. 기아 기간은 특정 실험 목표 및 설정에 따라 다를 수 있습니다.
<ol><li>기아 및 제어 치료를위한 챔버를 확인합니다.<ol>
<li>기아 처리 챔버의 경우: 6cm 페트리 접시에 적절한 크기의 필터 페이퍼를 놓고 PBS 1 mL을 필터 용지에 놓습니다.</li>
		<li>제어 처리 챔버: 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품 5 mL을 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주걱을 사용하여 여전히 음식에 잠복하고있는 애벌레가 들어있는 음식의 상단 층을 부드럽게 파고 PBS 5 mL로 채워진 페트리 접시로 옮습니다. PBS에서 애벌레를 부드럽게 저어서 애벌레의 음식 오염을 제거하고 가능한 한 깨끗하게 만듭니다.</li>
	<li>작은 페인트 브러시를 사용하여 동일한 대략적인 크기의 40세 instar 애벌레를 수집합니다. 기아 또는 제어 챔버로 무작위로 정렬, 와 함께 20 애벌레 각.</li>
	<li>챔버를 60% 습도로 25°C에서 인큐베이터에 놓고 12시간, 24시간 및 36시간 처리를 위한 개발을 허용합니다. 참고: 기아 챔버의 애벌레의 경우, 애벌레 탈수를 피하기 위해 12 시간마다 PBS 1 mL을 추가하십시오.</li>
</ol>3. 에노세포 해부
<ol><li>작은 페인트 브러시를 사용하여 적절한 연령 (12 시간, 24 시간 또는 치료 후 36 시간)의 애벌레를 선택한 다음 5 mL의 얼음 차가운 PBS로 채워진 새로운 페트리 접시로 옮기십시오. 참고: 대조군실에서 애벌레를 다룰 때 2.2단계를 반복하여 식품 오염을 제거한다.</li>
	<li>얼음으로 차가운 PBS로 해부 판을 채우고 집게를 사용하여 유충을 해부 판으로 부드럽게 옮니다. 해부판을 스테레오 현미경 으로 넣어 다음 해부 단계를 진행한다. 참고: 얼음 차가운 온도는 유충의 움직임을 느리게하고 해부를 용이하게하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>애벌레 복부 쪽을 위로 돌리고 등쪽쪽을 아래로 돌리고 집게를 사용하여 제자리에 부드럽게 잡습니다. 전방 끝에 인두를 가두어 해부 핀을 배치하고 후부 끝에 있는 첨탑을 통해 다른 핀을 배치하여 해부 판에 애벌레를 고정시다. 참고: 등쪽 은 기관의 등쪽 트렁크의 존재에 의해 가장 쉽게 식별됩니다.</li>
	<li>Vannas 스프링 가위를 사용하여 앞쪽에서 후방 끝까지 표피를 통해 (세로로) 절개하십시오.</li>
	<li>집게를 사용하여 표피의 내부 조직을 제거하십시오. 참고: 표피의 내부 표면에 국한되어있는 세포에 손상을 피하기 위해 기관 가지를 제거 할 때주의해야합니다.</li>
	<li>집게를 사용하면 해부 핀을 회수하고 표피를 얼음 위에 PBS로 채워진 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 제거합니다.</li>
	<li>위에서 설명한 절차에 따라 다른 애벌레를 계속 해부하십시오.</li>
</ol>4. 지질 방울 염색
<ol><li>해부된 표피를 고정 버퍼에 인큐베이션하여 로터상에서 실온(RT)에서 30분 동안 배양한다. 참고: 고정 버퍼는 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유하고 있다.</li>
	<li>고정 버퍼를 제거한 다음 빠른 세척을 수행합니다. 빠른 세척을 수행하려면, PFA의 제거 후 튜브에 RT에서 PBS의 1 mL을 추가, 부드럽게 조직을 다시 일시 중단, 그리고 PBS를 폐기. 주의 사항: 고정 버퍼에는 인간의 건강에 유해한 PFA가 포함되어 있습니다. 고정 버퍼를 유해 폐기물로 올바르게 폐기하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>PBS로 샘플을 3x 5분 동안 세척하여 가능한 모든 PFA 잔류물을 세척합니다.</li>
	<li>BODIPY 493/503 (1 μg/mL; 재료 표참조)로 표피를 회전자에서 RT에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 이 단계부터 미세 원심 분리튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 시료를 빛으로부터 보호하고 가능한 광 표백을 최소화합니다.</li>
	<li>BODIPY 493/503 염색 용액을 제거하고 샘플을 PBS로 각각 10분 동안 3x 세척하여 잔류 염료를 완전히 제거합니다.</li>
</ol>5. 장착 및 이미징
<ol><li>깨끗한 현미경 슬라이드에 장착 매체 6 μL을 놓습니다. 참고: 마운팅 매체는 안티페이드 특성에 따라 더 긴 검출 시간에 사용됩니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 표피 하나를 집어 들고 닦아 잔여 PBS를 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>표피를 마운팅 매체에 놓고 방향을 조정하여 에노시테를 포함하는 내부 표면이 바닥에 있고 외부 표면이 맨 위에 있도록 합니다.</li>
	<li>표지슬립을 표피에 부드럽게 놓습니다. 참고: 필요한 경우 덮개 슬립 아래에서 누출되는 여분의 장착 매체를 닦아냅니다. 이미징을 용이하게 하기 위해 포셉으로 커버슬립을 부드럽게 밀어 현미경을 통해 슬라이드를 관찰할 때, 에노시테 클러스터를 하나의 평면에서 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 양자택일로, 조직을 장착할 때 전체 표피의 압연을 피하기 위하여 중간 선을 통해서 2개의 반 표피로 표피를 잘라내는 것이 실행가능합니다.</li>
	<li>밀봉 커버 슬립의 가장자리 주위에 명확한 매니큐어를 적용합니다.</li>
	<li>슬라이드를 내광 성 샘플 상자에 넣고 매니큐어가 RT에서 건조되도록하여 5-10 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>현미경 분석을 진행합니다. 공초점 현미경(최적화된 GFP 또는 FITC 필터 설정으로 63배 배율, 여기 = 488nm, 방출 = 503nm)을 사용하여 이미지를 사용하여 극한의 배경을 사용하여 깨끗하고 민감한 신호를 수집합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

위에서 설명한 것 중에는 이 프로토콜에 몇 가지 중요한 단계가 있으며, 계란 누워 기간은 이들 중 하나입니다. 지질 동원 조직으로서, 에노세포는 영양 상태에 매우 민감하다6,8. 장기간 계란 누워 기간 까마귀 애벌레 와 증가 식품 경쟁 귀 착될 수 있습니다., 부정확 한 결과 선도. 이 프로토콜에 사용되는 1 시간 계란 누워 기간은 유충이 영양 경쟁없이 개발할 수 있습니다. 더 긴 계란 누워 기간에서 유래할 수 있는 애벌레의 훨씬 더 큰 수는 또한 지질 물방울 양 및 패턴 (예를 들면, 크기, 수 및 형태학)에 eenocytes에 영향을 미칠 수 있습니다.
추가적으로, 연장된 계란 누워 기간은 또한 발달 단계의 넓은 변이를 가진 애벌레 인구에서 유래합니다. 이 맥락에서, 연구원은 배아 또는 애벌레 발달에 영향을 미치는 돌연변이를 사용할 때 주의해야 한다, 지질 방울 패턴에 미...

지질은 세포 생존에 필수적입니다. 세포막 시스템의 필수 구성 요소로서의 전통적인 역할 외에도 지질은 또한 개별 동물의 수명 주기 전반에 걸쳐 에너지 공급 및 신호 변환에 중요한 기능을 합니다1. 따라서 지질 대사는 세포에서 생리적 지혈을 유지하기 위해 엄격한 규정을 준수해야합니다. 지질 대사의 조절은 당뇨병이나 지방간 과 같은 다양한 질병을 초래하는 것으로 알려져 있다. 동물 건강에 지질 대사의 큰 중요성에도 불구 하 고, 지질 물질 대사 규칙 기본 메커니즘 크게 알 수 없는 남아.
초파리는 토마스 H. 모건 교수가 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문을 포함하는 연구에서 그들을 사용하기 시작한 이후 년 동안 광범위하게 사용되어왔다2. 지난 수십 년 동안, 새로운 증거는 Drosophila가 비만1,3과같은 많은 지질 물질 대사 관련 질병의 연구에서 우수한 모델 유기체임을 보여주었습니다. 특히, Drosophila는 인간과 고도로 보존된 신진 대사 유전자를 공유하고 지질 물질 대사를 위한 유사한 관련 조직/기관 및 세포 모형을 소유합니다.
예를 들어, 트리 아 실 글리세라이드 저장에 대 한 책임은 Drosophila의지방 체, 인간의 지방 조직과 유사한 기능. 최근, 인간 간과 기능성 유사체로 보고된 전문 간세포형 세포(즉, 에노세포)의 클러스터는 과일 파리에서 지방산 및 탄화수소 대사에 관여하는 것으로 나타났다4,5. 포유류 간에서와 유사하게, oenocytes는 애벌레와 성인 Drosophila둘 다에 있는 지질 방울 대형을 활성화해서 기아에 반응합니다, oenocytes에 있는 지질 방울 축적의 결과로4,6,7,8. 해부학적으로, oenocytes는 복부 hemisegment 당 대략 6개의 세포의 클러스터에 있는 측방 표피의 기저 내부 표면에 단단히 붙어, 이는 표피에서 oenocyte 군집을 격리하는 것을 실행 불가능하게 합니다. 따라서, oenocytes는 해부 및 염색 도중 표피에 부착되어야 합니다.
지질은 세포9의단층 막을 가진 세포기관인 지질 방울의 형태로 저장됩니다. 지질 방울은 다른 종에 걸쳐 거의 모든 세포 유형에 존재10. 지질 방울 역학, 그것의 크기와 수를 포함 하 여, 환경 스트레스에 대 한 응답에서 변경. 이는 노화및기아와같은 스트레스에 반응하여 대사 상태를 반영한 것으로7,8. 따라서, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 oenocytes에서 지질 방울 역학을 질적으로 결정하는 실현 가능하고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 특히, 제3 인스타 유충에서, oenocytes는 공급 조건 하에서 검출 가능한 지질 방울을 거의 또는 전혀 함유하지 않지만, 영양 부족 후 수많은 큰 지질 방울을 함유한다4. 이 방법의 효과를 확인하기 위해, 굶주린 조건하에서 에노 세포에서 지질 방울 염색을 수행하는 것이 좋습니다.
현재, 몇몇 친유성 염료는 불형색 염료 수단 블랙 및 오일 레드 O 및 형광 염료 나일 레드 및 BODIPY 493/50311과같은 지질 방울 염색에 사용할 수 있다. 수단 블랙과 오일 레드 O는 일반적으로 조직 콜레스테릴 에스테르와 트리 아실 글리세롤에 사용되며 가벼운 현미경 검사법에 의해 쉽게 검출 될 수있다. 그러나, 상대적으로 높은 배경 염색 및 상대적으로 낮은 해상도는 지질 액적 역학의 질적 분석에서 그것의 응용에 대한 두 가지 제한 요인이다. 비형광 염료의 한계를 극복하기 위해 나일 레드와 BODIPY 493/503은 지질 방울 염색을 위한 이상적인 대체품으로 활용됩니다. 나일 레드는 또한 BODIPY 493/503 세포 지질 방울에 대 한 더 구체적인 염료를 만드는 일부 unesterified 콜레스테롤을 감지할 수 있다 보고되었습니다.,어느 정도12,13,14.
무엇보다도, 이 프로토콜은 oenocytes에 있는 지질 방울의 신속하고 민감한 분석에 대한 필요를 충족하기 위하여, 얼룩 염료로 BODIPY 493/503를 사용하여 고착성 지질 방울 특정 염색의 실현 가능하고 고도로 재현 가능한 방법을 제시합니다. 이 보고에서는, oenocytes는 해부되고, BODIPY 493/503는 공초점 현미경 검사법에 의해 지질 방울이 검출되는 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울 염색을 위해 이용됩니다. 이 절차의 용이성과 경제성은 유세포 측정과 같은 다른 응용 분야에서 수정 및 추가 사용에 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>6 cm 페트리 접시</td><td>Thermo Fisher</td><td>150326</td><td>6 cm</td></tr><tr><td>한천</td><td></td><td></td><td>플라이 식품용</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>해당 사항 없음</td> 해당 <td>없음</td> 빛<td>으로부터 메이플 보호</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td>지질 방울 염색 염료</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>라이카</td><td>Leica TSC SP5</td><td>컨포칼 이미징</td></tr><tr><td>옥수수 시럽</td><td></td><td></td><td>플라이 푸드</td></tr><tr><td>옥수수 가루</td><td></td><td></td><td>플라이 푸드 Coverslip</td></tr><tr><td></td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td>20 &times; 20 mm, 0.13-0.17 두께</td></tr><tr><td>해부 핀</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>해부 플레이트</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>N/A</td><td>N / A</td><td>직경 : 11cm</td></tr><tr><td>고정 버퍼</td><td>N /</td><td>A</td><td>4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 1x PBS</td></tr><tr><td>집게</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td> <td># 5</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Jiangnan</td><td>SPX-380</td><td>플라이 문화</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>용 Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 매체</td><td>VECTASHIELDAntifade 마운팅 매체</td><td>H-1000</td><td>안티페이드 마운팅 매체</td></tr><tr><td>매니큐어</td><td>PanEra</td><td>AAPR419</td><td>커버 슬립</td></tr><tr><td>페인트브러시</td><td>해당</td><td>없음 해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>해당 없음</td> 해당 <td>없음</td><td>1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)</td></tr> <tr><td>로테이터</td><td>Kylin-Bell Lab Instruments</td><td>WH-986</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Smartdata Medical</td><td>SR81</td><td>Vannas 봄 가위</td></tr><tr><td>콩 가루</td><td></td><td></td><td>플라이 식품</td></tr><tr><td>주걱</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>표준 옥수수 가루</td> 식품 <td>N / A</td> N <td>/ A</td><td>블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품 레시피에 따라</td></tr><tr><td>코딩 스테레오 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica S6E</td><td>조직 해부용</td></tr><tr><td>와이프 페이</td>퍼 <td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>효모</td><td></td><td></td><td>플라이 푸드용</td></tr><tr><td>yw</td><td>실험실 재고로 보관</td><td>N/A</td><td>초파리</td></tr></tbody></table>

초파리 유충에 있는 oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

지질은 동물 발달과 생리적 항상성에 필수적입니다. 지질 대사의 dysregulation는 각종 발달 결함 및 질병, 비만 및 지방 간 과 같은 귀착됩니다. 일반적으로 지질은 세포의 다기능 지질 저장 소기관인 지질 방울에 저장됩니다. 지질 방울 크기와 다른 조직에서 다른 조건에서 수 다양. 지질 방울은 그것의 생발생 및 저하의 규제를 통해 단단히 통제 되는 보고 되었습니다. Drosophila melanogaster에서,oenocyte는 지질 물질 대사를 위한 중요한 조직이고 최근 스트레스에 응하여 지질 동원에 관하여 인간 간 유사체로 확인되었습니다. 그러나, oenocytes에 있는 지질 물방울 물질 대사의 규칙의 밑에 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 개발 중 및 스트레스 조건 하에서 지질 방울 동적 변화를 직접 시각화하는 신뢰할 수 있고 민감한 방법을 개발하는 것이 가장 중요합니다. 여기에 설명된 지질 방울 특이적 형광 염료인 친유성 BODIPY 493/503을 활용하면 기아에 대한 반응으로 드로소필라 유충의 선혈구에서 해부 및 후속 지질 방울 염색에 대한 상세한 프로토콜이 설명되어 있다. 이것은 공초점 현미경 검사법에 의하여 각종 조건 의 밑에 지질 작은 물방울 역학의 질적인 분석을 허용합니다. 또한, 이 신속 하 고 높은 재현 가능한 방법은 또한 oenocytes 및 다른 조직에 지질 방울 대사를 포함 하는 새로운 유전 요인을 식별 하기 위한 유전 화면에서 사용할 수 있습니다.

이 절차의 성공적인 실행은 oenocytes에 있는 지질 작은 물방울의 수 그리고 크기를 드러내는 명확한 지질 작은 물방울 얼룩 귀착될 것입니다. 그림 1A,A',A''는 다른 발달 단계 동안 정상적인 먹이 유충의 oenocytes에 검출 가능한 지질 방울 (녹색 점)이 거의 없다는 것을 보여줍니다. 도 1B, B', B'는 12h(B), 24h(B'), 및 36시간(B') 기아 기간에 반응하여 에노세포에서 지질 방울(녹색 점)의 양을 증가시다. 96 시간 후, 먹이 애벌레 (A) oenocytes에 일부 지질 방울 축적을 표시 하는 것 같았다 주목 해야 한다, 그들의 빠른 성장 속도 때문일 수 있습니다. 연구원은이 단계 도중 애벌레를 취급할 때 증가한 주의를 지불해야 합니다.
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여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

이 방법은 노노세포 해부 및 지질 방울 얼룩염색의 이 방법은 정상 및 스트레스 조건 하에서 drosophila 애벌레 oenocyte에서 지질 방울의 외관을 실현하기 위하여 이용될 수 있다. 이 방법은 곤충뿐만 아니라 몇 가지 사소한 수정과 포유류에서 지질 대사를 연구하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 계란 누워를 유도하기 위해, 계란 누워 병에 원하는 유전자형의 150 처녀 여성 파리와 75 수컷을 배치하고 60 %의 습도와 25섭씨 25도 인큐베이터에 방광 상자 아래에 병을 배치합니다.1시간 후, 파리를 새 병으로 옮기고 파리가 새 병에 알을 낳은 후 성인을 제거하십시오. 그런 다음, 계란은 12 시간 밝은 어두운 주기와 섭씨 25도에서 84 시간 동안 세 번째 별 애벌레로 발전 할 수 있습니다. 기아 치료를 시작하기 전에 적당히 크기의 필터 용지를 6센티미터 페트리 접시에 넣고 PBS 1밀리리터를 종이에 추가하여 기아 챔버를 만듭니다.제어 처리 챔버를 만들기 위해, 6 센티미터 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품의 5 밀리리터를 배치합니다. 챔버가 준비되면 작은 페인트 브러시를 사용하여 달걀 누워 병에서 동일한 대략적인 크기의 별 애벌레를 수집합니다. 그리고 각 기아 및 대조실로 무작위로 20 애벌레.그런 다음 12, 24 또는 36 시간의 개발 및 / 또는 기아를 위해 인큐베이터에 챔버를 배치합니다. 치료 기간이 끝나면 집게를 사용하여 각 챔버에서 유충을 얼음 차가운 PBS가 들어있는 해부 판으로 부드럽게 옮기고 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓습니다. 첫 번째 애벌레 복부 면을 위로 향하게 하고 집게를 사용하여 애벌레를 제자리에 부드럽게 잡습니다.한 핀을 인두를 통해, 또 다른 핀을 첨탑을 통과하여 접시에 애벌레를 고정시하십시오. Vannas 스프링 가위를 사용하여 앞쪽에서 동물의 후면 끝까지 표피를 통해 세로 절개를 합니다. 표피의 내부 표면에 있는 장신구의 손상을 피하기 위해 주시하면서, 표피의 내부 조직을 제거하기 위해 집게를 사용합니다.그런 다음 집게를 사용하여 해부 핀을 검색하고 표피를 얼음에 PBS의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 지질 방울 염색의 경우 회전기의 실온에서 30분 동안 고정 버퍼에서 해부된 표피를 배양한 다음 PBS의 1밀리리터에서 빠른 재서스펜션을 수행합니다. 그런 다음 세척당 PBS 1밀리리터에 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척하여 잔류 고정을 제거합니다.마지막 세척 후, 회전기의 실온에서 30 분 동안 적절한 리포필 프로브로 표피 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션 하는 동안, 빛으로부터 조직을 보호하기 위해 호일에 샘플 튜브를 감싸고 세척 당 10 분 동안 PBS의 1 밀리리터에 샘플을 세 번 세척합니다. 이노클을 이미지하기 위해 각 표피 샘플을 깨끗한 현미경 슬라이드에 장착 매체의 6 마이크로 리터로 옮기고 조직의 방향을 조정하여 노이노사이클을 함유한 내부 표면이 슬라이드의 바닥에 닿도록 한다.뚜껑을 표피에 부드럽게 놓고 맑은 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 폴란드어가 건조되면, 공초점 현미경에 샘플을 이미지, 적절한 여기와 방출 파장을 가진 63 X 배율을 넣어. 다른 발달 단계에서 정상적인 먹이 애벌레의 이노사이클 안에 는 몇 가지 검출 가능한 지질 방울이 있습니다.그러나 이러한 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, 지질 방울은 12, 24 및 36시간 기아 기간에 대한 응답으로 이뇨제 내의 수가 증가합니다. 이 방법은 관련 연구 분야의 연구원들이 유전적 또는 환경 조작으로 인해 세포에 지질 방울 변화를 유발하는지 여부를 조사할 수 있는 실현 가능한 프로토콜을 제공하고 쉽고 쉽게 제공합니다.

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JoVE Journal

Biology

생물학

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초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

배우세요 Drosophila 유충의 oenocyte 해부와 BODIPY 493/503을 이용한 지질 물방울 염색법. 이 방법은 정상 및 스트레스 조건에서 지질 대사를 연구하고 유전적·환경적 영향을 조사하는 데 활용됩니다.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

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