Name: 초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 배우세요 APEX2 태그를 이용한 막 단백질 국소화 방법으로, HEK293 세포에서 바이러스 복제 메커니즘을 연구합니다. 냉동고정 및 동치환 기술로 세포 미세구조를 보존하며 정밀한 단백질 위치 파악이 가능합니다.

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여기서 설명된 프로토콜은 세포 과학 저널, 132 (6), jcs222315 (2019)48에의한 간행물에서 유래한다. 이 작품은 인디애나 임상 및 번역 과학 연구소에서 건강의 국립 연구소에서 R01GM10092 (S.M.에) 및 AI081077 (R.V.S.) 보조금에 의해 지원됩니다, CTSI-106564 (S.M.에), 그리고 PI4D-209263 (S.M.에) 감염성 질환 연구소에서 감염성 연구소, 감염성 연구소.

1. 세포 배양 및 형질감염
<ol><li>종자 HEK-293T 세포는 직경 60 mm 또는 더 큰 조직 배양 접시에 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 60%-90% 합류로 성장한다.</li>
	<li>형질감염 시약을 사용하여 APEX2 태그가 달린 포유류 발현 플라스미드를 사용한 트랜스펙트 세포(재료 표참조)는 제조사의 지시에 따른다.</li>
	<li>12-15 시간 후 형질 감염에서, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세포를 한 번 씻어. PBS로 부드럽게 세척하여 접시에서 세포를 제거합니다. 트립신과 같은 해리 시약은 주어진 세포 유형에 필요한 경우 사용될 수 있다. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기를형성합니다.
</li>
</ol>2. 화학 적 고정 및 과산화아제 반응
<ol><li>상류를 조심스럽게 제거하고 실온에서 0.1 M 나트륨 카코디알산트 완충액, pH 7.4에서 2 % 글루타랄데히드 (v / v)의 2 mL에서 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 샘플을 얼음 위에 놓고 30 분 동안 배양합니다. 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 샘플을 펠렛. 이 시점부터 2.3.3 단계까지, 시료와 용액을 얼음 위에 유지하고, 4°C에서 원심분리를 수행한다. 주의: 글루타랄데히드와 카코디알산 나트륨 완충제(비소 함유)는 모두 독성이 있습니다. 취급 중에는 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용해야 합니다. 글루타랄데히드 및/또는 카코디알산나트륨 완충액을 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.</li>
	<li>0.1 M 나트륨 카코디산염 완충액의 2 mL로 펠릿 3x를 5 분 동안 씻습니다. 이러한 뿐만 아니라 후속 세안의 경우, 필요한 용액에 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단 한 다음 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리를 조심스럽게 제거하고 상한자를 제거하십시오. 시료 손실을 최소화하기 위해 반복펠릿 및 재서스펜션 단계로 주의를 기울여야 합니다.</li>
	<li>과산화아제 반응 수행<ol>
<li>0.1 M 나트륨 카코디알산염 완충액에 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로염화물(DAB)의 1 mg/mL을 함유한 신선한 용액을 준비합니다. 5-10 분 동안 격렬한 소용돌이로 DAB를 녹입니다. 주의: DAB는 독성이 있으며 발암 가능성이 있는 물질이며 적절한 안전 절차와 개인 보호 장비로 처리해야 합니다. DAB를 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 취급되어야 합니다.</li>
		<li>3 mL의 DAB 용액으로 다시 일시 중단한 다음 500 x g에서 5분 동안 펠릿을 세척합니다.</li>
		<li>과산화수소가 5.88 mM의 최종 농도를 달성하기 위해 첨가 된 3 mL DAB 용액에서 펠렛을 다시 일시 중단하십시오. 방 온도에서 30 분 동안 배양하십시오. 펠릿은 불용성 DAB 반응 생성물의 존재를 나타내는 눈에 띄게 갈색이 된다. 참고: DAB 인큐베이션 시간은 각 샘플에 대해 최적화되어야 할 수 있습니다. 색상 변화는 광 현미경에서 모니터링 할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 15-45 분 배양은 대부분의 단백질에 적합. 과산화수소는 갓 개봉 한 병 또는 개봉 후 잘 밀봉 된 병에서 얻어야합니다.</li>
		<li>펠렛 세포를, 0.1 M 나트륨 카코디산완충액으로 5분 동안 2x 세척한 다음, 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 또는 셀 배지에서 한 번 세척합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10% 태아 소 혈청 및 15% 소 혈청 알부민을 함유하는 DMEM(또는 다른 세포 매체)의 저온 보호용액의 500 μL에서 세포 펠릿을 다시 중단시켰다. 다시 펠릿, 두꺼운 저온 보호 용액에서 펠릿을 달성하기 위해 필요한 경우 500 x g에서 원심 분리 속도를 약간 증가시켰다. 상급의 대부분을 폐기, 펠릿이 건조되지 않도록 충분한 액체가 남아 있는지 확인. 셀 펠릿을 고압 동결 기기로 운반합니다.</li>
</ol>3. 고압 동결
<ol><li>고압 냉동고 저장소에 액체 질소(LN2)를채우고 펌프를 시작하여 샘플 챔버를 LN2로채웁니다. 주의: 액체 질소로 작업할 때적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오. 참고: 이러한 단계는 라이카 EMPACT2 고압 냉동고에만 해당됩니다.</li>
	<li>실험실 닦아 또는 종이 타월의 모서리를 사용하여 세포 펠릿에서 남아있는 액체를 멀리 심지. 충분한 액체는 펠릿이 치약과 일관성이 비슷한 페이스트를 형성한다는 것을 유지해야합니다. 20 μL 파이펫 팁으로 흡입될 수 있을 만큼 얇아야 합니다.</li>
	<li>세포 펠릿의 2-3 μL을 흡인하고 멤브레인 담체에 증착합니다. 표면 장력이 상단에 약간의 돔을 생성하지만, 액체가 우물에서 유출되지 않도록, 멤브레인 캐리어의 우물을 완전히 채웁니다. 기포가 없어야 합니다.</li>
	<li>멤브레인 캐리어를 카트리지에 밀어 넣고 고정합니다. 카트리지를 준비되고 프라이밍된 HPF 기계에 넣고 시작을 눌러 동결합니다.</li>
	<li>온도 대 시간 및 압력 대 시간 그래프를 검사하여 압력이 2100 bar에 도달하고 온도가 200 ms 내에서 -196 °C에 도달했는지 확인하고 두 매개 변수모두 600 ms 측정에 대해 안정적으로 유지되었는지 확인합니다.</li>
	<li>3.3 에서 3.5 단계는 세포 펠릿이 사용되거나 원하는 샘플 수가 동결 될 때까지 반복합니다.</li>
	<li>LN2에담근 카트리지를 보관하고 카트리지에서 각 멤브레인 캐리어를 제거하고 플라스틱 캡슐에 넣고 플라스틱 캡슐을 LN2로가득 찬 저온 바이알에 넣습니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지될 수 있습니다. 샘플이 있는 저온 바이알은 저온 지팡이 또는 저온 상자에 LN2 dewar에 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 동결 대체
주의: 액체 질소로 작업할 때적절한 안전 절차와 개인 보호 장비를 사용하십시오. 또한 4단계에서 사용되는 많은 화학 물질은 탄닌산, 테트옥사이드 오스뮴 및 우라닐 아세테이트를 포함한 독성이 있습니다. 이러한 화학물질은 적절한 안전 절차에 따라 취급되어야 하며 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
<ol><li>LN2로자동 동결 대체 장치를 채웁니다. 온도를 -90 °C로 가져옵니다.</li>
	<li>FS 믹스 1을 준비하고 FS를 시작합니다.<ol>
<li>화학 적 후드에서, 0.2 % 탄닌산 (w / v) 및 5 % DI 물 아세톤및 시료 당 1 mL의 용액을 저온 바이알로 준비하십시오. LN2에 넣고 얼리시면 됩니다.</li>
		<li>FS 믹스 1 바이알과 냉동 셀 펠릿을 포함하는 저온 바이알을 FS 장치의 샘플 챔버에 놓습니다. LN2 바이알로부터 멤브레인 담체를 함유하는 내부 캡슐을 FS Mix 1을 함유하는 상응하는 바이알내로 이송한다.</li>
		<li>첫 번째 단계는 -90°C에서 24시간인 FS 프로토콜을 시작합니다. 24시간 후, FS를 일시 중지하고, -90°C로 냉각된 아세톤으로 샘플을 3x 5분 동안 세척한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FS 믹스 2 를 준비하고 FS를 완료 주의: 오스뮴 테트옥사이드는 확립된 안전 프로토콜에 따라 훈련받은 사람만 처리해야 하는 매우 독성이 높고 산화되는 화학물질입니다. 오스뮴 함유 용액의 저장 및 폐기를 위한 프로토콜을 따라야 하며, 오스뮴 테트옥사이드가 사용 중인 실험실 영역의 라벨링을 따라야 합니다. 오스뮴 테트옥사이드는 눈 보호, 완전한 팔 보호 기능을 제공하는 실험실 코트, 이중 니트릴 장갑 및 선택적 호흡보호구를 포함한 개인 보호 장비가 있는 화학 후드에서 취급해야 합니다.<ol>
<li>화학 적 후드에서 1 % 오스뮴 테트 옥사이드, 0.2 % 우라일 아세테이트 및 5 % DI 물용액을 아세톤에 준비하십시오. 시료당 1 mL을 저온 바이알에 넣고 LN2에 넣어 동결시. 참고 : 탄닌산 (아세톤에 10 % w / v), 오스뮴 테트 옥사이드 (아세톤에서 10 % w / v) 및 우라닐 아세테이트 (메탄올8 % w / v)의 재고 용액은 FS Mixes의 준비를 용이하게하기 위해 LN2 dewar에서 저온 바이알에 준비및 보관 할 수 있습니다.</li>
		<li>FS Mix 2가 있는 저온 바이알을 FS 장치에 넣고 세 번째 아세톤 세척에서 캡슐을 FS Mix 2 바이알로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 넣습니다. FS 믹스 2에서 -90°C에서 72시간 동안 인큐베이션한 다음 12-18시간 동안 0°C로 점진적으로 온난화합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온도를 0°C로 유지하고 갓 개봉한 병에서 미리 냉각된 아세톤으로 30분간 30분간 세척합니다.</li>
</ol>5. 수지 침투 및 포함
주의: 여기에서 사용되는 수지는 중합 전에 독성이 있으며 적절한 안전 절차 및 개인 보호 장비로 취급해야 합니다. 중합되지 않은 수지는 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.
<ol><li>새로 개봉한 병에서 아세톤에 용해된 수지의 농도가 증가하여 시료에 침투합니다. 제조사의 지시에 따라 플라스틱 비커에 수지 성분 A, B 및 D를 혼합하여 제조하고, 0°C에서 각각 2시간 동안 2%, 4%, 8%의 수지 농도로 샘플을 배양한다. 실온에서 각각 4 시간 동안 15%, 30%, 60%, 90%, 100% 수지로 배양합니다. 성분 A, B, C 및 D의 혼합물에서 4 시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>셀 펠릿 측면이 있는 멤브레인 캐리어를 평평한 임베딩 금형에 넣고 수지(A, B, C 및 D)로 채웁니다. 시료에 대한 종이 라벨은 현재 웰에 추가할 수 있습니다.</li>
	<li>24-36 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 중합. 참고: 프로토콜은 중합 후 일시 중지될 수 있습니다.</li>
	<li>금형에서 블록을 제거하고 식힙니다. 멤브레인 담체를 제거하려면 먼저 샘플을 배율로 시각화 할 수있는 초미세 화의 수직 척에 넣습니다. 멤브레인 캐리어에 액체 질소를 두드리는 조합으로 멤브레인 담체로부터 멤브레인 담체를 분리하여 금속을 플라스틱으로부터 분리하고, 면도날을 사용하여 멤브레인 담체 주변의 수지들을 칩아웃한다. 분리될 때, 막 담체를 부드럽게 들어 올려 블록의 얼굴에 세포 펠릿 돔을 남깁니다.</li>
	<li>노출된 셀 펠릿이 첫 번째 금형보다 약간 깊은 평평한 임베딩 몰드에서 위쪽을 향하도록 블록을 놓고 수지로 채웁니다. 24-36 시간 동안 60 °C에서 중합. 참고: 프로토콜은 중합 후 일시 중지될 수 있습니다.</li>
</ol>6. 절편
<ol><li>면도날을 사용하여 셀 펠릿 주위의 블록을 다듬습니다. 그런 다음 블록을 샘플 척에 울트라 마이크로톤의 절편 암에 놓습니다. 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 블록을 세포 펠릿을 둘러싸고 있는 사다리꼴 모양으로 다듬습니다.</li>
	<li>유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 셀 펠릿의 90 nm 초박형 섹션을 가져옵니다.</li>
	<li>TEM 그리드에서 섹션 리본을 선택합니다. Formvar 코팅 구리 슬롯 그리드(1 x 2mm2 슬롯)는 직렬 섹션을 이미징하는 데 유용합니다. 필터 용지에 가장자리를 블로팅하여 그리드를 건조하고 TEM 그리드 저장 상자에 보관하십시오. 참고: 절편 후 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>7. TEM 이미징
<ol><li>TEM 홀더에 그리드를 장착하고 현미경으로 놓습니다. 우리는 정기적으로 냉동 APEX 샘플을 스크리닝80 kV에서 Tecnai T12를 사용합니다. APEX2 라벨링으로 관심 있는 세포 및 세포 외 구조의 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>원하는 경우, 리드 포스트 염색을 사용하여 추가적인 멤브레인 대비를 얻습니다. 얼룩이 없는 시료(그림2I-K)와 염색 후 염색 후 샘플을 비교하는 것은 그림 2를 참조하십시오(그림2A-H).<ol>
<li>희석염화나트륨 용액(~1.5mM)을 한 방울 떨어뜨리고, 각각 1분동안 2x, 10분 동안 1x를 플로트합니다.</li>
		<li>사토의 리드 용액 한 방울에 1 분 동안 그리드를 띄우고 염화 나트륨 용액에 3 x 를 1 분 동안 떠서 씻은 다음 DI 물 3 x에 1 분 동안 그리드에서 과도한 액체를 블롯하고 그리드 상자에 보관하십시오. 주의: 납은 독성 화학 물질이며 적절한 안전 절차 및 개인 보호 장비로 처리해야합니다. 납을 함유한 솔루션은 유해 화학 폐기물로 폐기해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM에 이미지 염색 후 샘플. 참고: TEM을 위한 전통적인 견본 준비에서는, 지도 대조 단계는 TEM 화상 진찰의 앞에 수행됩니다. 그러나 cryoAPEX 샘플의 경우 대비가 아닌 샘플에서 먼저 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 이렇게 하면 태그의 신호가 더 가볍게 염색된 세포 구조와 강한 대조를 이루면 쉽게 배치될 수 있습니다. 많은 샘플의 경우 더 이상 염색이 필요하지 않습니다. 그러나, 추가적인 멤브레인 대비가 필요한 경우, 리드 포스트 염색을 수행할 수 있다(Step 7.2) 및 샘플을 다시 이미지화한다.</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 cryoAPEX 프로토콜은 세포 환경 내에서 막 단백질의 국소화를 특성화하는 강력한 방법을 제공한다. 유전적으로 인코딩된 APEX2 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 정확한 국소화를 제공할 뿐만 아니라, 저온 탈수및 저온 탈수의 사용은 주변 세포 초구조체의 우수한 보존 및 염색을 제공합니다. 결합된, 이 접근은 그것의 세포내 문맥 내의 높은 정밀도로 단백질을 현지화하기 위한 강력한 공구입니다.
이 방법의 발전의 핵심은 전통적인 TEM 방법에 의한 제조 후 경험된 초구조체의 손실이 주로 고정단계(40)가아닌 탈수 단계로부터 온다는 사실이다. 그것은 이전에 과산화 아 제 기반 방법은 과산화 아 제 반응 전에 화학 적 고정을 필요로 하기 때문에 HPF/FS와 호환 되지 않은 것으로 생각 되었다. 이 것을 해결하기 위하여는, CryoCHEM에게 명명된 프로토콜은 견본이 처음에 동결되는, 재수화 및 과산화증 반응<sup class...

생물학 연구는 수시로 세포와 세포기관 내의 세포내 단백질 현지화를 해결의 질문을 포함합니다. 면역형광 현미경 검사법은 단백질 국소화의 유용한 저해상도 뷰를 제공하며, 최근 초고해상도 이미징의 발전은 형광태그단백질1,2,3에대한 해상도의 한계를 밀어내고 있다. 그러나, 전자 현미경 검사법 (EM)는 단백질의 표지가 도전이더라도, 고해상도 세포 초음파를 화상 진찰을 위한 금 본위제남아 있습니다.
역사적으로, 몇몇 EM 방법은 초구조 단백질 현지화의 질문에 접근하기 위하여 이용되었습니다. 가장 일반적으로 이용되는 방법 중 하나는 항원 특이적 1 차 항체가 관심있는 단백질을 검출하기 위하여 이용되는 면역전자 현미경 검사법 (IEM)입니다. EM 신호는 전자 조밀 한 입자와 공액 이차 항체의 응용프로그램에 의해 생성되며, 가장 일반적으로 콜로이드 금4,5. 대안적으로, 말무과후옥시다아제(HRP)와 같은 효소와 접합된항체는6, 7,8을전자조밀성 침전물생성에 사용될 수 있다. IEM에는 사전 포함 및 사후 포함 레이블이라고 하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 사전 포함 IEM에서 항체는 세포에 직접 도입되어 세포의 빛 고정 및 투과화가 필요합니다9,10,11. 두 단계 모두초구조12,13을손상시킬 수 있다. 1.4 nm 나노 골드와 공액 된 항체 Fab 단편으로 구성된 상당히 작은 항체의 개발은 매우 부드러운 투과 조건사용 이 가능합니다; 그러나 나노 골드는 TEM에서 직접 시각화하기에는 너무 작으며14,15,16이표시되기 위해 추가 향상 단계가 필요합니다. 임베딩 후 IEM에서 항체는 수지17에고정, 탈수 및 삽입에 의해 완전히 처리 된 세포의 얇은 섹션에 적용됩니다. 이러한 접근법은 투과 단계를 피하지만, 샘플 전처리 전반에 걸쳐 관심의 에피토프를 보존하는 것은18,19,20에도전적이다. 도쿠야스 광 고정 방법 다음에 동결, 저온 절편 및 항체 검출은 향상된 에피토프보존(21,22)을제공한다. 그러나, 극저온 초미세 절제술의 기술적 요구 사항뿐만 아니라 세포에서 달성된 최적대비 이하의 불이익은 23가지단점이다.
유전적으로 인코딩된 태그를 사용하면 관심 있는 단백질의 검출과 관련된 IEM의 많은 어려움을 제거할 수 있습니다. 태그의 다양한 사용할 수 있습니다, HRP를 포함, 페리틴, ReAsH, miniSOG, 및 메탈로티오닌24,25,26,27,28,29,30,31, 32. 이들 각각은 이전 방법에 비해 장점이 있지만, 각각은 또한 광범위한 사용을 방지 단점이 있다. 이러한 단점은 시토솔에서 HRP의 비활성에서 페리틴 태그의 큰 크기, ReAsH의 빛 감도, 작은 크기와 금속 로티오닌의 세포 염색과의 호환성 부족에 이르기까지 다양합니다. 최근에는 아스코르브베이트 과산화아코시다아제로부터 유래된 단백질이 EM 태그로 설계되고 있으며, APEX233,34. 과산화제로서, APEX2는 3,3' 디아미노벤지딘(DAB)의 산화를 촉매할 수 있으며, 관심 있는 단백질(25 nm 미만)으로부터의 최소한의 확산과 국소 EM 대비를 제공하기 위해 오스뮴 테트록사이드와 반응하는 침전물을 생성한다(33,35. 기존의 HRP 기반 방법과 달리 APEX2는 매우 안정적이며 모든 셀룰러 구획33에서활성 상태로 유지됩니다. 샘플은 기존의 EM 샘플 염색 및 주변구조물(33,34,36)의좋은 시각화를 허용하는 방법을 사용하여 TEM용으로 처리될 수 있다. APEX2는 작은 크기, 안정성 및 다기능성으로 인해 잠재력이 큰 EM 태그로 부상했습니다.
위에서 논의된 많은 접근법은 초구조보존, 저온 동결치환착및저온동결치환착에서 현재의 당과 결합될 수 없거나 아직 결합되지 않았다. 따라서, 그들은 정확한 단백질 국소화를 결정 하기 위해 막 보존 및 세포 염색의 부족에서 고통. 이것은 반드시 얻을 수있는 데이터의 해상도와 해석을 제한합니다. 고압 동결 (HPF)에 의한 Cryofixation은 수성 샘플의 결정화보다는 유리화를 일으키는 고압 (~ 2,100 bar)에서 액체 질소에서 샘플을 신속하게 동결시켜37,38,39에가까운 상태로 세포를 보존합니다. HPF는 동결 치환(FS), 저온(-90°C) 탈수액과 인큐베이션, 오스뮴 테트옥사이드 및 우라닐 아세테이트와 같은 전형적인 EM 얼룩을 결합한다. HPF와 FS는 함께 전통적인 화학 적 고정 (유물로 이어질 수있는 더 이상 과정) 및 실온 또는 얼음 (지질과 설탕의 추출로 이어질 수있는) 알코올 탈수에 비해 뚜렷한 이점을 제공하므로 단백질 검출을위한 최고의 EM 태그와 결합하는 것이 바람직합니다.
HPF/FS가 APEX2 라벨링과 결합되지 않은 한 가지 이유는 빛 화학적 고정이 과산화아역 반응의 전제 조건이며 DAB 반응 생성물의 확산을 제한하기 때문입니다. 지금까지 APEX2 연구에서, 고정 및 과산화아제 반응은 염색 및 알코올 탈수에 대한 전통적인 EM 방법에 이어33,36. 그러나, HPF/FS를 이용한 화학적 고정을 따르는 것은 전통적인 화학적 고정 및 알코올 탈수 단독40에비해 보존에 뚜렷한 이점을 제공한다는 것을 보여주었다. 전통적인 TEM 샘플에서 볼 수 있는 초구조적 무결성의 손실은 탈수에 보다 고정에 덜 연결된 것으로 보이며, 이는 전형적으로 실온 또는 얼음에서 알코올을 사용하여 행해지며, 지질 및 당류의 추출로 이어질 수 있다40,41. cryoAPEX 방법을 개발하기 위해, 우리는 화학 적 고정 및 과산화 아제 반응, HPF 및 FS 에 이어, 초구조 보존의 관점에서 최적의 결과를 생성 할 것이라고 가설.
여기서 우리는 APEX2 태그를 동결 및 동결 대체 방법과 결합한 cryoAPEX프로토콜을제시합니다(그림 1). 이 간단한 프로토콜은 관심 있는 APEX2 태그가 달린 단백질의 형질감염, 세포의 화학적 고정 및 과산화아제 반응으로 구성됩니다. HPF 및 FS는 전형적인 수지 임베딩 및 얇은 단면에 의해 수행됩니다. TEM 이미징은 이 방법을 사용하여 초구조체의 우수한 보존을 보여줍니다. 추가적으로, 고분해능 세포성 면역화 및 벤도아성 망막(ER) 루멘성 단백질의 공간 분포가 관찰되었다. 이 방법은 전자 현미경 분석을 위한 세포 내막 단백질 국소화의 검출을 위해 널리 유용합니다. 우리의 손에, 방법은 HEK-293T (인간 배아 신장), HeLa (인간 자궁 경부암), Cos7 (아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포), 및 BHK (아기 햄스터 신장)를 포함하여 조직 배양에서 성장한 다양한 세포주를 위해 성공적으로 일했습니다. HEK-293T 세포를 사용하여 상세한 지침이 아래에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>아세톤(유리 증류)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>비커; 플라스틱, 일회용 120cc</td><td>전자 현미경 과학</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>극저온 저장 바이알, 2mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형 독수리 매체</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, 단일 성분 A, M 에폭시 수지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, 단일 구성 요소 B, 경화제 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, 단일 구성 요소 C, 가속기 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, 단일 구성 요소 D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 몰드, 표준 평면, 14mm x 5mm x 6mm</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 몰드, 표준 평면, 14mm x 5mm x 4mm</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청; Nu-Serum IV 성장 배지 보충제</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Boats, 6.4mm</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>유리 나이프 메이커</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 10% 수용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>고속 이송 시스템을 갖춘 고압 냉동고</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Archived Product, Replaced to Leica EM ICE</td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide 30% Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>EM PACT2용 멤브레인 캐리어, 1.5 mm x 0.1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드, 결정질</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 20X, 초순수 등급</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>AFS/AFS2용 플라스틱 캡슐, 5mm x 15mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>슬롯 그리드, Formvar 지지 필름이 있는 2 x 1mm 구리</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 카코딜레이트 완충액, 0.2m, pH 7.4</td><td>전자 현미경 과학</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨, 펠렛 500g(ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>탄닌산</td><td>전자 현미경 과학</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시, 폴리스티렌, 멸균, 코닝, 100mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>울트라 유리 나이프 스트립</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>초박 절편,</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트 이수화물</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 cryoapex 방법

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

신호 전이 및 막 인신 매매 와 같은 주요 세포 이벤트는 세포 구획 내의 적절한 단백질 위치에 의존합니다. 단백질의 정확한 세포 내 외 현지화를 이해하는 것은 많은 생물학적 질문에 대답하기 위해 이렇게 중요합니다. 적절한 세포 보존 및 염색과 결합된 단백질 국소화를 식별하기 위한 견고한 라벨에 대한 탐구는 역사적으로 어려운 일이었습니다. 전자 현미경 검사법 (EM) 화상 진찰에 있는 최근 어드밴스는 세포 보존을 증가하고 표적 단백질을 표시하기 위하여 많은 방법 그리고 전략의 발달로 이끌어 냈습니다. 비교적 새로운 퍼옥시다아제 기반 유전자 태그인 APEX2는 복제 가능한 EM 활성 태그의 유망한 리더입니다. 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)을 위한 견본 준비는 또한 고압 동결 (HPF) 및 저온 탈수 및 동결 치환 (FS)를 통해 염색에 의한 저온화의 출현과 더불어 최근에 진보했습니다. HPF 및 FS는 유리체 샘플의 저온 이미징에 이어 두 번째로 TEM 이미징을 위한 셀룰러 울트라구조의 우수한 보존을 제공합니다. 여기서 우리는 HPF 및 FS와 APEX2 태그의 사용을 결합하는 cryoAPEX 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜에서 관심 있는 단백질은 APEX2로 태그가 지정되고 화학적 고정 및 과산화아제 반응이 뒤따릅니다. 실온에서 전통적인 염색 및 알코올 탈수 대신, 샘플은 저온이며 FS를 통해 저온에서 탈수 및 염색을 겪습니다. cryoAPEX를 사용하면 관심 있는 단백질을 세포외 구획 내에서 식별할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 보존된 멤브레인 내에서의 토폴로지와 관련하여 추가 정보를 해결할 수 있습니다. 우리는 이 방법이 세포기관 루멘 내의 단백질 분포 패턴을 해독하고, 다른 표지되지 않은 소기관과 가까운 한 소기관 내에서 단백질의 구획화를 구별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도를 제공할 수 있음을 보여줍니다. 추가, cryoAPEX는 절차적으로 간단 하 고 조직 배양에서 성장 하는 세포에 순종. 일반적인 동결 및 동결 대체 방법보다 기술적으로 더 어렵지 않습니다. CryoAPEX는 유전적으로 태그가 지정될 수 있는 막 단백질의 TEM 분석에 널리 적용됩니다.

저온아펙스 방법을 이용한 초구조보존을 기존의 고정 및 탈수와 비교하기 위해, 우리는 안구 망막(ERM)이 있는 샘플을 제조하였다. ER 멤브레인) 펩티드를 APEX2로 태그하고 HEK-293T 세포로 형질전환하였다. ERM-APEX2는 ER의 세포질 면을 현지화하고 ER 구조를 조직된 부드러운 ER(OSER)34,42,43으로알려진 형태학적으로 구별되는 구조로 리모델링한다. OSER 형태는 초구조 보존을 비교하는 최적의 영역역할을 하는 매끄럽고 평행하며 조밀하게 쌓인 멤브레인 영역을 포함합니다. 기존의 APEX 방법에 의한 샘플의 제조는 OSER 구조의 명확한 라벨링(그림2A-D)을초래하였다. 고배율에서 검사시, 적층된 멤브레인은 주름이 있고 불균일한 틈새가 동심막 밀도 사이에 존...

이 프로토콜은 APEX2 태그가 달린 막 단백질이 최적으로 보존된 세포 초음파 구조 내에서 전송 전자 현미경검사법에 의해 국한될 수 있는 cryoAPEX 방법을 설명합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

이 방법은 막 단백질에 얼룩을 두는 동시에 막 무결성 및 세포 전 세이체 아키텍처를 보존하는 기능을 결합합니다. 따라서 멤브레인 관련 단백질을 정확하게 국소화하는 데 매우 강력합니다. 이 기술의 주요 장점은 견고한 유전 적 복제 태그, APEX2의 사용과 극저온 및 동결 대체를 포함한 전자 현미경 검사법을 위한 세포 보존에 있는 기술 방법의 상태를 결합한다는 것입니다.이들은 함께 잘 보존된 세포 내에서 정확한 단백질 국소화를 허용합니다. 이 프로토콜은 바이러스가 호스트 셀 내부에서 복제되는 메커니즘을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 바이러스는 수시로 그들의 감염 계획 도중 호스트 단백질을 납치할 것입니다.바이러스는 작은 게놈, 그들은 이러한 호스트 세포 내부 복제 활용. 최근, 우리는 게시되지 않은 데이터에서 바이러스가 복제하는 방법을 이해하기 위해이 기술을 사용하여 이러한 단백질을 라벨 수 있었습니다. 이 기술은 골기 고장을 일으키는 원인이 되는 세균성 독소에 최근 협력 연구에서 정말 중요한 입증했습니다.cryoAPEX를 사용하여, 우리는 단편화된 골기 조각으로 독소를 정확하게 현지화할 수 있었습니다, 일반적인 면역 형광 기술을 사용하여 그렇지 않으면 보기 가 정말 어려웠던 무언가. 이 기술을 시연하는 것은 대학원생인 일레인 미헬크(Elaine Mihelc)와 연구 동료인 스테파니 엔젤(Stephanie Angel)이 우리의 실험실에서 볼 수 있습니다. 접시에 HEK293 세포를 파종 한 후, APEX2 태그 포유류 발 플라스미드 제조업체의 지시에 따라 트랜스 페시언 시약을 사용하여 세포를 트랜스펙트.12-15 시간 후에 경질 후에, PBS로 한 번 세포를 씻는다. 그런 다음 접시에서 PBS로 세포를 15 밀리리터 원내 튜브로 씻어냅니다. 500 x g의 원심분리기는 5분간.상체를 조심스럽게 제거하고 실온에서 pH 7.4에서 2%의 글루타랄데히드 및 0.1 어금니 나트륨 카코딜레이트 버퍼의 2밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 샘플을 얼음 위에 놓고 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 5분간 500 x g로 펠릿합니다.펠릿을 각각 5분간 3회 세척하여 0.1 의 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼 2밀리리터를 섭씨 4도에서 원심분리하여 씻습니다. 원심 분리 후 상체를 제거합니다. peroxidase 반응을 수행하기 위해, 5 분 동안 500 x g에서 펠릿팅 다음 DAB 용액의 3 밀리리터에서 다시 중단하여 펠릿을 세척합니다.그런 다음 과산화수소 5.88 밀리머를 가진 DAB 용액 의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 펠릿은 눈에 띄게 갈색으로 되어 불용성 DAB 반응 생성물의 존재를 나타냅니다.DMEM에서 나트륨 cacodylate 버퍼로 다시 세척 한 후 원고에 따르면 10 %의 태아 소 혈청과 15 %의 소 세럼 알부민을 포함하는 DMEM의 냉동 보호 용액 500 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포 현탁액을 0.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 펠릿은 다시 원심분리기 속도를 500 x g에서 약간 증가시킵니다.펠릿이 건조하지 않도록 충분한 액체가 남아 있는지 확인, 상체의 대부분을 폐기. 실험실 닦아 또는 종이 타월의 모서리를 사용하여 세포 펠릿에서 남은 액체를 멀리 심지. 펠릿이 치약과 일관성이 유사하여 페이스트를 형성하는 충분한 액체를 유지하게 하십시오.세포 펠릿의 2~3개의 마이크로리터를 흡인시키고 멤브레인 캐리어에 증착한다. 표면 장력이 상단에 약간의 돔을 만들 수 있도록 멤브레인 캐리어의 우물을 완전히 채웁니다. 멤브레인 캐리어를 카트리지에 밀어 넣고 고정합니다.카트리지를 준비 및 준비된 HPF 기계에 넣고 누기 시작하십시오. 카트리지를 액체 질소에 담그고 카트리지에서 멤브레인 캐리어를 제거합니다. 플라스틱 캡슐에 넣고 플라스틱 캡슐을 액체 질소로 가득 찬 극한의 극찬에 넣습니다.화학 후드에서, 부피 탄닌산에 의해 0.2 %의 무게와 극저온아의 아세톤에 5 %의 DI 물용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비합니다. 동결액체 질소에 넣습니다. 동결 대체 믹스 1개의 바이알과 냉동 셀 펠릿을 함유한 Cryovials를 동결 대체 단위 샘플 챔버에 놓습니다.액체 질소 유리병으로부터 멤브레인 캐리어를 함유한 내부 캡슐을 동결 대체 믹스 를 함유한 해당 바이알로 옮춥시킵니다. 섭씨 90도에서 동결 대체 프로토콜을 시작합니다. 24시간 후 동결 대체를 일시 중지하고 90°C까지 냉각된 아세톤으로 5분간 샘플을 세 번 세척합니다.다음으로, 화학 후드에서, 1 %의 오스뮴 테트산화물의 용액의 샘플 당 1 밀리리터를 준비하고, 0.2 % 우란 아세테이트, 및 냉동 액체 질소에 넣어 아세톤에 5 %의 DI 물을 배치합니다. 동결 대체 믹스2를 동결 대체 장치에 넣고 3차 아세톤 세척에서 캡슐을 동결 대체 믹스 2개 바이알로 옮춥시다. 이를 배양하고 교체 믹스를 섭씨 90도에서 72시간 동안 동결한 다음 12-18시간 동안 섭씨 0도까지 점진적으로 온난화됩니다.온도를 섭씨 0도에서 유지하고 미리 냉각된 아세톤을 바이알에 추가하여 각각 10분 동안 세 번 세척합니다. 제조업체의 지시에 따라 플라스틱 비커에 수지 혼합물을 준비하고 캡슐을 몰입시키기 위해 바이알에 2 %4 %와 8 %의 수지 (수지)를 추가하십시오. 섭씨 0도에서 각각 2시간 동안 배양하세요.그런 다음 A, B, D의 15%30%60%와 100% 수지 성분을 실온에서 각각 4시간 동안만 배양합니다. 20시간 후 수지 성분 A, B, C 및 D를 혼합하여 4시간 동안 배양합니다. 세포 펠릿 이면에 세포 펠릿을 얹고 수지 혼합물 A, B, C 및 D.를 오븐에 넣고 24-36 시간 동안 60도에서 중합합니다.중합 후, 금형에서 블록을 제거하고 배율로 시각화 할 수있는 초미세 토메의 수직 척에 샘플을 배치합니다. 멤브레인 캐리어에 액체 질소를 두드리는 조합으로 멤브레인 캐리어를 분리하여 금속을 플라스틱으로부터 분리하고, 면도날을 사용하여 멤브레인 캐리어 주변의 수지를 제거합니다. 분리하면 멤브레인 캐리어를 부드럽게 들어 올려 세포 펠릿 돔을 블록 의 얼굴에 남깁니다.노출된 셀 펠릿이 첫 번째 금형보다 약간 더 깊은 평평한 임베딩 몰드에 위쪽으로 향하는 블록을 놓고 수지 성분 A, B, C 및 D.폴리머를 섭씨 60도에서 24-36시간 동안 채웁니다. 면도날을 사용하여 셀 펠릿 주변의 블록을 다듬습니다. 그런 다음 초미세 토메의 단면 암에 샘플 척에 블록을 놓습니다.유리 나 다이아몬드 나이프를 사용하여, 밀접하게 세포 펠릿을 둘러싼 사다리꼴 모양으로 블록을 손질. 유리 또는 다이아몬드 나이프를 사용하여 세포 펠릿의 90 나노미터 초박면을 가져옵니다. TEM 그리드에서 섹션 리본을 선택합니다.필터 용지에 가장자리를 블로팅하여 그리드를 건조시키고 TEM 그리드 저장 상자에 보관합니다. TEM 홀더에 그리드를 마운트하고 현미경에 홀더를 배치합니다. 80킬로볼트에서 Tecnai T12를 사용하여 극저온APEX 샘플을 검사하십시오.APEX2 라벨링으로 관심 있는 세포 및 세포 극체 구조의 이미지를 획득합니다. 이 연구에서는, 전통적인 APEX 방법에 의한 견본의 준비는 조직되고 매끄러운 풍요로운 망상 구조물의 명확한 표시 귀착되었습니다. 높은 배율에서, 쌓인 막은 주름이 나타났고 동심 막 밀도 사이에 부균일한 간격이 존재하여 막 보존과 지질 추출이 불량했음을 나타냅니다.cryoAPEX에 의해 제조된 견본은 또한 조직되고 매끄러운 폐막 구조물의 명확하게 정의된 표시가 있었습니다, 그러나, 막은 매끄럽고 평행하고 거의 또는 전혀 지질 추출이 보였다. 90 나노미터 의 얇은 섹션의 TEM 분석은 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E가 핵 봉투뿐만 아니라 말초 내피 성 망상 전체에 존재했다는 것을 밝혔다. 또한, 헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 밀도는 발등 풍안성 망상 막을 따라 정기적으로 간격이 있는 초점으로 해결되었다.헌팅턴 효모 상호 작용 단백질 E 분포 및 포시는 또한 전통적인 고정 및 탈수로 제조된 견본에서 보였습니다. 그러나 광범위한 막 중단 및 추출이 존재하여 시료를 최적이 지않았다. APEX2 라벨링은 3개의 세포 마커를 사용하여 수행되었으며, 그 중 미토-V5-APEX2는 미토콘드리아만의 특정 염색을 제공했으며 CAAX-APEX2는 플라즈마 멤브레인의 뚜렷한 염색만을 생성하였다.세포 내 세포기관에서는 라벨이 관찰되지 않았습니다. 골지 루멘에 대한 염색은 또한 우리의 원래 Sengupta 외 원고에 설명된 바와 같이 알파 MAN2-APEX2 마커를 사용하여 평가되었다. 이 절차에 이어, 전자 단층 촬영 또는 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사와 같은 3차원 방법은 관심 있는 단백질의 3D 분포를 조사하기 위해 수행될 수 있다.이 프로토콜에 사용되는 화학 물질의 대부분은 독성, 그래서 사용하기 전에, 안전 데이터 시트는 화학 물질이 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 처리되고 기관 지침에 따라 폐기되도록 협의되어야한다.

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Schönherr, S., et. al. 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특이적 배열을 조사하기 위해 광유전학 및 동결 파괴 복제 면역 라벨링을 결합했습니다. J. Vis. 특급. (2016)이 비디오는 전자 현미경을 위한 마우스 뇌 조직의 동결 파괴 복제본의 면역 라벨링을 보여줍니다. 파쇄되고 코팅된 복제품은 수용체를 노출시키기 위해 소화됩니다. 1차 및 골드 태그가 지정된 2차 항체를 추가하여 특정 신경세포막 수용체를 표지합니다. 복제본은 그리드에 장착되고 전자 현미경으로 시각화됩니다.

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

여기에서는 동결 파괴 식물 조직을 연구하는 절차를 설명합니다. 고압 동결 잎 샘플은 동결 파쇄 및 이중층 코팅되어 빔 손상을 최소화하면서 고배율에서 극저온 주사 전자 현미경을 사용하여 이미지화되는 잘 보존된 동결 수화 샘플을 생성합니다.

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

여기, 우리는 쉽게, 낮은 비용을 제공하고, 시간 효율적인 프로토콜은 화학적으로 투과 전자 현미경에 대한 면역 조직 화학 염색을 미리 내장과 호환되는 장기 보존을 허용, 아크롤레인 정착액와 영장류 뇌 조직을 고정 할 수 있습니다.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 메서드는 이전 가벼운 현미경 검사 법 (LM)에 의해 선택 된 셀에 전자 현미경 (EM)를 통해 바이러스-유도 된 세포내 구조 이미지에 적용 됩니다. LM 및 EM 바이러스-호스트 상호 작용의 통합된 보기를 달성 하기 위해 하이브리드 이미징 접근으로 결합 됩니다.

상호 빛 전자 현미경 검사 법 (클레 멘 타인) 추적 하 고 바이러스 성 단백질을 이미징 관련 Cryo 움직일 셀 구조

여기에 제출된 포유류 세포에 있는 막 단백질을 표지하고 액체 상 스캐닝 전송 전자 현미경을 위한 그래 핀으로 견본을 코팅하기 위한 프로토콜입니다. 방사선에 의한 손상에 대하여 견본의 안정성은 또한 이 프로토콜로 공부할 수 있습니다.

액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

이 프로토콜은 극저온 구조조명 현미경을 사용하여 생물학적 냉동 보존 샘플을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 U2OS 세포의 세포 골격을 화상 진찰하여 방법론을 보여줍니다.

극저온 보존 된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

이 워크플로우는 극저온 삼중 일치 이미징 플랫폼을 사용하여 작고(축 범위 &lt;1μm) 희귀한(세포당 1개 사본) 형광 표지된 생물학적 구조를 표적으로 하는 라멜라 생산을 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 형광 현미경, 집중 이온 빔 밀링 및 스캐닝 전자 현미경을 단일 초점 위치에 통합하고 밀링 중 동시 형광 현미경을 가능하게합니다.

세포의 표적 밀링을 위한 극저온 일치 형광, 전자 및 이온빔 현미경을 사용한 워크플로

배우세요 APEX2 태그를 이용한 막 단백질 국소화 방법으로, HEK293 세포에서 바이러스 복제 메커니즘을 연구합니다. 냉동고정 및 동치환 기술로 세포 미세구조를 보존하며 정밀한 단백질 위치 파악이 가능합니다.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

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