Name: 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 학습하세요 HBx-DDB1 상호작용 억제제를 분할 루시퍼라아제 분석 시스템으로 실시간 검출하는 방법을. 이 기술은 HPV 바이러스 전사 억제 및 새로운 항바이러스 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 문부과학성의 보조금 지원으로 지원되었으며, 일본 스포츠, 과학 기술, 일본 (#19H03430 및 #17K09405 M.O., 그리고 K.S.에 #19J11829), 혁신적인 분야에 대한 과학 연구를위한 보조금에 의해 (#18H05024 M.O.), 일본 의학 연구 개발 기관에서 간염에 대한 연구 프로그램에 의해, AMED (M.O., #JP19fk021005), 혁신적인 개발 및 B에 대한 신약의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), 암 간염에 대한 새로운 약물의 응용 프로그램에 의해 (M.O.에), AB에 의해 #JP19fk0310102 일본 응용지질학재단과 고바야시 암연구재단(M.O.), GSK 재팬 연구보조금 2018(K.S.) 및 미야카와 기념연구재단(K.S.)의 보조금으로 지원.

참고: 분할 루시퍼라아제 분석법의 개략적 표현은 도 1A에나와 있으며, 분석 과정은 도 1B에설명되어 있습니다. 상호작용 역학은 세포 라해없이 실시간으로 측정될 수 있다.
1. 세포 준비
<ol><li>덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 배양된 HEK293T 세포를 10% v/v 태아 소 혈청(FBS),37°C에서 1x 페니실린/스트렙토마이신을 20%O2 및 5%CO2로유지한다.</li>
	<li>시드 5 x 106 세포를 100 mm 접시에 DMEM 10 mL로 넣고 밤새 37°C에서 배양합니다.</li>
	<li>다음 방법에 따라 HBx 및 DDB1의 1 μg를 분할 된 루시퍼라제를 세포내로 일시적으로 트랜스펙트합니다. 참고: 플라스미드 DNA가 형질감염된 양은 사용되는 형질감염 섭정에 따라 달라질 수 있다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시퍼라제의 최적 위치는 사전에 결정되어야 한다. 이 경우 HBx는 DDB1(SmBit-DDB1)의 N-종점에서 HBx(HBx-LgBit)와 DDB1의 C-종단에서 LgBit에 융합되어 최상의 결과(즉, 가장 밝은 루시퍼라아제 신호)를 제공했습니다. 이 프로세스는 이전에 자세히보고된 7.<ol>
<li>DNA 응축 완충액(물자표)에서DNA 플라스미드(SmBit-DDB1)의 DNA 플라스미드 및 1 μg를 발현하는 HBx-LgBit의 1 μg를 총 부피 300 μL로 희석한다.</li>
		<li>인핸서 용액 16μL(재료 표)을넣고 1초 동안 와르싱하여 섞습니다.</li>
		<li>샘플을 실온에서 3분 동안 배양합니다.</li>
		<li>60 μL의 형질감염 시약(재료 표)을샘플에 넣고 10 초 동안 소용돌이치면서 섞습니다.</li>
		<li>샘플을 실온에서 8분 동안 배양합니다.</li>
		<li>배양 동안, 접시로부터 배양 배지를 흡인(단계 1.2에서 제조됨)하고, 인산완충식염수(PBS)의 5 mL로 세포를 세척한다. 흡인으로 PBS를 제거하고 DMEM 7mL를 추가합니다.</li>
		<li>형질감염 복합체를 포함하는 튜브에 3 mL의 DMEM을 추가합니다. 파이펫팅으로 혼합하고 10cm 접시에 세포에 형질 감염 복합체를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포를 37°C에서 10시간 동안 5%CO2 이하의 인큐베이터에서 배양한다.</li>
	<li>다음 방법에 따라 5 x 104 세포 / 50 μL의 흰색 96 웰 플레이트로 세포를 다시 시드하십시오.<ol>
<li>소비된 세포 배양 배지를 제거하고 5 mL의 PBS로 세포를 세척하였다.</li>
		<li>흡인에 의해 PBS를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA의 1 mL를 추가하고, 세포를 분리하기 위해 5분 동안 37°C에서 배양합니다.</li>
		<li>DMEM 4 mL를 추가하고 셀 층의 표면에 여러 번 파이펫팅하여 매체를 분산시고. 셀 현탁액을 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮</li>
		<li>실온에서 5 분 동안 500 x g의 원심 분리전 세포.</li>
		<li>상급을 버리고 PBS의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.</li>
		<li>실온에서 5분 동안 500 x g의 세포 현탁액을 원심분리하고 상급을 폐기합니다.</li>
		<li>완충된 세포 배양배지(재료 표)로세포 펠릿을 희석하고 10% FBS를 1.0 x 106 세포/mL의 파종 밀도로 보충하였다.</li>
		<li>피펫 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰 내로 넣고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓는다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°C에서 5%CO2 하에서 10시간 동안 세포를 배양한다.</li>
</ol>2. 복합 스크리닝
<ol><li>배양 동안, 스크리닝화합물(재료 표)과용매(디메틸 설폭사이드[DMSO])를 13.5배 농도로 희석시켰다. 예를 들어, 스톡이 10 mM이고 스크리닝 농도가 10 μM인 경우, 완충된 세포 배양 배지의 73.1 μL에 1 μL의 스톡 용액을 추가한다.</li>
	<li>12.5 μL의 발광 기판(재료표)을각 웰에 넣고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 네거티브 컨트롤로, 플레이트의 양쪽 끝에있는 우물 (즉, 열 1 및 12)에는 발광 기판이 포함되어서는 안됩니다.</li>
	<li>발광계(재료표)를사용하여 기준선 발광을 측정합니다.</li>
	<li>초기 측정 직후, 5 μL의 화합물을 추가하고 각 우물에 2.1 단계에서 희석된 DMSO를 제어합니다. 참고: 최종 농도는 10 μM입니다.</li>
	<li>발광 값을 30분마다 2시간 동안 측정합니다. 참고: 접시는 실온에서 어둠 속에서 배양해야합니다.</li>
	<li>기준선 신호에 대한 정규화 후 제어 DMSO 처리와 비교하여 억제 효과를 계산합니다. 참고: 중복 또는 삼중으로 각 화합물을 선별하면 변동을 줄일 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

우리는 HBx-DDB1 결합 억제제를 찾기 위해 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 편리한 스크리닝 방법을 개발했습니다. 상호작용 역학은 세포 용해없이 살아있는 세포에서 실시간으로 검출될 수 있다. HBx-DDB1 상호 작용의 억제는 Smc5/6의 복원으로 이어지며, 이는 바이러스 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래한다7. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HBV 치료의 부족을 극복할 수 있습니다.
살아있는 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기 위하여 많은 방법이 유효하더라도, 이 상호 작용을 검토하는 것은 어려운10남아 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 하나의 96 웰 플레이트를 스크리플 짧은 시간이 필요합니다. 더욱이, 높은 Z'점수, 높은 처리량 스크리닝을 위한 금 표준 품질 지수9로스크리닝 품질이 만족하...

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제이며, 연간 2억 4천만 명이 HBV에 만성 감염되고 간경변및 간세포암(HCC)을 포함한 감염합병증으로인한 90,000명의 사망자가 발생한다. 현재 항-HBV 치료제인 뉴클레오스(t)ide 유사체는 바이러스 역 전사를 충분히 억제하지만, 장기적인 임상 목표인 바이러스 성 단백질의 제거를 거의 달성하지 못한다. 바이러스 성 단백질 제거에 대한 그들의 나쁜 효과는 간세포핵2에서에피솜 바이러스 성 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA) 미니 염색체에서 바이러스 전사에 대한 직접적인 영향의 부족으로 인한 것입니다.
HBV 전사는 HBV 조절 X (HBx) 단백질3에의해 활성화됩니다. 최근 연구에 따르면 HBx는 DDB1-CUL4-ROC1 E3 유비퀴틴 리가제 복합체4,5,6을납치하여 cccDNA에서 HBV 전사를 차단하는 숙주 제한 인자인 염색체 5/6(Smc5/6)의 구조적 유지를 저하시키는 것으로 나타났습니다. 따라서, cccDNA로부터의 바이러스 전사를 촉진하는 중요한 단계는 HBx-DDB1 상호작용으로 생각된다. HBx와 DDB1 사이의 결합을 억제할 수 있는 화합물은 바이러스 전사를 차단할 수 있으며, 실제로 니타옥산화물은 실험실에서 개발된 스크리닝 시스템을 통해 HBx-DDB1 상호작용의 억제제로 확인되었다7.
여기서, 우리는 분할 루시퍼라제 상보적분석7,8을활용하는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하는 데 사용되는 편리한 스크리닝 시스템을 제시한다. 분할 루시퍼라제 서브유닛은 HBx 및 DDB1에 융합되고, HBx-DDB1 상호작용은 소단위를 근접하게 하여 밝은 발광 신호를 생성하는 기능성 효소를 형성합니다. 소단위 간의 상호작용이 가역적이기 때문에, 이 시스템은 HBx-DDB1 단백질을 빠르게 해리시키는 것을 검출할 수있다(도 1). 이 시스템을 사용하여, 큰 화합물 라이브러리는 쉽게 스크리닝될 수 있으며, 이는 HBx-DDB1 상호작용을 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 화합물의 발견을 초래할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트, 96 well, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>Effectene transfection 시약</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>DNA 응축 완충액, 인핸서 용액 및 형질 주입 시약</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td> <td>포함</td><td></td>175012</tr><tr><td>GloMax 96 마이크로플레이트 발광계</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&ndash; LgBit 발현 DNA 플라스미드</td><td>우리 실험실</td><td></td><td>요청 시 이용 가능</td></tr><tr><td>세포 HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI 스타터 시스템</td><td>Promega</td><td>N2015</td><td>Nano-Glo Live Cell Reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>포함 원고에서 "완충 세포 배양 배지"로 설명</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Screen-Well FDA 승인 약물 라이브러리 V2 버전 1.0</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841</td><td>여기에 사용된 화합물은 다음과 같습니다: 메퀴놀, 메르캅토푸린 수화물, 메스나, 메스트라놀, 메타프로테레놀 헤미설페이트, 메타라미놀 타르타르산염, 메탁살론, 메타콜린 클로라이드, 메타졸아미드, 메테나민 히푸레이트, 메토카르바몰, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 메스코폴라민 브로마이드, 메푹시미드, 메티클로디아지드, 메틸 아미놀레불리네이트&미드닷; HCl, 메틸에르고노빈 말레산염, 메톨라존, 메티라폰, 멕실레틴&미드닷; HCl, micafungin, miconazole, midodrine&middot; HCl, miglitol, milnacipran&middot; HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril &middot; HCl, 모메타손 푸로에이트, 무피로신, 나돌롤, 나프실린&미드닷; Na, naftifine&middot; HCl, naratriptan&middot; HCl, natamycin, nebivolol &middot; HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline&middot; HCl, olsalazine&middot; Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin 염화물, oxytetracycline &middot; HCl, 팔리페리돈, 팔로노스트론&미드닷; HCl, 파로모마이신 설페이트, 파조파닙&미드도트; HCl, 페메트렉시드 디소듐, 페미로라스트 칼륨, 페니실라민, 페니실린 G 칼륨, 펜타미딘 이세티오네이트, 펜토스타틴, 페린도프릴 에르부민, 퍼메트린, 퍼페나진, 페넬진 설페이트, 페닐에프린, 피토나디온, 피메크로리무스, 피타바스타틴 칼슘, 그리고 포도필록스</td></tr><tr><td>SmBit&ndash; DDB1 발현 DNA 플라스미드</td><td>요청 시 당사 실험실</td><td></td><td>이용 가능</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 hbx-ddb1 상호 작용의 억제제 식별

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

B형 간염 바이러스(HBV) 감염에 대한 새로운 치료제에 대한 긴급한 필요성이 있다. 현재 유효한 핵 (t)ide 유사체는 바이러스 복제를 강력하게 억제하지만, 그들은 바이러스 공유 폐쇄 원형 DNA (cccDNA)에서 전사 된 바이러스 성 단백질의 발현에 직접적인 영향을 미치지 않습니다. 높은 바이러스 항원 부하가 이 만성 및 HBV 관련 발암에 역할을 할 수 있기 때문에, HBV 처리의 목표는 바이러스 성 단백질을 근절하는 것입니다. HBV 조절 단백질 X (HBx)는 cccDNA에서 바이러스 전사의 활성화의 결과로 염색체 5/6 (Smc5/6)의 구조적 유지 보수를 저하시키기 위해 숙주 DNA 손상 결합 단백질 1 (DDB1) 단백질에 결합합니다. 여기서, 분할 루시퍼라제 보완 분석 시스템을 사용하여, 우리는 HBx-DDB1 상호작용의 억제제를 식별하기 위한 포괄적인 화합물 스크리닝 시스템을 제시한다. 우리의 프로토콜은 살아있는 세포 내에서 실시간으로 상호 작용 역학의 쉬운 검출을 가능하게합니다. 이 기술은 HBV 감염의 처리를 위한 새로운 치료제를 발견하는 중요한 분석사가 될 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용한 다음의 대표적인 결과는 그림 2A, B에나와 있습니다. 신호 대 배경 비율이 80보다 크고 Z'factor9 (고처리량 스크리닝을위한 금 표준 품질 지수)가 0.5보다 높았으며,이 분석 시스템은 높은 처리량 스크리닝에 허용되었음을 나타냅니다. 대조군(DMSO 만)에 비해 &gt;40% 억제로 설정된 임계값으로, 우리는 니타옥사니드를 후보약물7로확인하였다. 이 시스템을 사용하여, 더 나은 후보 약물은 다른, 더 큰 화합물 라이브러리를 선별하여 찾을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60652/...

여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

HBX-DDB1 상호 작용은 cccDNA에서 HPV 전사를 촉진하기위한 중요한 단계이므로이 프로토콜은 HPV 기능적 치료법을위한 새로운 치료제를 발견하는 핵심 자산이 될 수 있습니다. 우리의 절차는 간단하고 화면으로 짧은 시간이 필요합니다. 내가 혼합하는 상호 작용은 세포 용해를 필요로하지 않고 실시간으로 검출 될 수있다.또한, 높은 Z 프라임 점수로 스크리닝 품질이 만족스럽습니다. HBX-DDB1 상호 작용의 억제는 HPV 전사, 단백질 발현 및 cccDNA 생산의 억제를 초래하는 Smc5/6의 복원으로 이어집니다. 항 바이러스 작용의 이 새로운 기계장치는 현재 HPV 치료의 부적수를 극복할 수 있습니다.단백질 단백질 상호 작용은 약물 표적의 중요한 클래스입니다. 여기에 설명된 분할 루시파라제 계산은 바이러스성 과 hasS 단백질 사이의 상호 작용을 표적으로 하고, 그밖 전염병을 위한 치료를 개발하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 간단하고 이해하기 쉽지만, 일부 단계는 시각적 데모없이 재현하기 어려울 수 있습니다.따라서 시각적 데모는 프로토콜을 이해하는 데 큰 도움이 될 것입니다. 5회 HEK293T 셀을 5번 10밀리리터의 DMEM10밀리리터로 100mm 접시에 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤을 배양하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 총 300마이크로리터에 대한 DNA 플라스미드 및 DNA 응축 버퍼를 발현하는 HBx-LgBit 및 SmBit-DDB1의 각각 1마이크로그램을 희석시한다.증강용 액액 16마이크로리터를 추가하고 1초 동안 소용돌이를 통해 튜브를 섞습니다. 실온에서 3분간 샘플을 배양한 다음 60마이크로리터의 트랜스페트 시약을 추가합니다. 튜브를 10초 동안 소용돌이시키고 샘플을 8분 동안 배양합니다.한편, 세포와 접시에서 매체를 흡인하고 PVS의 다섯 밀리리터로 씻어. PVS를 흡인하고 DMEM의 7 밀리리터를 추가합니다. 분리 복합체를 사용하여 튜브에 DMEM의 3 밀리리터를 추가하고, 파이펫을 위아래로 혼합하고, 혼합물을 세포에 추가합니다.그런 다음 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 10시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 소비된 배양 배지를 제거하고, PVS의 5밀리리터로 세포를 세척한다. 0.25%의 트립신 EDTA의 1 밀리리터에서 PVS를 제거하고 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 분리합니다.다음으로, DMEM의 4밀리리터를 추가하고, 세포 층의 표면을 여러 번 배관하여 배지를 분산시키고, 현탁액을 튜브로 이송한다. 5 분 동안 500 회 G에서 세포를 원심 분리 한 다음 상체를 버리고 PVS의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 신약화를 반복하고 상체를 폐기합니다.이어서, 밀리리터당 100만 개의 세포밀도로 10%FBS로 보충된 완충된 세포 배양 배지로 세포 펠릿을 다시 중단한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 파이펫 50 마이크로리터, 10 시간 동안 37섭씨 인큐베이터로 세포를 반환합니다. 세포가 배양하는 동안, 스크리닝 화합물과 용매를 13.5 X 농도로 희석한다.각 우물에 발광 기판12.5 마이크로리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 플레이트를 배양합니다. 발광계로 기준선 발광을 측정하고, 화합물의 5마이크로리터를 추가하고 제어된 DMSO를 각 웰에 즉시 추가합니다. 2시간 동안 30분마다 발광을 측정한 다음 DMSO 처리와 비교하여 화합물의 억제 효과를 계산합니다.기준발광 신호를 측정하고 신호 대 배경 비율이 80보다 큰 것으로 계산되었다. Z 프라임은 0.5보다 컸으며, 이는 이 분석 시스템이 고처리량 스크리닝에 허용된다는 것을 나타냅니다. DMSO 전용 대조군에 비해 임계값을 40% 이상으로 설정함으로써, 니타조산이드는 후보약물로 확인되었다.우리는 이전에 이 방법을 사용하여 반응성 소규모 화합물 라이브러리를 선별하여 HBX-DDB1 상호작용의 억제제로서 nitazoxanide를 확인했습니다. nitazoxanide를 사용 하 여, 우리는 HBX-DDB1 상호 작용의 억제, 바이러스 전사의 감소, 그리고 후속 바이러스 성 제품 수준을 확인 합니다. 표적 단백질에 융합된 분할 루시파아제의 최적 부분은 사전에 결정되어야 한다.이 경우 HPX는 DDB1의 마지막 종착지에서 스몰 비트에 융합된 HPX와 DDB1의 C 종착기에서 큰 비트에 융합되어 최상의 결과를 제공했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 다양한 생물 학적 과정에서 역할을 보여왔다. 더 miRNA - UTR의 상호 작용을 이해하기 위해서, 우리는 소설 루시페라제 유전자와 분석 시약, LightSwitch 시스템과 결합하여 3 UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

당사는 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 모니터링하기 위해 split-luciferase reassembly assay를 확립했습니다. 이 분석을 사용하여 화학적 처리 조건에서 HEK293T 세포에서 이러한 세포 간 결합의 수준을 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

학습하세요 HBx-DDB1 상호작용 억제제를 분할 루시퍼라아제 분석 시스템으로 실시간 검출하는 방법을. 이 기술은 HPV 바이러스 전사 억제 및 새로운 항바이러스 치료제 개발에 활용됩니다.

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별

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