초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색
2019년 12월 28일
여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.
이 방법은 노노세포 해부 및 지질 방울 얼룩염색의 이 방법은 정상 및 스트레스 조건 하에서 drosophila 애벌레 oenocyte에서 지질 방울의 외관을 실현하기 위하여 이용될 수 있다. 이 방법은 곤충뿐만 아니라 몇 가지 사소한 수정과 포유류에서 지질 대사를 연구하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 계란 누워를 유도하기 위해, 계란 누워 병에 원하는 유전자형의 150 처녀 여성 파리와 75 수컷을 배치하고 60 %의 습도와 25섭씨 25도 인큐베이터에 방광 상자 아래에 병을 배치합니다.
1시간 후, 파리를 새 병으로 옮기고 파리가 새 병에 알을 낳은 후 성인을 제거하십시오. 그런 다음, 계란은 12 시간 밝은 어두운 주기와 섭씨 25도에서 84 시간 동안 세 번째 별 애벌레로 발전 할 수 있습니다. 기아 치료를 시작하기 전에 적당히 크기의 필터 용지를 6센티미터 페트리 접시에 넣고 PBS 1밀리리터를 종이에 추가하여 기아 챔버를 만듭니다.
제어 처리 챔버를 만들기 위해, 6 센티미터 페트리 접시에 블루밍턴 표준 옥수수 가루 식품의 5 밀리리터를 배치합니다. 챔버가 준비되면 작은 페인트 브러시를 사용하여 달걀 누워 병에서 동일한 대략적인 크기의 별 애벌레를 수집합니다. 그리고 각 기아 및 대조실로 무작위로 20 애벌레.
그런 다음 12, 24 또는 36 시간의 개발 및 / 또는 기아를 위해 인큐베이터에 챔버를 배치합니다. 치료 기간이 끝나면 집게를 사용하여 각 챔버에서 유충을 얼음 차가운 PBS가 들어있는 해부 판으로 부드럽게 옮기고 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓습니다. 첫 번째 애벌레 복부 면을 위로 향하게 하고 집게를 사용하여 애벌레를 제자리에 부드럽게 잡습니다.
한 핀을 인두를 통해, 또 다른 핀을 첨탑을 통과하여 접시에 애벌레를 고정시하십시오. Vannas 스프링 가위를 사용하여 앞쪽에서 동물의 후면 끝까지 표피를 통해 세로 절개를 합니다. 표피의 내부 표면에 있는 장신구의 손상을 피하기 위해 주시하면서, 표피의 내부 조직을 제거하기 위해 집게를 사용합니다.
그런 다음 집게를 사용하여 해부 핀을 검색하고 표피를 얼음에 PBS의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 전송합니다. 지질 방울 염색의 경우 회전기의 실온에서 30분 동안 고정 버퍼에서 해부된 표피를 배양한 다음 PBS의 1밀리리터에서 빠른 재서스펜션을 수행합니다. 그런 다음 세척당 PBS 1밀리리터에 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척하여 잔류 고정을 제거합니다.
마지막 세척 후, 회전기의 실온에서 30 분 동안 적절한 리포필 프로브로 표피 샘플을 배양하십시오. 인큐베이션 하는 동안, 빛으로부터 조직을 보호하기 위해 호일에 샘플 튜브를 감싸고 세척 당 10 분 동안 PBS의 1 밀리리터에 샘플을 세 번 세척합니다. 이노클을 이미지하기 위해 각 표피 샘플을 깨끗한 현미경 슬라이드에 장착 매체의 6 마이크로 리터로 옮기고 조직의 방향을 조정하여 노이노사이클을 함유한 내부 표면이 슬라이드의 바닥에 닿도록 한다.
뚜껑을 표피에 부드럽게 놓고 맑은 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 폴란드어가 건조되면, 공초점 현미경에 샘플을 이미지, 적절한 여기와 방출 파장을 가진 63 X 배율을 넣어. 다른 발달 단계에서 정상적인 먹이 애벌레의 이노사이클 안에 는 몇 가지 검출 가능한 지질 방울이 있습니다.
그러나 이러한 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, 지질 방울은 12, 24 및 36시간 기아 기간에 대한 응답으로 이뇨제 내의 수가 증가합니다. 이 방법은 관련 연구 분야의 연구원들이 유전적 또는 환경 조작으로 인해 세포에 지질 방울 변화를 유발하는지 여부를 조사할 수 있는 실현 가능한 프로토콜을 제공하고 쉽고 쉽게 제공합니다.
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개요
이 연구는 BODIPY 493/503 형광 염료를 사용하여 초파리 유충의 오에노사이트를 해부하고 지질 방울을 염색하는 방법을 제시합니다. 정상 및 스트레스 조건 하에서 지질 방울의 행동을 조사하여 곤충과 포유류의 지질 대사에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 영역
- 세포 생물학
- 지질 대사
- 곤충 생리학
배경
- 오에노사이트는 지질 저장 및 대사에 중요한 역할을 합니다.
- 지질 방울 역학을 이해하는 것은 대사 질환에 대한 통찰력을 얻는 데 중요합니다.
- 초파리는 유전자 연구를 위한 강력한 모델 유기체로 사용됩니다.
사용된 방법
- 초파리 유충에서 오에노사이트 해부
- 지질 방울 염색을 위한 BODIPY 493/503 사용
- 영상화를 위한 공초점 현미경
주요 결과
- 오에노사이트에서 지질 방울의 시각화를 입증했습니다.
- 기아 반응으로 지질 방울 수가 증가함을 보여주었습니다.
- 다양한 맥락에서 지질 대사를 연구하기 위한 실행 가능한 프로토콜을 제공했습니다.
결론
- 이 방법을 통해 연구자들은 지질 대사에 대한 유전적 및 환경적 영향을 조사할 수 있습니다.
- 이는 지질 생물학의 더 넓은 생물학적 이해 및 연구 방법론에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of lipid droplet dynamics in a genetically tractable model, supporting target validation in lipid metabolism pathways. It provides a reproducible assay system for mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses related to hepatic lipid handling and metabolic stress responses. The approach supports early discovery workflows by linking genetic or environmental perturbations to quantifiable phenotypic outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid storage mechanisms in oenocytes, a functional analogue of human liver for lipid mobilization.
- Operational Value: Provides a sensitive readout for assessing genetic or pharmacological modulation of lipid droplet biogenesis and degradation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts suitable for high-content screening of lipid-modulating compounds.
- Operational Value: Offers a rapid, reproducible protocol for preparing standardized tissue samples across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports phenotypic screening in a conserved metabolic tissue to identify regulators of lipid homeostasis with potential mammalian relevance.
- Operational Value: Facilitates cross-species extrapolation by enabling conserved pathway analysis in Drosophila and mammalian systems with minimal adaptation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing a phenotypic anchor for lipid metabolism targets, enabling hit validation and pathway de-risking before compound advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of lipid regulatory genes through direct visualization of subcellular lipid storage dynamics.
- Screening: Delivers standardized, quantitative imaging outputs for assay reproducibility and compound effect comparison.
- Analytics: Enables measurement of lipid droplet number and size changes as functional readouts for pathway activity.
- Translational Research: Connects oenocyte lipid responses to hepatic lipid metabolism, supporting biomarker-aligned target selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for lipid droplet analysis across multiple genetic backgrounds and stress conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in lipid metabolic phenotypes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility in lipid droplet assessment across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by providing early mechanistic insights into lipid pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic concordance with disease-relevant lipid dysregulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, dissection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on access to confocal microscopy and appropriate light-protected imaging conditions.
- Necessitates standardized starvation and control chamber preparation for comparative analysis.
- Involves optimization of BODIPY 493/503 concentration and incubation times for specific genetic backgrounds.
- Limited to qualitative and semi-quantitative assessment without automated image analysis pipelines.
