고병원성 H5N1 및 조류 H7N9 바이러스의 엔벨로프 당단백질을 가진 고적퇴력 감염성 인플루엔자 슈도타입 입자 의 생산
2020년 1월 15일
이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.
인플루엔자 바이러스 PP를 생산하고 감염성을 결정하는이 기술은 BSL-2 도시에서 인플루엔자 바이러스의 연구를 단순화 할 수 있습니다. 우리는 PPS의 qRT-PCR 데이터를 기반으로 감염에 대한 조달청을 정상화했습니다. 2개의 당단백질 발현 플라스미드는 인코딩되어 바이러스 재구에 대한 연구를 단순화할 수 있습니다.
세포 씨를 뿌린 지 하루 후, 반전된 광 현미경으로 세포 형태와 밀도를 확인하십시오. 이상적으로 세포는 경질에서 대략 85% 응수되어야 합니다. 매체를 음편당 세럼이 없는 DMEM 1밀리리터로 교체하고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
각 웰의 세포에 대해, 경질 시약의 8마이크로리터를 혈청 배지를 감소시 150 마이크로리터의 부피에 희석시. 용액을 부드럽게 섞고 실온에 5분간 앉게 하십시오. 한편, 2.5 마이크로그램의 플라스미드 DNA를 158마이크로리터의 혈청 배지로 희석한다.
5 분 인큐베이션 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 검사 시약과 결합하고 용액을 부드럽게 혼합하고 실온에서 15 분 동안 둡니다. 혈청이 없는 배지의 세포와 함께 해당 우물에 DNA 지질 복합체를 추가합니다. 그런 다음 앞뒤로 흔들어 서 접시를 부드럽게 섞습니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4~6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 매체를 제거하고 잘 당 DMEM의 두 밀리리터로 대체합니다. 그런 다음 36 ~48 시간 동안 다시 배양하십시오.
잘 당 10, 000 세포와 96 웰 플레이트에 취약 셀의 각 유형을 시드. 그런 다음 밤에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%로 둡니다. 형질 전환 후 셋째 날에는 분홍색 또는 약간 주황색으로 밝은 매체의 색상을 확인하고 440 ~ 460 나노미터 파장 아래 반전 된 플로레스센트 생물학적 현미경으로 세포를 검사하십시오.
트랜스펙트 후 38내지 48시간 후에, 0.45 마이크로미터 폴리비닐리덴 불소 막 필터를 통과하여 슈오타이핑 입자 또는 PPS를 수확하여 세포 이물질을 제거한 다음 소량의 알리코크로 나누어 섭씨 80도를 뺀 값으로 보관하십시오. 조달청을 정량화하기 위해 정제된 바이러스 입자30마이크로리터를 1.5 마이크로리터 RNase 프리 튜브로 옮기고 벤조나제 뉴클레아제 1마이크로리터를 첨가한다. DNA및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C의 튜브를 배양합니다.
인큐베이션 후, 시료를 영하 70도까지 동결하여 핵을 활성화하고 단백질을 30분 동안 2마이크로리터의 단백질을 첨가하여 봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출한다. 그런 다음 3 분 동안 섭씨 100도에서 단백질 Ae K를 비활성. 텍스트 원고에 지정된 프라이머 및 프로브에서 유니버설 프로브 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용하여 정량적 역전사 RTPCR로 PPS를 정량화합니다.
MMLiter 당 4 회 10 ~ 5 번째 RNA 복사본으로 PPS를 정상화합니다. 그런 다음 H7N9 헤마글루티닌을 수용하는 PPS에 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도에 TPCK-트립신을 추가합니다. 기능하위유닛 HA1 및 HA2를 형성하기 위해 1시간 동안 PPS를 섭씨 37도에서 배양한다.
정규화된 PPS를 DMEM 배지와 1 대 1 비율로 혼합한 다음 취약한 세포를 포함하는 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 가져옵니다. 수퍼네티드를 흡인하고 100 마이크로리터의 미리 데운 PBS로 세포를 한 번 씻으세요. 각 우물에 PPS-DMEM 혼합물 100 마이크로리터를 추가하여 각 PPS 유형의 감염성 테스트를 하나의 취약한 세포주로 세팅합니다.
플레이트를 섭씨 37도에서 4~6시간, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 그런 다음 슈퍼나탄을 흡인하고 감염성 검출 전에 24~36시간 동안 플레이트를 배양하는 DCM 의 마이크로리터 100마이크로리터로 교체한다. 우리의 결과는 PPS는 지금 사람들에게 전염성이 있는 것으로 간주됩니다.
그래서 필요한 안전 가드 절차는 마스크를 착용하고 생물 안전 캐비닛에 감염성 검사를 수행하는 등의 작업을 수행하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 2개의 그룹화된 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 성혈구 스토마티스 바이러스 G 당단백질 또는 봉투 당단백질없음을 가진 10가지 유형의 의사형 입자 또는 PPS를 생성하기 위해 생성되었다. 조달청은 전염 전자 현미경으로 심화되었고 그들의 감염성은 두 개의 세포주, A549 및 MDCK에서 평가되었다.
H5를 수용하는 조달국 군에서는 H5N1, H5 플러스 N9 및 H5의 감염성은 세포주 A549 및 40%5%와 5%의 약 90%와 10%였다. H7을 수용하는 조달군에서는 H7N9, H7 플러스 N1 및 H7의 감염성은 셀주 A549 및 8%4%와 1%로 각각 약 10%7% 및 1%였다. 성구 구내염 바이러스 G 당단백질 PP의 감염성은 A549의 경우 약 21%, MDCK 세포의 경우 16%였다.
델타 봉투 당단백질 PP는 감염성을 나타내지 않았다. PP 생산업체 HEK-293T/17 세포가 이 절차의 기초에 해당한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 최적의 성장이 HEK-293T/17 세포를 가르치는 것이 가장 중요합니다.
이 절차 또는 L2와 같은 다른 테스트에 따라 경계 분석이 수행 될 수 있습니다. 이 분석체는 수용체 선호도의 생물학적 특수성을 거의 제거할 수 있으며 패턴은 PPS의 트로피주의를 드러낼 것이다. 그들은 인플루엔자 바이러스에서 당단백질을 했다 이후 두 플러스 최대로 복제.
HA와 NA 단백질은 별도로 연구할 수 있으므로 그(것)들 사이 를 재분류합니다. 돌연변이와 성숙한 효과를 탐구 할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 두 가지 인플루엔자 A 균주의 외피 글리코프로테인을 사용하여 고농도 감염성 바이러스 의사 입자(pp)를 생산하는 방법을 설명합니다. 또한 감염성 평가 방법도 설명하여 다른 외피 바이러스에 적용할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 바이러스학
- 감염병
- 바이러스 유전학
배경
- 바이러스 의사 입자(pp)의 생산은 바이러스 감염성 연구에 매우 중요합니다.
- 이 기술은 BSL-2 실험실 환경에서 수행할 수 있습니다.
- 이러한 입자의 감염성을 이해하는 것은 인플루엔자 바이러스 연구에 도움이 됩니다.
- 글리코프로테인 발현 플라스미드는 바이러스 재배열 연구를 용이하게 합니다.
연구 목적
- 감염성 바이러스 의사 입자를 생성하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발합니다.
- qRT-PCR 데이터를 사용하여 이러한 입자의 감염성을 평가합니다.
- 다른 외피 바이러스에 적용할 수 있는 프로토콜을 제공합니다.
사용된 방법
- 세포 시드와 역광학 현미경 하의 형태 평가.
- 글리코프로테인 발현 플라스미드를 사용한 세포 형질주입.
- 최적 조건을 위한 혈청 없는 DMEM으로 배지 교체.
- qRT-PCR 기반의 감염을 위한 의사 입자의 정규화.
주요 결과
- 고농도 감염성 바이러스 의사 입자의 성공적인 생산.
- qRT-PCR 분석을 통한 입자의 감염성 입증.
- 다른 외피 바이러스에 대한 프로토콜 적용 가능성 확인.
- 형질주입을 위한 세포 형태와 밀도가 최적임.
결론
- 이 프로토콜은 인플루엔자 바이러스 감염성 연구를 위한 간소화된 접근 방법을 제공합니다.
- 글리코프로테인 조작을 통한 바이러스 재배열 탐구를 가능하게 합니다.
- 이 방법은 다양한 외피 바이러스에 적용 가능하여 바이러스학 연구를 향상시킵니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This protocol enables safe, BSL-2-compatible study of highly pathogenic influenza envelope glycoproteins, supporting target validation and mechanistic de-risking in antiviral and vaccine development. By generating infectious pseudotyped particles with H5N1 and H7N9 HA/NA proteins, researchers can assess receptor tropism, neutralizing antibody efficacy, and reassortment potential without handling live virions. The system provides quantitative infectivity readouts via qRT-PCR, facilitating predictive confidence in early-stage therapeutic screening and lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional analysis of HA and NA glycoproteins as therapeutic targets for neutralizing antibody screening.
- Operational Value: Supports reassortment studies by allowing independent variation of HA and NA combinations to predict emergent strain risks.
- Predictive Value: Quantifies infectivity across cell lines (A549, MDCK) to model tropism and cross-species transmission potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces normalized, quantifiable pseudotyped particles via RT-qPCR for consistent infectivity testing across experimental conditions.
- Reproducibility: Standardizes particle production and normalization to 4×10⁵ RNA copies/mL, enabling reliable comparison of glycoprotein variants.
- Scalability: Compatible with 96-well formats and triplicate testing, supporting medium-throughput screening of inhibitors or immune sera.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses glycoproteins from zoonotic H5N1 and H7N9 strains to model pandemic-threat viruses in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage glycoprotein characterization with preclinical evaluation of vaccine candidates or entry inhibitors.
- Risk Mitigation: Allows de-risking of antigenic drift or shift variants by testing mismatched HA/NA combinations under controlled conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through glycoprotein functional assays and informing lead identification by quantifying neutralization susceptibility. It enables assay development for antiviral screening by providing a reproducible, BSL-2-safe proxy for viral entry. The workflow integrates with downstream analytics via qRT-PCR quantification and infectivity scoring, enhancing data consistency across discovery and preclinical teams.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on receptor binding, fusion efficiency, and glycoprotein reassortment impacts on infectivity.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable pseudotyped particles for evaluating entry inhibitors or neutralizing antibodies in a high-confidence format.
- Analytics: Generates qRT-PCR-based RNA copy normalization and infectivity percentages, enabling statistical comparison of glycoprotein variants.
- Translational Research: Connects HA/NA functional data to preclinical model selection by defining tropism and cross-reactivity profiles.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability allows reuse across enveloped virus studies, reducing redevelopment costs for future pandemic preparedness programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in influenza entry studies by isolating HA and NA contributions to infectivity.
- Operational Value: Enables BSL-2 workflows for high-risk glycoproteins, improving lab safety and throughput.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions on antiviral or vaccine candidates by predicting neutralization escape via reassortment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on quantified infectivity and antibody sensitivity across glycoprotein variants.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and biosafety practices for pseudotyped particle handling.
- Dependent on qRT-PCR infrastructure and RNase-free workflows for accurate particle quantification and normalization.
- Necessitates standardization of trypsin activation for H7N9 HA cleavage to ensure functional subunit formation.
- Involves optimization across cell lines (e.g., A549, MDCK) to capture differential tropism of glycoprotein pseudotypes.
- Limited to envelope glycoprotein studies; does not replicate full viral lifecycle or intracellular replication stages.
