Name: 고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 H5N1 및 H7N9 인플루엔자 바이러스의 당단백질을 이용한 고적퇴력 감염성 슈도타입 입자 생산 방법을. qRT-PCR 정량화와 세포 형태학 평가를 통해 바이러스 감염력을 분석하고, BSL-2 환경에서 안전하게 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 절강 성 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, 2017KY538), 항저우 시 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, OO20190070), 항저우 의학 및 항저우 의학 및 기술 계획에서 보조금에 의해 지원되었다 기술 핵심 프로젝트 (그랜트 번호, 2014Z11) 및 사회 개발 및 과학 연구의 항저우 시 자치 응용 프로그램 프로젝트 (그랜트 번호, 20191203B134).

1일차: 세포 배양 및 시팅
<ol><li>인간 배아 신장(HEK) 293T/17 세포를 60mm 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신(DMEM Complete Medium) 으로 보충하여 변형된 필수 배지(DMEM)를 사용하여 배양합니다. DCM)을 37°C에서, 5%이산화탄소(CO2)에서약 80% 까지 인큐베이터에 있다. 참고 : HEK 293T / 17 낮은 통로 세포를 권장합니다.</li>
	<li>인산완식염(PBS) 1x 5 mL로 조심스럽게 세포를 세척합니다. 참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다.</li>
	<li>PBS를 제거하고 0.25% 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액의 1 mL로 세포를 해리. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓고 세포가 해리될 때까지 5분 이상 동안 배양합니다.</li>
	<li>DCM의 5 mL을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.</li>
	<li>세포 현탁액을 미리 냉각된 15 mL 원심분리기로 옮김을 옮김. 4°C에서 5분 동안 250 x g에서 원심분리에 의해 세포를 수집한다.</li>
	<li>가능한 한 상급의 많은 장식. DCM 배지의 6 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포를 계산합니다. DCM 배지로 세포를 1 x 106 셀/mL로 희석합니다.</li>
	<li>세포를 잘 당 1 mL의 세포 현탁액으로 6 웰 플레이트에 시드합니다. 접시를 가볍게 두드려 세포를 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.</li>
</ol>2. 2일차: 리포페션에 의해 중재된 4-플라스미드 코트랜스펙션
<ol><li>반전된 광 현미경의 밑에 세포 형태 및 조밀도를 확인하십시오. 이상적으로, 세포는 형질 전환에 대략 85% 수렴되어야 합니다. 배지를 잘 당 1 mL의 무혈청 DMEM 배지로 교체한 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다.</li>
	<li>배양된 각 웰에 대해 형질전환 시약의 8 μL을 감소된 혈청 배지(튜브 1)로 150 μL의 부피로 희석한다. 부드럽게 섞고 실온(RT, 약 20°C)에서 5분간 배양합니다. 참고: 각 형질감염 샘플에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 2개(번호 1 및 2)를 준비합니다.</li>
	<li>튜브 2에서, 플라스미드 DNA 2.5 μg을 150 μL의 감소된 혈청 배지로 희석한다. 참고: 튜브 2에서 표 1과같이 각 플라스미드 DNA를 희석합니다. VSV가 광범위한 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 플라스미드 인코딩 된 혈관 성 질염 바이러스 (VSV) G 당단백질 (플라스미드 pLP-VSVG)은 양성 대조군으로 사용되었습니다. 인플루엔자 봉투 당단백질(Δenv pps)이 부족한 음성 대조군 입자는 pcDNA-개그-폴 및 pcDNA-GFP 플라스미드를 사용하여 생성되었다.</li>
	<li>5 분 배양 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 감염 시약과 결합하십시오. 부드럽게 섞고 RT에서 15분 간 더 배양하세요.</li>
	<li>DNA-지질 복합체를 세포 및 무혈청 배지를 함유하는 상응하는 웰에 첨가한다. 접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞어주세요.</li>
	<li>37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, DMEM의 2 mL로 대체하였다. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 36-48시간 동안 배양한다. 참고: 혈청이 없고 항체가 없는 DMEM으로 교체하십시오. 이 프로토콜에서는 두 개의 하와 2개의 NA를 사용하여 8가지 유형의 pps를 생성할 수 있습니다(표 1에표시됨).</li>
</ol>3일차: 세포 파종
<ol><li>감염성 분석의 경우, 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포에서 감염되기 쉬운 세포의 각 유형을 시드합니다. 참고 : 이 기사에서 감염성 분석기를 수행하기 위해 두 가지 유형의 표적 세포를 사용합니다: 폐포 유래 인간 세포주 (A549 세포) 및 Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포. MDCK 세포는 인플루엔자 연구에 널리 사용되며 좋은 대조군이 될 수 있다. 이 단계는 유연합니다. 다른 표적 세포주들은 연구 요건에 따라 사용될 수 있다.</li>
	<li>플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.</li>
</ol>4. 4 일: 가성 형바이러스 입자 수집, 정량화 및 감염성 분석
<ol><li>가성형 바이러스 입자 수집<ol>
<li>매체의 색상을 확인합니다. 이상적으로는 밝은 분홍색 또는 약간 주황색이어야합니다. 440-460 nm 의 거꾸로 형광 생물학적 현미경으로 세포를 검사합니다.</li>
		<li>36-48 시간 후 변형에서 0.45 μm 폴리 비닐 리덴 불소 (PVDF) 멤브레인 필터를 통과하여 pps를 수확하여 세포 이물질을 제거합니다.</li>
		<li>pps를 작은 볼륨 aliquots로 나눕니다.</li>
		<li>pps를 -80 °C에 보관하십시오. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 그러나, 이것은 권장되지 않습니다, pps의 감염은 동결 및 해동 후 급격히 감소하기 때문에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가성형 바이러스 입자 정량화<ol>
<li>정제된 pps 20 μL을 1.5 mL 리보누클리스(RNase)가 없는 미세원심지 튜브로 옮니다.</li>
		<li>0.24 U/mL 벤조나아제 뉴클레아제 1 μL을 첨가합니다. DNA 및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C에서 배양합니다. 참고: 표적 RNA, 일반적으로 하향 조절된 사이토메갈로바이러스 (CMV)-GFP RNA는 pps에서 포장되고 벤조나제 뉴클레아제에 의해 저하되는 것을 피할 수 있습니다.</li>
		<li>벤조나아제 뉴클레아제에 대해 -70°C에서 시료를 동결.</li>
		<li>봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출하기 위해 30 분 동안 50 °C에서 2 μL의 단백질 분해제 K. 인큐베이터를 추가하십시오. 100°C에서 3분 동안 단백질나제 K를 비활성화한다.</li>
		<li>범용 프로브 1단계 RT-qPCR 키트를 사용한 실시간 정량적 역전사(qRT)-PCR로 pps를 정량화하고, 전방 프라이머 5'-AACAAAGAGCTGGATTTTTTTTTAA-3', 역방향 프라이머 5'-GGGTCTCCTCAGAGGATTAGAC-3', 프로브 5'-FAM-CCCCCAAAAGACCCCCCGAG-TAM-3', 실시간 PCR 열자전거. 감염 전에 RNA 카피 번호에 대한 pps를 정상화하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염성 분석<ol>
<li>qRT-PCR 데이터의 관점에서 각 유형의 pps를 4 x 105 복사/mL(pp 정규화)로 희석합니다.</li>
		<li>토실-페닐알라닌 클로로메틸-케톤(TPCK)-트립신을 H7N9 HA를 수용하는 pps에 40 μg/mL의 최종 농도에 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 HA1 및 HA2의 기능적 소단위를 형성한다. 참고: HA1-HA2 절단 부위에 여러 아르기닌과 리신 잔류물이 있기 때문에 H5를 TPCK-트립신으로 취급할 필요가 없습니다. 이 다중 기본 절단 사이트는 유비쿼터스 세포 프로테아제에 의해 절단 될 수있다.</li>
		<li>정규화된 pps를 DMEM 배지(무혈청)와 1:1 비율(부피/부피)으로 혼합합니다.</li>
		<li>생체 안전성 캐비닛에 영향을 받기 쉬운 세포가 들어있는 접시를 가져옵니다.</li>
		<li>상월체를 흡인하고 미리 온난화된 PBS의 0.1 mL로 세포를 한 번 세척한다.</li>
		<li>0.1 mL의 pps-DMEM 혼합물을 하나의 우물에 추가합니다. 각 유형의 pps의 감염성 검사를 하나의 취약한 세포주로 세배로 합니다(그림 2에서간과함).</li>
		<li>37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 96웰 플레이트를 배양한다.</li>
		<li>상급을 흡인하고 DCM의 0.1 mL로 교체하십시오.</li>
		<li>37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 24-36h에 대한 96웰 플레이트를 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5일차 5일 또는 6일: 감염성 검출
<ol><li>96 웰 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛에 가져옵니다.</li>
	<li>상월체를 흡인하고 미리 온화한 PBS의 0.2 mL로 세포를 1x 세척한다.</li>
	<li>PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액의 0.1 mL로 세포를 해리시.</li>
	<li>접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 3분 동안 놓고 세포가 해리될 때까지. 참고 : 이것은 세포 응집으로 이어질 수 있기 때문에 5 분 이상 배양하지 마십시오.</li>
	<li>DCM의 0.4 mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.</li>
	<li>여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.</li>
	<li>세포 현탁액을 냉각된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮니다.</li>
	<li>형광 활성화 세포 선별 (FACS)로 GFP 리포터 양성 세포를 결정합니다. 참고: GFP 리포터 양성 표적 세포의 비율을 결정하기 위해, 대조군 샘플(pps-처리되지 않은 A549 세포 또는 MDCK 세포)을 사용하여 유동 세포측계 게이트를 설정한 다음 샘플당 10,000개의 GFP 리포터 양성 세포를 계산합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서, 우리는 BSL-2 설정에서 인플루엔자 바이러스 가성 입자(pp)를 생성하는 방법을 설명한다. 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP는 pps에 통합되고 감염성 분석에서 FACS에 의해 pps를 정량화하는데 사용될 수 있다. 우리는 인플루엔자 연구에 널리 사용되기 때문에 두 가지 유형의 영향을 받기 쉬운 세포주를 선택했습니다. MDCK 세포는 이러한 연구에서 사용되는 가변 불멸의 인간 세포에 좋은 대조군을 제공할 것이다.
이 프로토콜은 GFP 리포터를 통합하고 세포막에 싹을 생성 할 수있는 레트로 바이러스 MLV를 기반으로합니다. 이 기술은 널리 패키징 인플루엔자바이러스 입자4,22,23,24를위해 개발되었습니다. 일부 다른 시스템은 렌티바...

바이러스 입자의 임무는 감염된 숙주 세포로부터 비감염숙주 세포로 게놈을 수송하고 이를 복제 유능한 형태1에서세포질 또는 핵으로 전달하는 것이다. 이 프로세스는 처음에 호스트 세포 수용 체에 바인딩에 의해 트리거됩니다., virion와 세포 막의 융합 다음. 인플루엔자 바이러스와 같은 포위 된 바이러스의 경우, 스파이크 당단백질은 수용체 결합 및 융합1,2를담당합니다. Viral envelope glycoproteins (e.g., pyrogens, antigens), are involved in many important properties and events, such as virus lifecycle initiation (binding and fusion), viral pathogenesis, immunogenicity, host cell apoptosis and cellular tropism, the cellular endocytic pathway, as well as interspecies transmission and reassortment1,3,4,5,6,7. 바이러스 성 봉투 당단백질에 대한 연구는 바이러스 감염 과정의 많은 측면을 이해하는 데 도움이됩니다. 의사형 바이러스 입자(pp)는 또한 의사 입자 또는 의사 입자라고도 하며, 가성 화 기법을 통해 생성될 수 있다8,9,10. 이 기술은 C형 간염11,12형,B형 간염13형,수포성 구내염 바이러스(VSV)14, 15,및 인플루엔자 바이러스16,17,18,19를포함한 많은 바이러스의 가성 입자를 개발하는 데 사용되어 왔다. 이 기술은 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스의 개그폴 단백질을 기반으로 합니다.
가성형 바이러스 입자는 바이러스 봉투 당단백질 발현 플라스미드, 봉투 env 유전자를 누락한 레트로바이러스 패키징 플라스미드, 및 pp 생산자 세포내로의 별도의 리포터 플라스미드를 교전시킴으로써 3-플라스미드 시스템을 사용하여 수득될 수 있다. 레트로바이러스는 개그 단백질에 의해 조립되고, 바이러스 봉투 단백질1을발현하는 감염된 세포막에서 싹이 나고 있다. 따라서, 레트로바이러스 개그 단백질을 이용하여 고역인플루엔자 pps를 획득하여 인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 세포막상에서 싹을 생성할 수 있다. 우리의 이전 연구에서, 모든 조합의 HA /NA는 기능적이었고 바이러스 성 수명 주기16,17,18,20,21에서해당 기능을 수행 할 수 있었습니다. 이러한 pps는 hemagglutination, neuraminidase 활동, HA 수용체 결합 트로피즘, 및 감염을 포함하는 인플루엔자 생물학적 특성을 조사하기 위해 사용된다. HA와 NA는 바이러스 성 수명 주기에서 중요한 표면 기능성 단백질이기 때문에, 인플루엔자의 다른 변종에서 파생된 불일치하는 HA 및 NA는 부분적으로 그들 사이의 재분류를 입증할 수 있습니다. 여기서, 우리는 2개의 하스와 2개의 NA (HPAI H5N1 긴장 및 H7N9 얼룩에서 파생된)를 결합하여 8가지 유형의 인플루엔자 pps를 생성합니다. pps의 이 8가지 모형은 2개의 네이티브 pps, H5N1pp, H7N9pp를 포함합니다; 두 개의 일치하지 않는 PPS, (H5 + N9)pp, (H7 + N1)pp; 단일 당단백질(HA 또는 NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. H5N1 및 H7N9와 같은 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 생체 안전성 요건에 의해 제한됩니다. 야생 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 모든 연구는 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서 수행되어야합니다. 가성형 바이러스 입자 기술은 생체 안전 도 2(BSL-2) 설정에서 인공 비리온을 패키징하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 pps는 두 가지 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)에 따라 인플루엔자 바이러스 과정을 연구하는 보다 안전하고 유용한 도구를 나타냅니다.
이 프로토콜은 3-plasmid cotransfection 전략(그림 1에서검토됨), pps를 정량화하는 방법 및 감염성 검출을 통해 이러한 pps의 생성을 설명합니다. pp 생산에는 플라스미드의 3가지 종류가 포함됩니다(그림1). 레트로바이러스 개그폴 단백질을 인코딩하는 개그폴 유전자는 레트로바이러스 패키징 키트에서 복제하여 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입하고 PCDNA-Gag-Pol로 명명하였다. 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자는 pTRE-EGFP 벡터에서 복제되고 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입되고 pcDNA-GFP라고 합니다. 복제 동안, 패키징 신호(θ) 시퀀스가 프라이머를 통해 첨가되었다. HA 및 NA 유전자는 각각 pVRC-HA 및 pVRC-NA라는 pVRC 플라스미드로 복제되었다. 마지막 플라스미드는 융합 단백질을 인코딩하고 관심 있는 임의의 다른 융합 단백질로 대체할 수 있다. 우리의 의사 티핑 플랫폼은 두 개의 당단백질 발현 플라스미드를 포함합니다: pVRC-HA 및 pVRC-NA. 이 BSL-2 설정에서 다른 바이러스 긴장 사이 재분류에 대 한 연구를 단순화할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Benzonase</td><td>Nuclease Millipore</td><td>70664</td><td>단백질 용액에서 핵산의 효과적인 점도 감소 및 제거</td></tr><tr><td>Clear Flat Bottom 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트(96-well)</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>최적의 세포 부착을 위해 처리됨 감마선 멸균 및 인증된 비발열성 웰 식별</td></tr><tr><td>을 위한 개별 영숫자 코드투명 TC 처리 다중 웰 플레이트(6-웰)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>웰 식별을 위한 개별 영숫자 코드 최적의 세포 부착을 위해 처리됨 감마선 조사로 멸균</td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 필수 배지(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>다양한 포유류 세포의 성장을 지원하기 위해 널리 사용되는 기본 배지</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>기초 세포 배양, 전문 연구 및 특정 분석에 탁월한 가치를 제공할 수 있는 소 태아 혈청</td></tr> 형<tr><td>광 활성화 세포 분류(FACS)</td><td>Beckman coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>인간 폐포 선암종 A549 세포</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>인간 배아 신장(HEK) HEK-293T/17 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>가장 다양한 부착 세포주 및 현탁 세포주를 효과적으로 transfection하는 것으로 밝혀진 다목적 transfection 시약</td></tr><tr><td>도립 형광 생물학적 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>도립 광학 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>빠르고 민감하며 정밀한 프로브 기반 qPCR 검출 및 표적 RNA 표적의 정량화.</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td><td>NEB</td><td>E3006L</td> 최대 <td>14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) 세포</td>를 견딜 수 있습니다. <td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, gamma sterilized</td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &micro; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>세포 성장 속도나 형태의 변화 없이 소 태아 혈청 보충제를 최소 50% 줄일 수 있는 개선된 최소 필수 배지(MEM)입니다. Opti-MEM I 배지는 또한 리포펙타민(Lipofectamine) 시약과 같은 양이온성 지질 형질주입 시약과 함께 사용하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 저감소 혈청 매체</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>항생제인 페니실린과 스트렙토마이신은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 대한 효과적인 결합 작용으로 인해 세포 배양의 박테리아 오염을 방지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>최대 RCF는 12,500 xg 입니다. 온도 범위는 -80 &deg입니다. C에서 120 &deg; C RNase-/DNase-free 멸균</td></tr><tr><td>PP 원심분리기 튜브(15mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>안정적이고 반응성이 높은 세린 프로테아제</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>처리 최적의 세포 부착을 위해 처리됨 감마선 멸균 및 인증된 비발열</td></tr><tr><td>성 TC 처리 배양 접시(60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>소 췌장에서 추출한 트립신 TPCK 처리, 본질적으로 무염, 동결 건조 분말, &ge; 10,000 BAEE units/mg 단백질</td></tr><tr><td>TPCK-트립신</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>트립신의 이 액체 제형에는 EDTA와 페놀이 레드가 포함되어 있습니다. Gibco 트립신-EDTA는 돼지 췌장에서 추출한 프로테아제의 방사선 조사 혼합물인 트립신 분말로 만듭니다. 트립신은 소화 강도로 인해 세포 해리, 일상적인 세포 배양 파시징, 1차 조직 해리에 널리 사용됩니다. 해리에 필요한 트립신 농도는 세포 유형 및 실험 요구 사항에 따라 다릅니다.</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

고병원성 h5n1 및 조류 h7n9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1(HPAI H5N1) 및 H7N9를 인간에게 직접 적으로 전달하는 것은 심각한 공중 보건 문제이며 전염병의 가능성을 시사한다. 그러나, 바이러스의 우리의 분자 이해는 기초적이고, 그것의 봉투 단백질의 생물학 속성을 치료 표적으로 공부하고 감염을 통제하는 전략을 개발하는 것이 필요합니다. 우리는 그것의 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 봉투 당단백질, HA 및 NA의 재분류 특성의 기능 분석을 포함하여 조류 인플루엔자 바이러스를 연구하는 고체 바이러스 성 가성 입자 (pp) 플랫폼을 개발했습니다. 수용체, 트로피즘, 중화 항체, 진단, 감염, 약물 개발 및 백신 설계의 목적을 위해. 여기서, 우리는 2개의 인플루엔자 A 균주(HAPI H5N1 및 2013 조류 H7N9)로부터 엔벨로프 당단백질(HA, NA)을 가진 pps를 확립하는 실험 적 절차를 기술한다. 그들의 생성은 pp에 봉투 당단백질을 통합하기 위하여 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)와 같은 몇몇 바이러스의 수용량에 근거를 두었습니다. 또한 이러한 pps가 RT-qPCR로 정량화되는 방법, 그리고 H및 NA의 기원에 따라 네이티브 및 불일치 바이러스 pps의 감염 성 검출방법을 자세히 설명합니다. 이 시스템은 매우 유연하고 적응력이 있으며 봉투 당단백질로 바이러스 pps를 확립하는 데 사용할 수 있으며 다른 유형의 봉투 바이러스에 통합 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 바이러스 성 입자 플랫폼은 많은 연구 조사에서 야생 바이러스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

위에서 설명한 일반적인 절차에 따라, 우리는 2개의 그룹 HA/NA 또는 VSV-G 당단백질 또는 무엔벨로프 당단백질을 결합한 10가지 종류의 pps를 생성하였다(표 1에나타낸). 그 중 7명은 전염성이 있습니다. 무엔벨로프 당단백질 또는 NA만 항구하는 pps는 여기에서 어떤 감염도 보여주지 않았습니다. 인플루엔자 pp 생산 절차는 그림 1에서검토됩니다. pps의 전송 전자 현미경 그래프 (예를 들어, H5N1pp)는 그림 3에도시되어 있습니다. 이 pps의 감염성 검사의 결과는 그림 4에도시됩니다. 7가지 유형의 pps의 감염도는 세포당 게놈 사본(GCP)[감염의 복합성(MOI)]값 20에서 평가되었다. H5를 품고 있는 pps 그룹에서, H5N1, (H5+N9) 및 H5의 감염도는 90.05±4.05%, 17.78±1.58%, 세포주 ...

이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

인플루엔자 바이러스 PP를 생산하고 감염성을 결정하는이 기술은 BSL-2 도시에서 인플루엔자 바이러스의 연구를 단순화 할 수 있습니다. 우리는 PPS의 qRT-PCR 데이터를 기반으로 감염에 대한 조달청을 정상화했습니다. 2개의 당단백질 발현 플라스미드는 인코딩되어 바이러스 재구에 대한 연구를 단순화할 수 있습니다.세포 씨를 뿌린 지 하루 후, 반전된 광 현미경으로 세포 형태와 밀도를 확인하십시오. 이상적으로 세포는 경질에서 대략 85% 응수되어야 합니다. 매체를 음편당 세럼이 없는 DMEM 1밀리리터로 교체하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.각 웰의 세포에 대해, 경질 시약의 8마이크로리터를 혈청 배지를 감소시 150 마이크로리터의 부피에 희석시. 용액을 부드럽게 섞고 실온에 5분간 앉게 하십시오. 한편, 2.5 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 158마이크로리터의 혈청 배지로 희석한다.5 분 인큐베이션 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 검사 시약과 결합하고 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 둡니다. 혈청이 없는 배지의 세포와 함께 해당 우물에 DNA 지질 복합체를 추가합니다. 그런 다음 앞뒤로 흔들어 서 접시를 부드럽게 섞습니다.플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4~6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 매체를 제거하고 잘 당 DMEM의 두 밀리리터로 대체합니다. 그런 다음 36 ~48 시간 동안 다시 배양하십시오.잘 당 10, 000 세포와 96 웰 플레이트에 취약 셀의 각 유형을 시드. 그런 다음 밤에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%로 둡니다. 형질 전환 후 셋째 날에는 분홍색 또는 약간 주황색으로 밝은 매체의 색상을 확인하고 440 ~ 460 나노미터 파장 아래 반전 된 플로레스센트 생물학적 현미경으로 세포를 검사하십시오.트랜스펙트 후 38내지 48시간 후에, 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 불소 막 필터를 통과하여 슈오타이핑 입자 또는 PPS를 수확하여 세포 이물질을 제거한 다음 소량의 알리코크로 나누어 섭씨 80도를 뺀 값으로 보관하십시오. 조달청을 정량화하기 위해 정제된 바이러스 입자30마이크로리터를 1.5 마이크로리터 RNase 프리 튜브로 옮기고 벤조나제 뉴클레아제 1마이크로리터를 첨가한다. DNA및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C의 튜브를 배양합니다.인큐베이션 후, 시료를 영하 70도까지 동결하여 핵을 활성화하고 단백질을 30분 동안 2마이크로리터의 단백질을 첨가하여 봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출한다. 그런 다음 3 분 동안 섭씨 100도에서 단백질 Ae K를 비활성. 텍스트 원고에 지정된 프라이머 및 프로브에서 유니버설 프로브 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용하여 정량적 역전사 RTPCR로 PPS를 정량화합니다.MMLiter 당 4 회 10 ~ 5 번째 RNA 복사본으로 PPS를 정상화합니다. 그런 다음 H7N9 헤마글루티닌을 수용하는 PPS에 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도에 TPCK-트립신을 추가합니다. 기능하위유닛 HA1 및 HA2를 형성하기 위해 1시간 동안 PPS를 섭씨 37도에서 배양한다.정규화된 PPS를 DMEM 배지와 1 대 1 비율로 혼합한 다음 취약한 세포를 포함하는 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다. 수퍼네티드를 흡인하고 100 마이크로리터의 미리 데운 PBS로 세포를 한 번 씻으세요. 각 우물에 PPS-DMEM 혼합물 100 마이크로리터를 추가하여 각 PPS 유형의 감염성 테스트를 하나의 취약한 세포주로 세팅합니다.플레이트를 섭씨 37도에서 4~6시간, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 그런 다음 슈퍼나탄을 흡인하고 감염성 검출 전에 24~36시간 동안 플레이트를 배양하는 DCM 의 마이크로리터 100마이크로리터로 교체한다. 우리의 결과는 PPS는 지금 사람들에게 전염성이 있는 것으로 간주됩니다.그래서 필요한 안전 가드 절차는 마스크를 착용하고 생물 안전 캐비닛에 감염성 검사를 수행하는 등의 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 2개의 그룹화된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 성혈구 스토마티스 바이러스 G 당단백질 또는 봉투 당단백질없음을 가진 10가지 유형의 의사형 입자 또는 PPS를 생성하기 위해 생성되었다. 조달청은 전염 전자 현미경으로 심화되었고 그들의 감염성은 두 개의 세포주, A549 및 MDCK에서 평가되었다.H5를 수용하는 조달국 군에서는 H5N1, H5 플러스 N9 및 H5의 감염성은 세포주 A549 및 40%5%와 5%의 약 90%와 10%였다. H7을 수용하는 조달군에서는 H7N9, H7 플러스 N1 및 H7의 감염성은 셀주 A549 및 8%4%와 1%로 각각 약 10%7% 및 1%였다. 성구 구내염 바이러스 G 당단백질 PP의 감염성은 A549의 경우 약 21%, MDCK 세포의 경우 16%였다.델타 봉투 당단백질 PP는 감염성을 나타내지 않았다. PP 생산업체 HEK-293T/17 세포가 이 절차의 기초에 해당한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 최적의 성장이 HEK-293T/17 세포를 가르치는 것이 가장 중요합니다.이 절차 또는 L2와 같은 다른 테스트에 따라 경계 분석이 수행 될 수 있습니다. 이 분석체는 수용체 선호도의 생물학적 특수성을 거의 제거할 수 있으며 패턴은 PPS의 트로피주의를 드러낼 것이다. 그들은 인플루엔자 바이러스에서 당단백질을 했다 이후 두 플러스 최대로 복제.HA와 NA 단백질은 별도로 연구할 수 있으므로 그(것)들 사이 를 재분류합니다. 돌연변이와 성숙한 효과를 탐구 할 수 있습니다.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 포유류 시스템에서 인플루엔자 바이러스 유사 입자(VLP)의 생성을 보여줍니다. 적절한 포유류 숙주 세포에서 서로 다른 바이러스 구조 단백질을 인코딩하는 3개의 진핵생물 발현 벡터를 발현하면 발현된 바이러스 단백질은 숙주 원형질막에서 VLP로 자가 조립되고 세포 표면에서 발아를 통해 방출됩니다.

포유류 시스템을 통한 인플루엔자 바이러스 유사 입자 생성 기술

이 비디오는 한랭 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 만드는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 인간 세포를 양방향 플라스미드로 형질주입한 후 저온 배양에서 배양하여 백신 생산에 적합한 바이러스를 생성하며, 따뜻한 조건에서 복제가 감소하는 것이 특징입니다.

백신을 위한 재조합 생독감 인플루엔자 바이러스 생성

여기에서 우리는 곤충 세포에 새로운 중국어 H7N9 바이러스에서 파생 제대로 접혀 기능 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 표현하는 방법에 대해 설명합니다. 기술은 어떤 바이러스 성 또는 세포 표면 단백질의 ectodomains을 표현하도록 할 수있다.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

여기, 우리가 현재 높게 병원 성 바이러스 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군 coronaviruses의 스파이크 단백질을 통합 하는 BSL-2 설정에 pseudotyped 입자를 생성 하는 프로토콜. 이러한 pseudotyped 입자 포함 대상 호스트 세포에 바이러스 항목의 정량화를 허용 luciferase 취재 원 유전자.

Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

프로토콜은 cryo - 전자 tomography와 3 차원 영상 처리를 사용하여 막 단백질의 구조를 결정하기 위해 높은 처리량 접근 방식을 설명합니다. 이것은 시편 준비의 세부 사항, 데이터 수집, 데이터 처리 및 해석을 포함하고, 접근, HIV - 1 봉투 당단백질에 대한 대표적인 대상의 생산 마칩니다. 이러한 계산 절차는 원격 작업 및 데이터 처리 및 구조 분석에 기여하는 연구자와 학생을 수있는 방식으로 설계되었습니다.

Cryo - 전자 Tomography 및 자동 하위 tomogram 평균을 사용하여 HIV의 봉투 Glycoproteins의 분자 구조 결정

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

학습하세요 H5N1 및 H7N9 인플루엔자 바이러스의 당단백질을 이용한 고적퇴력 감염성 슈도타입 입자 생산 방법을. qRT-PCR 정량화와 세포 형태학 평가를 통해 바이러스 감염력을 분석하고, BSL-2 환경에서 안전하게 연구할 수 있습니다.

고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산

더 많은 동영상 탐색