Name: 써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 Thermotoga maritima 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝 방법을. 몰리브덴 블루 반응을 활용한 이 프로토콜은 비용 효율적이고 안정적인 색소 생성을 제공하여 기생충 질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

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이 작품은 제인과 아토스 에르코 재단과 BBSRC (BB / M021610)의 보조금에 의해 지원되었다, 핀란드 아카데미(308105번)에서 케니 비디라리스(310297번)에서 헨리 샤드까지, (265481번) 사리 일리-카우할루마, 헬싱키 대학 연구 기금에서 구스타프 보이예 af Gennäs. 저자는 프로젝트 기간 동안 그녀의 기술적 인 도움에 대한 버나데트 겔에게 감사드립니다.

1. 단백질 준비
참고: TmPPase의 발현 및 정제는 다른곳에서 13에기술되었습니다.
<ol><li>20 mM-(N-morpholino)에탄에설포닉산(MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) 글리세롤, 2 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.05% 도데실 말토사이드(DDM)를 함유하는 재활성화 완충액의 10 mL을 준비한다.</li>
	<li>200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl 및 67 mM NaCl을 포함하는 반응 혼합물의 10 mL을 준비한다. 참고: Mg2+는 mPPase의 기질로서 파이로포스페이트에 chelate하는 데 필요하며,K+는 TmPPase가 칼륨 의존성 mPPase로서 효소 활성을 증가시키는 데 필요하며,Na+는 TmPPase에 의한 나트륨 이온 전좌 동안효소 활성에 필요하다.</li>
	<li>효소 재활성화를 위해 30 mg/mL 리포솜을 준비하십시오.<ol>
<li>10 mL의 20 mM 트리스-HCl pH 8.0을 1 mMDTT와 1 mM DTT를 추가하여 1mMM DTT를 사용하여 20 mM Tris-HCl pH 8.0의 10 mL에 대두에서 L-α-phosphatidylcholine0.3 g에 1mMDTT를 추가합니다.</li>
		<li>리포솜을 얼음 위에 올려 놓고 1초 동안 1초의 펄스 간격으로 초음파 처리한 다음 1분 동안 일시 중지한 다음 용액이 투명하게 노랗게 될 때까지 반복합니다.</li>
		<li>리포좀을 알리쿼트하고 액체 질소로 얼리고 사용 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>효소를 다시 활성화합니다.<ol>
<li>리포솜 용액 40 μL을 20% DDM의 22.5 μL과 혼합합니다.</li>
		<li>혼합물을 55 °C에서 15 분 동안 가열하고 실온으로 식힙니다.</li>
		<li>재활성화 완충액 36.5 μL을 넣고 혼합하고 농축 단백질 1 μL(13 mg/mL)을 추가하여 총 농도가 0.13 mg/mL입니다. 참고: 단백질은 일반적으로 정제 후 10 μL aliquots로 동결되고 사용하기 전에 얼음에 해동됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>재활성화된 효소의 20 μL을 취하고 반응 혼합물의 1,480 μL에 추가한 다음 부드럽게 섞습니다. 참고 : 반응 혼합물에 재 활성화 된 효소를 첨가하면 사용 직전에 수행해야합니다.</li>
</ol>2. 화합물 준비
<ol><li>디메틸 설폭사이드(DMSO)에 화합물을 용해하여 화합물의 가용성에 따라 50-200 μL에서 25-100 mM의 재고 용액을 만듭니다. 참고: 여기에 사용된 모든화합물(그림 2A)은이전에9. 화합물 용해도가 낮은 경우, 재고 농도는 그에 따라 조정될 수 있다.</li>
	<li>물에 각 화합물의 세 가지 다른 농도를 준비합니다. 참고: 반응 혼합물의 최종 농도는 각각 1, 5 및 50 마이크로몰 또는 1, 5 및 20 마이크로몰로 수용성 및 아껴서 수용성 화합물에 대한 것입니다.<ol>
<li>용해성 화합물에 대해 2 μM, 10 μM 및 100 μM을 제공하기 위해 마이크로튜브에서 물로 1 mL로 스톡 용액을 희석하거나, 아껴서 수용성 화합물에 대해 2 μM, 10 μM 및 40 μM을 제공합니다.</li>
		<li>적절한 혼합을 위해 스톡 용액의 희석 후 즉시 화합물 용액을 소용돌이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>nephelometer를 사용하여 복합 집계를 확인합니다. 참고: 이것은 3개의 농도(1 μM, 5 μM 및 20 μM)에서 삼중체로서 연구되었고, 96웰 플레이트에서 블랭크로 정규화하였다.<ol>
<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰내로 반응 혼합물의 75 μL을 분배한다.</li>
		<li>각 화합물의 75 μL을 추가하고 (빈 경우 75 μL의 물을 대신 사용하십시오) 위아래로 5 ×로 섞습니다.</li>
		<li>마이크로 플레이트 nephelometer를 사용하여 300V에서 각 잘 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분석 준비를위한 시약
<ol><li>비소성 구연산염 용액을 준비합니다.<ol>
<li>비소나트륨 5 g과 구연산 나트륨 디하이드레이트 5 g의 무게를 측정하십시오. 주의: 비소 나트륨은 독성이 있으므로 적절한 보호 장비를 사용하고 특별한주의를 기울여 처리하십시오. 예방 조치로서 필요한 모든 안전 예방 조치를 읽고 이해하기 전에 는 처리하지 마십시오. 화합물 또는 용액의 먼지 /증기를 흡입하지 않도록 연기 후드에서만 취급하십시오. 흡입하면 신선한 공기로 이동하여 의사의 진료를 받으하십시오. 섭취와 눈/피부 접촉을 피하기 위해 적절한 화학 안전 고글, 보호 장갑 및 의류를 착용하십시오. 삼켰을 경우 즉시 독극물 센터 나 의사 / 의사에게 전화하십시오. 피부나 눈에 닿으면 충분한 물로 씻고 의사의 진료를 받으라.</li>
		<li>100 mL의 물에 녹입니다.</li>
		<li>5 mL의 빙하 아세트산을 넣고 섞은 다음 물을 250 mL에 추가합니다.</li>
		<li>빛으로부터 보호된 실온에서 보관하십시오. 참고 : 솔루션은 1 년 이상 안정적입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔루션 A 및 솔루션 B를 준비합니다.<ol>
<li>용액 A의 경우, 얼음 차가운 0.5 M HCl 10 mL을 아스코르브 산 0.3 g에 추가하십시오. 소용돌이에 의해 아스코르브 산을 용해.</li>
		<li>용액 B의 경우, 녹을 수 있는 테트라하이드레이트와 소용돌이를 70 mg의 암모늄 헵타몰리브데이트에 얼음 차가운 물 1 mL을 추가합니다. 참고: 두 가지 용액을 모두 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 분석 결과의 일관성을 위해 두 용액을 최대 1 주일 동안 얼음에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>캘리브레이션을 위해 0 μM, 62.5 μM, 250 μM 및 500 μM의 농도로 인산염(Pi)표준을 준비합니다.<ol>
<li>반응 혼합물의 370 μL을 함유하는 4개의 마이크로튜브에 5 mMNa 2HPO 4 의 0 μL, 25 μL, 및 100μL을 첨가한다.</li>
		<li>최대 1mL의 물로 물을 마시면 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 96 웰 플레이트 1개에 대한 활동 분석
참고: 분석의 회로도 워크플로우에 대해서는 그림 1을 참조하십시오.
<ol><li>용액 B 10 mL에 1 mL를 추가하고, 소용돌이에 섞어서 용액을 얼음에 저장하십시오. 참고: 이 솔루션은 투명하고 노란색이어야 합니다. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 얼음에 용액 A + B를 유지 합니다. 그러나 장기 보관 후 불량이 될 수 있으므로 3 시간 이내에 솔루션을 사용하십시오.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립에 40 μM, 62.5 μM, 250 μM 및 500 μM Pi 표준을 추가합니다. 참고 :P가 첨가되지 않은 반응 혼합물은 공백으로 사용됩니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립에 25 μL의 화합물 용액을 추가합니다. 참고: 각 화합물은 반 최대 억제 농도 (IC50)의초기 추정에 충분 한 삼중 항에 세 가지 다른 농도. 보다 정확한 IC50 측정을 위해 8가지 화합물 농도를 사용할 수 있습니다. 억제되지 않은 효소의 경우 화합물 용액은 동일한 양의 물로 대체됩니다. 양성 대조군으로서 2.5 μM, 25 μM, 및 250 μM의 이미다이드포스페이트(IDP) 나트륨 염을 사용하였다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립(Pi 표준을 포함하는 튜브 제외)에 15 μL의 mPPase 용액 혼합물을 추가합니다.</li>
	<li>튜브 스트립을 접착제 밀봉 시트로 밀봉합니다. 각 튜브 스트립을 분리하기 위해 밀봉 시트를 잘라.</li>
	<li>71°C에서 5분 동안 샘플을 미리 배양하였다. 후속 단계 동안 소비 시간을 최소화하기 위해 각 스트립 사이에 20 s 간격으로 가열 블록에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>각 스트립에 대해 접착제 밀봉을 엽니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 2 mM 나트륨 파이로포스페이트 디베이직 10 μL을 추가하고 위아래로 5×로 파이펫팅하여 섞습니다. 동일한 밀봉을 사용하여 튜브 스트립을 다시 밀봉하십시오. 참고: 이 단계는 처음에는 20초 안에 수행하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 그것은 몇 가지 asays 후 쉽게 될 것입니다.</li>
	<li>71°C에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>각 스트립 사이에 20s 간격으로 냉각 장치에 샘플을 놓습니다. 10 분 동안 식히지만 냉각 5 분 후에 각 스트립을 잠시 원심 분리하여 밀봉 시트 아래에 물을 떨어 뜨린 다음 냉각 장치에 다시 넣고 밀봉을 제거하십시오. 참고 : 냉각 장치는 단순히 적어도 1 시간 동안 물로 채워진 폴리스티렌 페트리 접시 (크기 150mm × 15mm)에 96 웰 PCR 플레이트를 배치하여 만들 수 있습니다. 장치는 분석의 시작 전에 약 5 분 냉동고에서 꺼내야한다. 반응 혼합물을 동결시키고 색상 개발을 방해하기 때문에 시료 냉각 직전에 냉각 장치를 꺼내지 마십시오.</li>
	<li>10분 동안 냉각한 후 용액 A + B 60 μL을 추가하고, 5×로 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 튜브 스트립을 냉각 장치에 10분 동안 유지합니다.</li>
	<li>비소산 구연산액 90 μL을 첨가하고 실온에서 30분 이상 유지하여 안정적인 청색을 생성합니다. 주의: 독성으로 인해 비소 나트륨을 함유 한 모든 솔루션은 항상 각별한주의를 기울여 처리해야합니다. 따라서, 비소성 구연산액의 첨가는 연기 후드에서 이루어져야한다.</li>
	<li>각 반응 혼합물의 180 μL을 투명한 96 웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에 분배한다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 분광광도계를 사용하여 860 nm에서 각 우물의 흡광도를 측정합니다.</li>
</ol>5. 결과 분석
<ol><li>각 샘플및Pi 표준의 평균 세 배입니다. 그런 다음 빈 으로 빼서 배경 신호를 제거합니다.</li>
	<li>Pi 표준(nmol)의 양에 대해 흡광도(A860)값을 플로팅하여 보정 곡선을 만들고 선형 회귀를 수행하여 다음 공식을 사용하여 추세선 함수를 얻습니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>상기 선형 회귀 식에 기초하여 효소 반응으로부터 방출된 인산염 양(nmol)을 계산한다.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 특정 활동을 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> 여기서 nPi는 반응(nmol)으로부터 방출되는 인산염의 양이고, t는 반응 시간(min), 및 mTmPPase는 분석(mg)에 사용되는 순수한 TmPPase의 양이다.</li>
	<li>다음 공식을 사용하여 각 억제제 농도에 대한 백분율 활성을 계산합니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> 여기서 SAi는억제제 및 SAun을 가진 샘플의 특정 활성은 억제되지 않은 샘플의 특정 활성이다.</li>
	<li>다음 공식을 사용하여 4개의 파라미터 용량-응답 곡선에서 비선형 회귀 적합으로 logIC50(추정) 및 IC 50(추정값)을 계산합니다. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> 여기서 X는 농도로그(μM), Y는 활동(%) 이고, 상부와 하부는 Y(각각 100% 및 0%)와 동일한 단위의 고원이며, logIC50은 X와 동일한 로그 단위를 가지며, HillSlope = 경사계수 또는 언덕 경사도는 단위가 없는 것입니다. 참고 : 소프트웨어(재료 표)는피팅에 사용됩니다. 0의 로그렘이 정의되지 않았기 때문에 억제제없이 샘플에 대해 0.01 μM (대신 0.00 μM)의 농도를 사용하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
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<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서 우리는 Vidilaseris 등14에근거를 둔 96 개의 웰 플레이트 포맷에서 T. maritima에서 막 결합 된 열성 포에 대한 억제제의 간단한 스크리닝을위한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 산성 조건하에서 정형 외과 및 몰리브데이트에서 형성되고 뚜렷한 청색12를가진 인산염 종으로 감소되는 12-포스포모모리브딕 산을 기반으로 합니다. 이 방법은 보다 민감한 말라카이트 녹색분석법(16)과같은 다른 프로토콜보다 선호되며, 이 방법은 TmPPase재활성화에필요한 높은 인지질 농도의 존재에 간섭을 나타내지 않기 때문이다.
스크리닝 프로토콜의 워크플로우는 그림 1에 도시되어 있으며 이 프로세스는 1시간 안에 완전히 완료...

총 세포 단백질의 약 25%는 막 단백질이고 그 중 약 60%는 약물 표적1,2입니다. 잠재적인 약물 표적 중 하나인3,막 결합 된 열광파타스 (mPPases)는 양성자 및 / 또는 나트륨 이온을 두 개의 정형 외과 인산염으로 열분해하여 막을 가로 질러 펌핑하는효소입니다 4. mPPases는 인간과동물을제외하고 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충과 같은 다양한 유기체5에서 발견될 수 있습니다 4. 프로티스트 기생충에서, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마 브루시,mPPases는 기생충 에서 이러한 발현의 결손증6 및 녹아웃에 필수적이며 외부 기본pH7에노출시 세포내 pH를 유지하는 데 실패로 이어진다. 척추동물에 존재하는 상동 단백질의 중요성과 부족으로 인해 mPPases는 프로티스탈 질환에 대한 잠재적 인 약물 표적으로 간주 될 수 있습니다3.
이 작품에서 mPPase 억제제의 시험관 내 스크리닝은 TmPPase 모델 시스템을 기반으로 합니다. TmPPase는 T. 마리티마에서 나트륨 이온 펌핑 및 칼륨 이온 의존 mPPase이며 71 °C8에서최적의 활성을 갖는다. 이 효소의 장점은 예를 들어 생산 및 정제의 용이성, 좋은 열 안정성 및 높은 특정 활성입니다. TmPPase는 프로티스트 mPPases3,9 및 비냐 라디에타10 mPPase의 해결 된 구조에 대한 모든 촉매 잔류물의 완전한 보존뿐만 아니라 위치의 완전한 보존뿐만 아니라 높은 유사성을 나타낸다. 다른 적합성에서 TmPPase의 사용 가능한 구조는 구조 기반 약물 설계 실험 (가상 스크리닝 및 de novo 설계)에도 유용합니다.
여기서 우리는 96 웰 플레이트 포맷으로 TmPPase 억제제의 스크리닝을 위한 상세한 프로토콜을 보고한다(도1). 이 프로토콜은 먼저 Fiske 및 Subbarow11에의해 개발된 몰리브덴 청색 반응의 대색 방법을 기반으로 합니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 정형 외과 스포산염및 몰리브데이트에서 12-인산성 산의 형성을 수반하며, 이는 특징적인 청색 인화질 종12종을주기 위해 감소된다.

<table><tbody><tr><td>접착 밀봉 시트</td>: <td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr>, <tr><td>암모늄 헵타몰리브덴데이트 테트라하이드레이트</td>, <td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr>, <tr><td>아스코르브산</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>, BioLite, 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8-well PCR 튜브 스트립 0.2ml, 캡 없음 (120)</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr>, <tr><td>Dodecyl maltoside (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr>, <tr><td>에탄올</td>, <td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>이미도디포스페이트 나트륨 소금</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-Phosphatidyl choline from soybean lecithin</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR plates</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Type 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 페트리 접시 (크기 150mm x 15mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 소프트웨어</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 가열 블록</td><td>그랜트 기기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 메타 비소</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 (Pi)</td> <td>시그마</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>피로 인산 나트륨 이염 기성</td><td>플루카</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>구연산 삼 나트륨 이수화물</td><td>플루카</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

막 결합 된 열광파타제 (mPPases)는 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충에서 발생하는 디메라 효소입니다. 이 단백질은 양성자 및 /또는 나트륨 이온이 막을 가로 질러 펌핑과 결합된 두 개의 정형 외과 인산염 분자로 파이로 포스페이트를 갈라. 동물과 인간에서 상동성 단백질이 발생하지 않았기 때문에 mPPases는 잠재적인 약물 표적의 설계에 좋은 후보입니다. 여기서 우리는 96 웰 플레이트 시스템에서 몰리브덴 청색 반응을 활용하는 mPPase 억제제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 모델 효소로 열성 박테리아 써모토가 마리티마 (TmPPase)에서 mPPase를 사용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하여 일관되고 강력한 결과를 생성합니다. 분석의 시작부터 흡광도 측정까지 활성 분석 프로토콜을 완료하는 데 약 1시간 밖에 걸리지 않습니다. 이 분석에서 생성된 청색은 오랜 기간 동안 안정되기 때문에, 후속 분석은 이전 배치 직후에 수행될 수 있으며, 흡광도는 나중에 모든 배치에 대해 한 번에 측정될 수 있다. 이 프로토콜의 단점은 수동으로 수행되므로 파이펫팅 및 시간 유지의 좋은 기술을 필요로 할뿐만 아니라 소진 될 수 있다는 것입니다. 또한,이 분석법에 사용되는 비소 - 구연산염 용액은 독성이 있으며 필요한 예방 조치로 처리되어야하는 나트륨 비소염을 포함합니다.

본 프로토콜에서, 8개의 화합물(1−8)을 양성 대조군으로서 열포염의 일반적인 억제제인 IDP와 함께 시험하였다(도2A). 각 화합물은 삼중항에서 3개의 상이한 농도(1 μM, 5 μM 및 20 μM)에서 시험하였다. 스크리닝의 워크플로우는 샘플 및 시약 준비부터 860 nm의 흡광도 측정까지 의 도 1에도시되어 있습니다.
이 프로토콜의 끝에서, 용액 A + B 및 비소성 구연산염의 첨가 후, 용액은 관찰 될 수있는 몰리브데이트와 인산이온의 복잡한 형성으로 인해 709 nm 및 860 nm14에서 최대 흡수와 안정적인 푸른 색을 개발하고 효소 반응의 발생을 보여줍니다. 본 실험을 위해, 우리는 709 nm15에서흡광도에 비해 검출 한계 및 감도가 더 우수하기 때문에 방출된 Pi</...

여기에서 우리는 96 웰 플레이트 포맷에서 몰리브덴 청색 반응에 기초한 막 결합 된 열광파타제 (Thermotoga maritima에서)억제제에 대한 스크리닝 방법을 제시한다.

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

우리의 프로토콜은 막 바운드 파이로포스파타제의 탈활성을 억제하는 화합물을 찾는 도구로 작동합니다. 그리고 이 억제제는 몇몇 기생질병의 처리에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 효소 재활성화에 필요한 높은 인지질 농도의 존재시 간섭을 나타내지 않고 오랫동안 안정적이고 안정적인 색상을 생산하는 저렴하고 간단합니다.PH 6.5에서 20 밀리머 M-E-S, 볼륨 글리세롤3.5% 부피, 밀리몰러 D-T-T, 0.05%D-M을 함유한 재활성화 버퍼 용액 10밀리리터를 준비한다. PH 8에서 200 밀리머 트리스 염산염을 함유한 반응 믹서 10밀리리터를 준비한다. 염화 마그네슘 8개, 염화칼륨 333개, 염화나트륨 67개.효소 재활성화를 위해 밀리리터 리포솜당 30밀리그램을 준비하십시오. 먼저, PH 8에 20 밀리리터의 10 밀리리터를 추가하고, 1밀리머 D-T-T에서 0.3 그램의 L 알파 포스파디델콜린을 두콩에서 넣습니다. 리포솜을 얼음 위에 놓고 1초 의 간격으로 1초 동안 초음파 처리합니다.1분 동안 일시 중지하고 솔루션이 투명하게 노란색이 될 때까지 반복합니다. 100 마이크로리터의 리포솜을 알리코트하고 액체 질소를 동결하고 사용할 때까지 음의 섭씨 80도에 저장합니다. 효소를 다시 활성화하려면 실온에서 리포솜 용액을 해동하십시오.리포솜 용액 40마이크로리터를 20%의 D-D-M 22.5 마이크로리터와 혼합합니다. 혼합물을 섭씨 55도에서 15분간 유지합니다. 그리고 실온으로 식힙니다.그런 다음 재활성화 버퍼 용액의 36.5 마이크로리터를 추가합니다. 혼합. 그리고 밀리리터 당 0.13 밀리그램의 총 농도를 만들기 위해 농축 된 단백질의 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로, 재활성화 효소의 마이크로리터 20을 반응 혼합물의 1480 마이크로리터로 이송한다.부드럽게 섞어서 즉시 사용하십시오. 첫째, D-M-S-O의 화합물을 용해하여 200 마이크로리터에서 50 밀리몰러의 스톡 솔루션을 만듭니다. 수용성 화합물의 경우 마이크로 튜브에서 1 밀리리터로 물로 스톡 용액을 희석하여 2, 10 및 100 마이크로몰러를 제공합니다.각 희석에 대해 적절한 혼합을 위한 화합물 용액을 소용돌이시다. 그 후, 복합 발산을 확인하고, 멀티채널 파이펫을 사용하여, 반응 혼합물의 75 마이크로리터를 96웰 플레이트에서 각각 의 음으로 분배한다. 각 화합물과 물의 75마이크로리터를 삼중판에 제어할 수 있는 것으로 추가하고, 5회 위아래로 파이프를 섞어 섞는다.마이크로 플레이트 nephelometer를 사용하여 300 볼트에서 각 우물을 측정합니다. 현체 구연산 용액을 준비하려면, 5그램의 나트륨 아르세라이트와 5그램의 구연산 나트륨을 분화하여 두 화합물을 100밀리리터의 물로 녹입니다. 그런 다음 빙하 아세트산 5 밀리리터를 추가합니다.혼합하고 250 밀리리터에 물을 넣고 빛으로부터 보호받는 실온에서 보관하십시오. 다음으로, 10 밀리리터의 얼음 냉기를 첨가하여 A를 준비하여 0.3 그램의 아스코르브 산에 아스코르브 산이 소용돌이에 의해 아스코르브 산을 녹입니다. 1밀리리터의 얼음 냉수를 70밀리그램에 첨가하여 용액 B를 준비하여 용해해질인 테트라티오몰리브테 테트라하이드라트, 소용돌이를 녹입니다.얼음에 솔루션 A와 B를 저장합니다. 보정을 위해 0, 62.5, 250 및 500 마이크로몰러의 농도로 인산염 표준을 준비한다. 반응 혼합물의 370 마이크로리터를 포함하는 4개의 마이크로 튜브에 마이크로리터 제로, 12.5 마이크로리터, 50 마이크로리터, 5 밀리머 디소이소 인산염 의 100 마이크로리터를 첨가한다.최대 1밀리리터를 물로 얹습니다. 이제 솔루션 A의 10 밀리리터에 1 밀리리터의 솔루션 B를 넣고 손으로 섞고 용액을 얼음에 저장합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 트리플리케이트의 튜브 스크립트에 0, 62.5, 250 및 500 마이크로몰러 인산염 표준40마이크로리터를 추가합니다.그런 다음 화합물 용액 25 마이크로리터와 각 튜브의 M-P-P-A 용액 혼합물 15 마이크로리터를 추가합니다. 인산염 표준을 포함하는 튜브를 제외하고. 접착제 밀봉 시트로 튜브 스트립을 밀봉합니다.각 튜브 스트립을 분리하기 위해 밀봉 시트를 잘라냅니다. 다음으로, 섭씨 71도에서 5분간 샘플을 미리 배양합니다. 각 스트립 사이에 20초 간격으로 샘플을 가열 블록에 놓습니다.각 스트립에 대해 접착제 밀봉을 엽니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 2개의 어금니 나트륨 파이로포스페이트 디베이직100마이크로리터를 추가합니다. 그리고 5 번 위아래로 파이펫으로 섞는다.동일한 밀봉을 사용하여 튜브 스트립을 다시 밀봉합니다. 5 분 동안 섭씨 71도에서 다시 배양하십시오. 그 후, 각 스트립 사이에 20 초 간격으로 냉각 장치에 샘플을 배치합니다.5분 동안 식힌 다음 각 스트립을 원심분리하여 밀봉 시트 아래에 물 방울을 떨어뜨리십시오. 스트립을 냉각 장치에 다시 넣고 밀봉을 제거하고 5 분 동안 식힙니다. 그런 다음 60 마이크로리터의 용액 A와 B를 추가하고, 5회 위아래로 파이프팅하여 혼합하고, 냉각 장치에 튜브 스트립을 10분 이상 유지한다.연기 후드에, 비염석 구연산용액의 90 마이크로리터를 추가하고 적어도 30 분 동안 실온에서 유지합니다. 안정적인 청색을 연출합니다. 명확한 96 웰 폴리스티렌 마이크로 플레이트에 각 반응 혼합물의 180 마이크로 리터를 분배.마이크로 플레이트 분광광계를 사용하여 860 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 이 프로토콜에서, 8개의 화합물은 I-D-P와 함께 시험되었다, 양성 대조군으로 파이로 포스파타제의 일반적인 억제제. 용액 A와 B, 그리고 구연산염을 첨가한 후, 실온에서 30분 만에 청색을 한다.비 억제 화합물의 세 가지 농도 모두 동일한 파란색 강도를 표시했다. 뿐만 아니라 E-1에 E-3 어떤 억제제 없이. 각 시험된 화합물의 농도에 대한 효소 활성의 플롯은 억제 활성을 가진 화합물이 비선형 곡선 피팅을 형성했다는 것을 보여준다.긍정적 인 제어로 I-D-P의 플롯은 분명히 더 높은 농도에서 활동의 감소를 보여줍니다. 화합물에 대한 억제 곡선은 1, 5, 6, 7 및 8. 1.7 마이크로몰라, 21.4 마이크로몰어, 58.8 마이크로몰어, 239.0 마이크로몰어, 500 마이크로몰어에서 각각 최대 억제 농도를 나타낸다.M-P-P-A 솔루션을 준비하는 것을 기억하십시오. 분석이 시작되기 직전에.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

thermostability 공학 분야에 해당 소설 감독 진화 방법은 bacteriolytic 효소 용으로 개발하고 결과적으로 확인되었습니다. 고온의 부화 후 야생 형 단백질에 비해 무작위 mutagenesis의 한 라운드, 발전 bacteriolytic 효소, PlyC 29C3는 두 번 잔류 활동보다 더 큰 표시 한 후.

내열 Bacteriolytic 효소의 감독 진화에 대한 새로운 검사 방법

출처: Vidilaseris, K., et al. Thermotoga maritima 막 결합 피로포스파타제 억제제에 대한 스크리닝. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 오르토인산염 방출을 정량화하여 박테리아 막 결합 피로포스파타제(mPPase)의 억제제를 스크리닝하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 잠재적인 항균 약물 표적인 Thermotoga maritima에서 mPPase를 억제하는 화합물을 식별할 수 있습니다.

비색 분석을 이용한 박테리아 막 결합 피로포스파타제의 스크리닝 억제제 

본 보고서는 리슈마니아 세포 추출물을 사용하여 포스파티딜에탄올아민 메틸전이효소 활성을 측정하기 위한 체외 효소 분석을 설명합니다. 이 분석은 방사성 메틸기가 S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine에서 내인성 포스파티딜에탄올아민으로 전달되는 것을 기반으로 합니다.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

본 연구는 200개 이상의 효소에 이론적으로 적용할 수 있는 보편적인 유전 효소 스크리닝 시스템을 이용한 고처리량 스크리닝 방법을 제시합니다. 여기서 단일 스크리닝 시스템은 사용된 기질(p-니트로페닐 아세테이트, p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 및 페닐 포스페이트)을 간단히 변경하여 세 가지 다른 효소(리파아제, 셀룰라아제 및 알칼리성 인산가수분해효소)를 식별합니다.

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

Toll-like receptor (TLR) 신호 전달은 많은 인간 염증성 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을하며, 생체 활성 나노 입자에 의한 TLR 반응을 조절하는 것은 많은 염증성 질환에서 유익한 것으로 기대된다. THP-1 세포 기반 리포터 세포는 TLR 신호 전달의 새로운 억제제를 확인하기위한 다양하고 강력한 스크리닝 플랫폼을 제공합니다.

Toll-like Receptor Signaling의 억제제에 대한 식세포 면역 세포에서의 생체 활성 나노 입자의 스크리닝

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

배우세요 Thermotoga maritima 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝 방법을. 몰리브덴 블루 반응을 활용한 이 프로토콜은 비용 효율적이고 안정적인 색소 생성을 제공하여 기생충 질환 치료제 발굴에 활용됩니다.

써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

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