Name: 안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 학습하세요 DMD 근육 조직 표준화된 처리 방법과 엑슨 건너뛰기 기술을 활용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험의 효율 분석 방법입니다. 이 기술은 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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사이토 다카시 박사, 나가타 데츠야 박사, 마스다 사토시, 다케시타 에리 박사님의 과학적 토론에 감사드립니다.

<ol><li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy%2C+part+2%3A+implementation+of+multidisciplinary+care%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li>
<li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li>
<li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li>
<li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients%3A+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li>
<li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug%3A+Implications+for+FDA+Policy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li>
<li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065%2FNCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li>
<li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+%28Pre-%29Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).</li>
<li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).</li>
</ol>

DMD의 임상 시험은 지난 몇 년 동안 성공과 실패를 모두 생산했습니다. RT-PCR과 서부 블로팅은 환자에게 투여되는 엑슨 건너뛰는 화합물에 의해 생성된 건너뛰는 효율을 평가하는 일반적인 기술이다. 그러나 RT-PCR은 디지털 PCR15에비해 건너뛰는 효율을 과대 평가한 것으로 보고되었다. 이것은 여러 가지 이유로 인해 발생하지만, 주로 PCR 주기 동안 작은 건너 뛴 조각의 보다 효율적인 증폭에 의해 발생합니다. 이 임상 시험에 사용된 RT-PCR도 서양 블로팅에 의해 추정된 단백질 발현에 비해 더 높은 건너뛰는 효율성을 생성한 것으로 보인다. FDA에 따르면, 이것은 dystrophin 복원을 정량화하는 더 신뢰할 수있는 방법입니다12. 따라서 RT-PCR 건너뛰기 결과를 해석할 때주의해야 합니다. 그러나 샘플은 여전히 비교할 수 있습니다. RT-PCR 결과에 근거를 둔 더 높은 건너뛰는 효율성을 보여주는 견본은 일반적으로 서쪽 blot 분석에서 더 높은 단백질 발현 수준을 exhbit.
DMD 임상 시험에 있는 모든 환자는 동일 삭제 패턴을 가지고 있지 않기 때문에, 모든 견본에 디지털 또는 qPCR를 능력을 발휘하기 위하여 적당하게 특정한 프라이머 및 프로브를 디자인하기 어려울 수 있습니다. 따라서 RT-PCR은 여전히 건너뛰는 효율성에 대한 첫 번째 평가를 위한 좋은 대안입니다. NS-065/NCNP-01의 임상 시험이 시작되기 전에 근육이나 피부 생검이 환자 별 근막을 생성하는 것이 필수적이었기 때문에 체외내의 각 환자에 대한 건너뛰는 효율을 평가하는 것은 지루했습니다. 그러나, 최근에는 새로운 DMD 근육세포모델로서환자특이적 MYOD1 변환, 소변 유래 세포(UDCs)를 생성하는 새로운 기술을 최근에 발표했다. 따라서, 환자로부터 수집된 소변만 근막을 생성하기 위해 필요하며, 침습적 절차가 필요하지 않다. 우리는 이 방법이 환자 특정 세포에 있는 다른 AON을 스크린하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 믿습니다. 더욱이, 환자가 어떤 임상 시험을 시작하기 전에 다른 프라이머와 프로브는 시험될 수 있습니다. 이를 통해 향후 DMD 임상 시험에서 엑슨 건너뛰기 측정을 위한 qPCR 또는 디지털 PCR사용을 용이하게 할 수 있다.
이 임상 시험에서 서양 얼룩 분석을 수행하기 위해, dystrophin에 대하여 단 하나 항체가 이용되고, 단지 하나의 건강한 통제가 참조 견본으로 이용되었습니다. 따라서, 항체의 특이성은 적절히 검증되지 않았다. 이것은, 항체가 dystrophin의 C-말단 도메인을 인식한다는 사실과 더불어, 프로토콜의 한계입니다. dystrophin 분자의 다른 도메인에 대하여 더 건강한 통제 및 항체는 미래에 추천합니다.
여기에서, 우리는 NS-065/NCNP-01의 최근 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 사용된 프로토콜을 요약했습니다. NS-065/NCNP-01은 DMD 환자의 10.1%에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.

두첸 근이영양증(DMD)은 근육량, 호흡부전 및 심근병증의 점진적 손실을 유발하는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망1을이끈다. 이 질병은 큰 구조 근육 단백질 디스트로핀2의부족에 의해 발생합니다. X 염색체에 DMD 유전자에 있는 돌연변이는 열적이고, 질병은 3500-5000의 새로운 태어난 남성3,,4,,5에있는 1에 영향을 미칩니다. 돌연변이는 종종 엑소톤 44와 55 사이의 핫스팟 영역에서 큰 삭제로 인해 왜곡된 판독 프레임과 조기 정지 코돈으로 이어지며, 이는 말도 안되는 매개 부패와 거의 총 결여된 디스트로핀 단백질6,,7,,8을유발한다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기및 판독 프레임을 복원유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있으며, 부분적으로 디스트로핀 발현을 복원하고 질병 진행을지연9,,10,,11. 최근 연방약국(FDA)의 승인을 받은 모르폴리노 AON eteplirsen은 엑슨 51의 건너뛰기를 유도하고, 엑슨 52절,,13을가진 환자에서 판독 프레임을 복원할 수 있다.12 그러나, 엑슨(53)은 엑슨 52삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하고, 잠재적으로 DMD 환자14의약 10%를 치료할 수 있다. 모폴리노 AON 약물 NS-065/NCNP-01은 인간 세포에서 엑슨 53 건너뛰기를 유도하는 것으로 나타났다. 그리고 우리는 최근 1상 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험 (이하 "연구"로 지칭) (UMIN으로 등록 된 1 단계 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험에서 DMD 환자에게 NS-065 /NCNP-01을 투여하였다: 000010964 및 ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. 연구 결과는 서쪽 블로팅에 근거를 둔 RT-PCR 및 dystrophin 단백질 수준에 근거를 둔 엑슨 53 건너뛰기의 복용량 의존적인 증가를 보여주었습니다, 아니 가혹한 불리한 약 사건 또는 중퇴는 관찰되지 않았습니다14.
모든 임상 시험에서, 결과의 분석은 가장 중요 합니다. DMD 임상 시험에 대 한, 논쟁은 여전히 치료 혜택을 보여주는 최고의 방법에 관한 진행. 6 분 도보 테스트와 같은 임상 테스트에는 특정 단점이 있습니다. dystrophin 발현의 분자 특성화는 RT-PCR, qPCR, 디지털 PCR, 서부 블로팅 및 면역 작용과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 임상 혜택을 부여 하는 데 필요한 단백질 발현 복원의 정도 불분명 남아. 본 방법 문서에서는, AON 건너뛰기 약물 NS-065/NCNP-0114의1상 시험에서 각각 엑슨 건너뛰기 및 단백질 수준을 결정하는 데 사용되는 RT-PCR 및 서부 블로팅 방법을 자세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA 사다리</td><td>Takara</td><td>3407A</td><td>마커 솔루션, MultiNA</td></tr><tr><td>1mol / l-Tris-HCl 버퍼 솔루션 (pH 7.6)</td><td>Nacalai</td><td>35436-01</td><td></td></tr><tr><td>2- 메르 캅토 에탄올</td><td>Nacalai</td><td>21418-42</td><td></td></tr><tr><td>2- 메틸 부탄 (이소 펜탄)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>15-2220</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6&타임스; 로딩 버퍼</td><td>Takara</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ME</td><td>Iwai chemical</td><td>50013R</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 3730 DNA 분석기</td><td>Applied Biosystems</td><td>A41046</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 사이클 시퀀싱 키트</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr>, <tr><td>Bromophenol blue</td>, <td>Nacalai</td><td>05808-61</td><td></td></tr>, <tr><td>Centri-Sep 96-Well Plates</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367819</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Blocking Reagent</td><td>GE healthcare</td><td>RPN418</td><td></td></tr><tr><td>ECL 프라임 웨스턴 블로팅 검출 시약</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>GeneTools</td><td>2922498000</td><td></td></tr><tr><td>Experion 자동 전기영동 스테이션</td><td>Bio-Rad</td><td>7007010</td><td>마이크로칩 전기영동 시스템 10</td></tr>칩<tr><td>용 Experion DNA 1K 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>7007107JA</td><td></td></tr><tr><td>Experion 프라이밍 스테이션</td><td>Bio-Rad</td><td>7007030</td><td></td></tr><tr><td>Experion Vortex Station II</td><td>Bio-Rad</td><td>7007043</td><td></td></tr><tr><td>Extra Thick Blot Filter Paper</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>EzBlot</td><td>Atto</td><td>AE-1460</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 핵산 젤 스테인</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>이와키</td><td>1880 SV20</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Nacalai</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Histofine Simple Stain MAX PO</td><td>Nichirei</td><td>424151</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Transfer Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>ITS 액체 매체 보충제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 투명 접착 필름</td><td>적용 Biosystems</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>SHIMADZU</td><td>MCE-202</td><td>마이크로칩 전기영동 시스템 B</td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td>mlp9601</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계 Wi-Fi Thermo</td><td>Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM 동결건조 마우스 단클론 항체 디스트로핀(C-말단)</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-DYS2</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM 동결건조 마우스 단클론 항체 Spectrin</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-SPEC1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels</td><td>Invitrogen</td><td>EA03785BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 샘플 완충</td>액 <td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Sample Reducing Agent</td><td>Invitrogen</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>Oriole Fluorescent Gel Stain</td><td>Bio-Rad</td><td>1610496</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 용액 안정화</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Physcotron 핸디 마이크로 균질화기 MICROTEC</td><td></td><td>NS-310E3</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레인 감염/형질주입 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드 염색 용액</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN OneStep RT-PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 섬유 조직 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74704</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Nacalai</td><td>31606-75</td><td></td></tr><tr><td>반건조 전사</td>기 <td>Bio Craft</td><td>41-1293</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>for MultiNA</td></tr><tr><td>TAE Buffer</td><td>Nacalai</td><td>35430-61</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Gum</td><td>Wako</td><td>200-02245</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA 완충액</td><td>Nippon Gene</td><td>316-90025</td><td>for MultiNA</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai</td><td>35907-15</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel 및 PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock 미니 셀</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 dmd 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Duchenne 근 이영양증 (DMD)은 근육 질량의 점진적 인 손실을 일으키는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망으로 이어집니다. 돌연변이는 수시로 dystrophin 단백질의 거의 총 부족귀착되는 왜곡된 독서 프레임 및 조기 정지 코돈귀착됩니다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기를 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있다. 모르폴리노 AON viltolarsen (코드 이름: NS-065/NCNP-01)는 엑슨 53 건너뛰기를 유도하여 엑슨 52 삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하는 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 NS-065/NCNP-01의 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 DMD 환자에게 정맥으로 관리했습니다. 이 방법 문서에서는, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 발현의 분자 특성화를 제시합니다. dystrophin 발현의 특성화는 기능성 결과 시험이 수행되지 않았기 때문에 효능을 보여주는 연구에서 기본이었습니다.

RT-PCR을 사용하여 엑슨 건너뛰기를 감지하려면, 건너뛰게 될 엑슨의 양쪽에 프라이머가 특정 밴드만 산출하도록 설계 및 평가되었습니다(엑슨 건너뛰기 및 프라이머 위치의 회로도 2 참조). 프라이머는 MCE를 사용할 수 없는 경우 MCE 시스템 또는 일반 아가로즈 젤 전기포에 크기로 쉽게 구별할 수 있는 제품을 생성해야 합니다. 도 3는a 용량 에스컬레이션 단계 1 시험에서 NS-065/NCNP-01을 치료 전후한 환자 NS-03 및 NS-07로부터 건너뛴 밴드의 RT-PCR 반응 및 시퀀싱 결과의 MCE 시스템 A 겔 영상을 나타낸다. NS-03 및 NS-07 항만 삭제는 각각 45-52 및 48-52에 걸쳐 있습니다. NS-03받은 5 mg/kg 및 NS-07 20 MG/kg NS-065/NCNP-01 주간 12 주 동안. 치료 전에 예상대로, 두 환자는 건너 뛰지 않는 것으로 나타났으며, 건너 뛴 밴드만 시각화할 수 있었습니다. 치료 12 주 후, NS-07에 대한 명확한 건너 뛴 낮은 밴드를 시각화했다. 그러나 환자 NS-03을 위해 건너뛴 제품을 감지하는 것은 여전히 어려웠습니다. 시퀀싱 결과는 NS-07에 대한 엑슨 47 및 54뿐만 아니라 NS-03에 대한 엑슨 44 및 54의 연결을 보여 주었다. 서열에 따르면, 이들은 이론적으로 기능적이지만 단축 된 dystrophin isoform을 생성 할 수 있습니다. 도 3b에표시된 건너뛰는 백분율을 계산하기 위해 건너뛴 대역에 대한 어금음 농도는 건너뛰고 건너뛰지 않은 대역으로 나뉘었다. 환자 NS-07의 경우, 치료 후 비율은 72%였으며 NS-03의 경우 3.4%였습니다. 환자 NS-03, NS-07 및 건강한 대조군으로부터의 서양 얼룩 데이터(triplicate)는 도 4에a도시된다. 예상대로, 치료 전에 디스트로핀 밴드가 검출되지 않았습니다. 치료 후 환자 NS-07로부터의 대역은 건강한 대조군(야생형 디스트로핀은 427kDa의 분자량을 가지며, NS-07 디스트로핀은 389kDa의 분자량을 가지고 있음)에 비해 저분자로 검출되었다. 엑슨 삭제 및 건너뛰기 때문에 환자 NS-07의 dystrophin isoform에는 여러 개의 엑슨이 부족했으며 분자량이 낮아질 것으로 예상되었습니다. 환자 NS-03 치료 후 dystrophin의 검출 수준을 보여주지 않았다. 도 4b에서,환자 NS-07에 대한 건강한 대조군과 비교하여 디스트로핀의 양이 나타난다. 디스트로핀 복원 계산을 위해 신호 강도가 측정된 위치는 파란색 사각형으로 표시됩니다. 디스트로핀 스펙트럼 비율은 건강한 대조군의 양에 비해 디스트로핀의 양을 계산하는 데 사용되었습니다. 이를 위해, 디스트로핀 마이너스 배경으로부터의 신호는 두 스펙트린 아이소폼(길고 짧음) 마이너스 배경의 합으로 나뉘었다(8.6.5단계 참조). 건강한 대조군 비율은 100%로 설정되었습니다. 치료 후 환자 NS-07의 건강한 대조군과 비교하여 디스트로핀의 양은 9.1%였다. 그러나, 백분율은 약한 dystrophin 밴드 때문에 환자 NS-03를 위해 계산될 수 없었습니다, 이는 두 환자에 대한 이전 처리 견본을 위해 얻은 것과 유사합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> 그림 1: 서부 얼룩 분석을 위한 전송 스택의 회로도. 하단에 블로팅 버퍼 A에 담근 블로팅 종이가 있는 서쪽 블롯 전달 스택의 어셈블리는 블로팅 버퍼 B, PVDF 멤브레인, 3-8% Tris-Acetate Gel 및 블로팅 버퍼 C에 담근 상위 2개의 블로팅 용지에 담근 종이를 블로팅하는 것으로 나타났다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> 그림 2: DMD 유전자에서 엑슨 45-52 삭제를 가진 환자에서 엑슨 53의 엑슨 건너뛰기의 회로도 도면. 예를 들어, 투여량 에스컬레이션 임상 시험에서 환자 NS-03은 이러한 삭제를 하였다. 엑슨(53)이 유지되면, mRNA는 엑슨(44)과 53사이의 엑슨-엑슨 접합이 판독 프레임을 방해하여 엑슨 53에서 스톱 코돈이 생기기 때문에 프레임이 꺼질 것이다. 디폰(53)을 건너뛰면 판독 프레임이 복원되고, 디스트로핀의 짧은 등산체가 생성됩니다. RT-PCR에 의해 엑슨 53 건너뛰기를 감지하기 위해, 엑슨 44 및 54의 프라이머가 사용되어 건너 뛰고 건너뛰지 않은 mRNA 사이의 PCR 생성물을 쉽게 감지할 수 있습니다. FWD: 포워드 프라이머, REV: 역 프라이머, PMO: 인포로디아타테 모르폴리노 올리고머. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> 그림 3: 티비알리스 전방 근육 생검 샘플에서 환자 NS-03 및 NS-07을 위한 효율성을 건너뛰는 것입니다. a)환자 NS-03 및 NS-07로부터 치료되지 않은 및 처리된 샘플의 RT-PCR 샘플의 전기전경 시스템에 의해 생성된 젤 영상. 상부 패널은 삼중 패널에서 NS-03 및 하부 패널 NS-07을 보여줍니다. NS-03의 경우 건너뛴 대역은 422bp이고 건너뛴 대역은 212bp입니다. NS-07의 경우 밴드는 각각 836bp및 624bp입니다. 서열 분석은 NS-03및 엑슨(47)에 대한 엑슨(44)과 엑슨(54)의 합의를 NS-07에 대해 54로 나타났다. b)환자 NS-03 및 NS-07환자에 대한 검사 의 전과 후의 효율을 건너뛰는 것은 시스템 A가 건너뛰는 밴드/(건너뛴 대역+건너뛴 대역) x 100으로 시스템 A에서 제공하는 어금니 농도로부터 계산된다. NS-03에 대한 건너뛰는 효율은 치료 후 매우 낮았습니다. NS-07의 경우 건너뛰는 효율이 70% 이상이었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> 그림 4: 엑슨 건너뛰기 치료 전후에 Dystrophin isoforms의 단백질 정량화. a)엑슨 건너뛰기 치료 전후에 디스트로핀 이소폼의 단백질 정량화. 환자 NS-03 및 NS-07 환자에서 티비알리스 전방에서 근육 생검의 서쪽 얼룩 치료 전후 및 삼중에서 건강 한 제어에서. Dystrophin은 건강한 제어를 위한 427 kDa에서 볼 수 있고 치료 후 NS-07에 대한 389 kDa에서 볼 수 있습니다. 치료 전에 환자를 위해 어떤 dystrophin도 검출될 수 없습니다, 또는 어느 쪽도 환자 NS-03를 위한 처리 후에 검출될 수 없었습니다. 블랙박스의 영역은 그림 4b에표시됩니다. 각 블롯의 왼쪽에 마커가 표시됩니다. b)환자 NS-07에 대한 치료 후 복원 된 dystrophin의 양. Dystrophin 복원은 소화식에 따라 디스스트로핀, 배경 및 스펙트럼의 길고 짧은 등색체에 대한 밴드의 강도를 기반으로 계산되었습니다: (dystrophin - 배경)/(스펙트럼 L-배경) + (스펙트린 S - 배경) 건강한 제어를위한 비율이 100 %로 설정되어 있습니다. 각 밴드의 강도는 그림에 표시된 파란색 상자 내부로 측정되었다. NS-07의 디스트로핀 복원은 치료 후 9.1%였다. 디스트로핀 신호는 처리되지 않은 샘플에서 측정하기에너무 약했습니다. 마커 크기는 킬로달톤으로 표시됩니다. Dystrophin, BG: 배경, SL: 스펙트린 긴 동소형, SS: 스펙트린 짧은 동소형태, 내: Myosin 타입 1. 마커 크기는 킬로달톤으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>솔루션</td>
			<td>부피/반응(μl)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 가 없는 물(제공)</td>
			<td>변수</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5x QIAGEN 원스텝 RT-PCR 버퍼</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP 믹스(각 dNTP의 10mM 포함)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>각 dNTP의 400 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>포워드 프라이머 (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>역프라이머 (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN 원스텝 RT-PCR 효소 믹스</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 억제제 (선택 사항)</td>
			<td>변수</td>
			<td>5-10 단위/반응</td>
		</tr>
<tr>
<td>템플릿 RNA</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: RT-PCR 시약. RT-PCR의 한 반응에 필요한 화합물.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>뇌관</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>44F</td>
			<td>5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>46F</td>
			<td>5'-AACCTGGAAAAAA가카가카가카가-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>48F</td>
			<td>5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCGCTCACTCCTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R</td>
			<td>5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 프라이머 목록입니다. 이 연구에서 사용되는 프라이머에 대한 시퀀스. F: 앞으로, R: 역.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 주기</td>
			<td>역전사</td>
			<td>30분</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 주기</td>
			<td>초기 PCR 활성화 단계</td>
			<td>약 15분</td>
			<td>95°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35사이클</td>
			<td>변성</td>
			<td>1분</td>
			<td>94°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>어 닐 링</td>
			<td>1분</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>확장</td>
			<td>1분</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 주기</td>
			<td>최종 확장</td>
			<td>7분</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>개최</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: PCR 컨디셔닝 된 사용. RT-PCR 반응에 대한 PCR 조건을 표시합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>솔루션</td>
			<td>부피/반응(μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase 가 없는 물</td>
			<td>변수</td>
		</tr>
<tr>
<td>빅디 터미네이터 3.1 준비 반응 믹스</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>포워드 프라이머/리버스 프라이머(3.2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>템플릿 RNA</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>총</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4: 시퀀싱 반응에 필요한 시약입니다. 둘 다 동시에 설정에서 앞으로 또는 역 프라이머를 사용합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>1 주기</td>
			<td>1분</td>
			<td>96°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 사이클</td>
			<td>10 s</td>
			<td>96°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 s</td>
			<td>50 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4분</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>개최</td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>표 5: Sanger 시퀀싱을 위한 PCR 조건입니다.

여기서, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 38 발현의 분자 특성화를 제시합니다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

이 프로토콜은 임상 전 설정 및 임상 시험에서 근육 조직을 준비하고 처리하기위한 표준화 된 방법론을 제공하며, 이는 DMD 분야 내에서 신뢰할 수있는 결과를 얻는 데 중요합니다. 이 기술은 DMD에 대한 엑슨 건너뛰기 트라이아웃과 관련이 있습니다. 그리고 주요 장점은, 그들은 잘 설립되고 집단적으로 수행하면 재현 할 수 있다는 것입니다.이러한 기술은 주로 DMD에서 엑슨 건너뛰기에 초점을 맞추고 있지만 프라이머의 변화로 접합 치료로 치료받는 다른 질병에 동일한 기술을 적용 할 수 있습니다. 이러한 방법은 RNA와 단백질 모두 엑슨 건너뛰기 효율을 달성하는 데 사용될 수 있다. 분석을 위해 샘플을 준비하려면 먼저 잇몸이 부드럽고 끈적거리게 될 때까지 동일한 양의 트라가칸스 껌과 물을 섞습니다.이 혼합물을 25 밀리리터 주사기에 적재하고 개별 코르크 디스크에 잇몸의 0.5~1센티미터를 분배합니다. 반대쪽에 디스크를 라벨과 액체의 일부가 동결 될 때까지 액체 질소에 isopentane의 용기를 배치합니다. 각 표본을 코르크에 수직으로 각 근육의 세로 축을 사용하여 디스크의 tragacanth 껌에 넣습니다.각 근육의 바닥에 잇몸을 놓고 근육을 제자리에 고정시키고 핀셋을 사용하여 차가운 시편을 동결시 비춥시다펜탄을 고정하십시오. 시편을 1분 동안 또는 완전히 얼릴 때까지 계속 움직이면 일시적으로 드라이 아이스에 놓습니다. 그런 다음 시편을 유리 바이알에 넣고 섭씨 80도 보관합니다.분석을 위해 냉동 근육 조직을 단면하려면 극저온을 섭씨 25도의 작동 온도로 설정하고 근육 블록을 홀더에 장착합니다. 평평한 단면이 달성될 때까지 조직 블록을 다듬습니다. 역전사 PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 10 마이크로미터 두께의 슬라이스를 얻습니다.면역 조직 화학 적 분석을 위해, 6 ~ 8 마이크로 미터 두께의 조각을 얻고 헤마톡클린과 에오신 염색을 위해 10 ~ 12 마이크로 미터 두께의 조각을 얻습니다. 그들의 인수 후, 두 밀리 리터 튜브에 슬라이스 섹션을 배치합니다. PCR 및 서부 블로팅 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다.여기서, 마이크로칩 전기포고이스 시스템, 역실사 PCR 반응의 겔 이미지, 및 투여량 에스컬레이션 단계에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하기 전과 후에 두 환자로부터 건너뛴 밴드의 시퀀싱 결과가 1상 시험으로 나타났다. 두 환자 모두 삭제를 항구합니다. 예상대로, 치료 전에, 두 환자는 건너 뛰지 않았고 비 건너 뛴 밴드만 시각화 할 수 있었습니다.12주 간의 치료 후, 두 번째 환자를 위해 명확한 건너뛴 하반역이 시각화되었지만, 첫 번째 환자를 위해 건너뛴 제품을 감지하는 것은 여전히 어려웠습니다. 시퀀싱 결과는 제2 환자를 위한 엑슨 47 및 54의 연결, 그리고 exons, 44 및 54 첫번째 환자를 위한 연결을 보여주었습니다. 건너뛴 백분율을 계산하기 위해 건너뛴 대역의 어금니 농도는 건너뛰고 건너뛰지 않은 밴드로 나뉘었다.예상대로, 치료 전에 서양 얼룩에 의해 디스트로핀 밴드가 발견되지 않았습니다. 치료 후, 건강한 대조군에서 관찰된 것과 비교하여 분자량이 낮은 제2 환자로부터 밴드가 검출되었다. 첫 번째 환자, 그러나, 치료 후 dystrophin의 검출 가능한 수준을 보여주지 않았다.근육 조직을 올바르게 처리하고 각 표본을 tragacanth 껌에 일관된 방식으로 배치하는 것이 중요합니다. 조직 단면도는 PCR, 디지털 PCR, 서양 얼룩, 면역 조직 화학 및 다른 유형의 오믹스로 인공을 포함하여 여러 가지 방법으로 분석 될 수 있습니다. 이러한 기술은 다른 엑슨을 대상으로 하는 추가 엑슨 건너뛰기 약물을 가속화할 수 있으며, DMD에 대한 편집에서 바이러스 성 기반의 개발에 적용될 수 있다.

characterizing-exon-skipping-efficiency-dmd-patient-samples-clinical

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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