Name: 2,7-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: 배우세요 DCFH-DA 염색을 이용한 부착세포의 총 반응성 산소종 검출 방법입니다. 형광현미경과 판독기로 ROS 위치와 강도를 정량화하여 HCT116 대장암 세포에서 산화 스트레스를 분석할 수 있습니다.

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이 작품은 미국 암 학회 (RSG-18-050-01-NEC)의 연구 학자 보조금인 국립 보건 원 (K01DK14390)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 연구 파일럿 프로젝트 보조금은 뉴멕시코 대학교 환경 건강 서명 프로그램 및 슈퍼펀드(P42 ES025589), 공유 자원 시범 프로젝트 상 및 UNM 종합 암 센터의 연구 프로그램 지원 파일럿 프로젝트 상(P30CA118100) 뉴멕시코 의과 대학의 전담 건강 연구 기금에서 새로운 조사자 상을 수상했습니다.

1. 셀 시드
<ol><li>종자 2 x 105 HCT116 대장암세포는 24웰 플레이트에서 잘 되어 있으며, 37°C에서 하룻밤 사이에 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)에서 세포를 유지한다.</li>
	<li>배양 배지를 100μM 철황산염(FS) 또는 10μM 독소루비신(DOX)의 배지 및 인큐베이트 24시간 없이 교체한다.</li>
</ol>2. DCFH-DA 솔루션 준비
<ol><li>디메틸 설산화물(DMSO)의 1mL에 DCFH-DA 4.85 mg을 용해하여 10mM 스톡 용액을 만듭니다.</li>
	<li>미리 데워진 DMEM으로 스톡 솔루션을 10 μM 작업 솔루션으로 희석한 후 우물에 추가합니다.</li>
	<li>10초용 작업 용 솔루션.</li>
</ol>3. DCFH-DA 염색
<ol><li>매체를 함유한 약물을 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오.</li>
	<li>DCFH-DA 작업 용액의 500 μL을 각 우물에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>DCFH-DA 작업 솔루션을 제거합니다. DMEM으로 한 번 씻고 1배 인산완충식식염수(PBS)로 2배 세척합니다.</li>
	<li>각 웰에 1x PBS의 500 μL을 추가합니다.</li>
</ol>4. 이미징 수집 및 강도 측정
<ol><li>형광 현미경에 녹색 형광 단백질 (GFP) 채널을 사용하여 각 우물에 대한 대표적인 형광 이미지를 가져 가라.</li>
	<li>이미지를 촬영한 후 PBS를 제거하고 각 우물에 방사성 면역 침전 분석(RIPA) 버퍼 200 μL을 추가합니다.</li>
	<li>얼음에 5분 동안 배양한 다음 세포 용액을 1.5mL 튜브로 수집합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 21,130 x g의 원심분리기.</li>
	<li>상피관의 100 μL을 검정 96웰 플레이트로 옮기고 485nm의 내분 파장및 530nm의 방출 파장에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광 강도를 측정한다.</li>
	<li>초상체의 1 μL을 브래드포드 분석9를사용하여 단백질 농도를 측정하기 위해 1x 단백질 분석 용액의 100 μL을 포함하는 투명한 96 개의 웰 플레이트로 전송한다.</li>
	<li>단백질 농도로 형광 강도를 정상화하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Birben, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+antioxidant+defense%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organization+Journal%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and antioxidant defense.</a> World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).</li>
<li>Kim, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Oxidative+Stress+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases.</a> Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).</li>
<li>Sullivan, L. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species and cancer.</a> Cancer & Metabolism. 2, 17(2014).</li>
<li>Formentini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+Production+Protects+the+Intestine+from+Inflammation+through+Functional+M2+Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization.</a> Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).</li>
<li>Rakotoarisoa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-+and+Fish+Oil-Loaded+Spongosome+and+Cubosome+Nanoparticles+with+Neuroprotective+Potential+against+H2O2-Induced+Oxidative+Stress+in+Differentiated+Human+SH-SY5Y+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells.</a> ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).</li>
<li>Mateen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Reactive+Oxygen+Species+Formation+and+Oxidative+Stress+in+Rheumatoid+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis.</a> PLoS One. 11 (4), (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Hemin+and+Sestrin2+modulates+oxidative+stress+and+colon+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sotetsuflavone+inhibits+proliferation+and+induces+apoptosis+of+A549+cells+through+ROS-mediated+mitochondrial-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway.</a> BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235(2018).</li>
<li>Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKruger%2C+NJ+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).</li>
<li>Tetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+the+dichlorofluorescein+assay+to+avoid+artifacts+in+measurement+of+toxicant-stimulated+cellular+production+of+reactive+oxidant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).</li>
<li>Rong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+detection+with+high+specificity+in+living+cells+and+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues.</a> Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).</li>
<li>Liu, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+hydroxyl+radical+generated+in+quartz+powder%2Fphosphate+buffer+solution+system+by+fluorescence+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Guang+Pu+Xue+Yu+Guang+Pu+Fen+Xi%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry.</a> Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 실험 프로토콜은 세포 총 ROS를 측정하기 쉽게 재현할 수 있습니다. 중요한 단계에는 DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고, 세포 상태 방해를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척이 포함됩니다. DCFH-DA 작업 솔루션의 준비를 위해 재고 솔루션은 24 웰 플레이트에 추가하기 직전에 미리 따뜻해진 DMEM에 추가되어야 합니다. 그 이유는 높은 배경 형광 또는 광 노출을 생성하는 오래된 솔루션이 광표백으로 이어질 것이기 때문입니다. 대부분의 연구는 1x PBS 또는 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)을 사용하여 DCFH-DA를 희석시키고 반응 버퍼10으로사용합니다. 그러나, HCT116 및 RKO를 사용하는 경우, PBS및 태아소 혈청무료 DMEM을 이용한 DCFH-DA 스톡 용액의 희석은 처리되지 않은 세포에서도 높은 배경 신호를 생성하였다. 이것은 셀 상태 장애 때문일 수 있습니다. 또한 DCFH-DA 작업 솔루션은 ...

생리학적 의미의 세포 대사에 의해 생성되는 3개의 주요 반응성 산소 종(ROS)은 초산화수소 음이온, 하이드록실 라디칼 및 과산화수소1이다. 낮은 농도에서, 그들은 생리 세포 과정에 참여, 하지만 높은 농도에서 그들은 세포 신호 경로에부작용1. 우리 몸은 과도한 ROS에 효과적인 항산화 시스템을 개발했습니다. 그러나, 산화 스트레스는 ROS가 염증, 암 및 신경 퇴행성 질환2,,3,,4를포함한 많은 병리학 적 조건에 기여하는 우리 몸의 해독 능력을 압도 할 때 발생할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 부착된 세포에서 총 세포 ROS를 결정하는 것이다. 그 근거는 DCFH-DA에서 2'-7'dichlorofluorescein (DCF)의 산화가 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 이산화질소 (•NO2)를포함한 총 ROS 검출을 위해 광범위하게 사용되었다는 것입니다. 기계적으로, DCFH-DA는 세포 esterase가 아세틸 군에서 갈라지는 세포에 의해 채택되어 DCFH의 결과로. ROS에 의한 DCFH의 산화는 분자를 DCF로 변환하여 485 nm의 내분 파장과 530 nm의 방출 파장에서 녹색 형광을 방출합니다. 유동 세포측정및 기타대체방법으로형광의 검출에 비해5,형광 현미경 및 플레이트 판독기를 이용한 이 방법의 장점은 명확하게 보이는 형광 영상을 생성하고, 효율적이고 비용 효율적이다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위한 셀룰러 ROS를 검출하는 데 널리 사용되어 왔다6,,7,,8. 이 프로토콜은 부착 된 세포에서 총 ROS를 검출하는 데 사용됩니다. 서스펜션 셀에서 ROS를 감지하려면 이 방법을 사용하면 약간의 수정이 필요할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2',7'-Dichlorofluorescein diacetate</td><td>Cayman Chemical, Ann Arbor, MI</td><td>20656</td><td></td></tr><tr><td>독소루비신 염산염</td><td>TCI America, Portland, OR</td><td>D4193-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>45000-304</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulfate Heptahydrate</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>97061-542</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL 자동 이미징 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td>또는 기타 형광 현미경</td></tr><tr><td>단백질 분석 Bradford 솔루션</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2 Microplate Reader</td><td>Molecular Devices, Radnor, PA</td><td>89429-532</td><td>또는 기타 형광 마이크로플레이트 리더</td></tr></tbody></table>

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

산화 스트레스는 생리학적 및 병리학 적 조건 모두에서 중요한 사건이다. 본 연구에서는 대장암 세포주에서 염색하는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 반응성 산소 종(ROS)을 측정하여 산화 스트레스를 정량화하는 방법을 보여 준다. 이 프로토콜은 DCFH-DA 솔루션 의 준비, DCFH-DA 용액을 가진 세포의 인큐베이션 및 정규화된 강도의 측정을 포함한 상세한 단계를 설명합니다. DCFH-DA 염색은 세포에서 ROS를 검출하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 그것은 화학 적 치료 또는 유전자 변형 후 ROS 생성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 환경 스트레스에 세포 산화 스트레스를 결정에 유용, 기계학 연구에 단서를 제공.

HCT116 대장암세포는 산화응응을 유도하기 위해 100μM FS 또는 10 μM DOX로치료되었다. 도 1에도시된 바와 같이, 녹색 형광은 예상대로 FS와 DOX 모두에 의해 극적으로 증가되었다. 상대강도 변화를 정량화하기 위해, 세포를 촬영한 후 리즈화하고 단백질 농도로 정상화하였다. 정량화형 형광 강도는 HCT116 세포에서 FS 또는 DOX에 의해 현저하게 증가하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60682/60682fig1.jpg"> 그림 1: 철제 치료는 대장암세포에서 ROS를 증가시킨다. 형광 현미경 및 강도 정량화에 의해 촬영 된 대표적인 형광 이미지 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 이아세테이트...

여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

이 방법은 형광 현미경만으로 부착 된 세포에서 세포 반응성 산소 종을 분석하고 형광 판 판독기와 반응성 산소 종 강도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다. DMEM의 제5 HCT116 대장암세포를 24웰 플레이트의 각 웰로 2회 10번 시드하는 것으로 시작한다.섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 배양 배지를 100 마이크로몰라 철황산염 또는 10마이크로몰러 독소-비카인 함유 매체로 대체하고, 플레이트를 24시간 동안 배양한다. DMSO의 1밀리리터에 4.85 밀리그램의 DCFH-DA를 용해하여 DCFH-DA 솔루션을 준비하여 10 밀리몰러 스톡 솔루션을 만듭니다.우물에 추가하기 직전에 미리 데워진 DMEM으로 주식을 희석하여 10 마이크로몰러 작동 솔루션을 만들고 10 초 동안 소용돌이를 만듭니다. 세포를 염색하려면 약물 함유 매체를 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오. DCFH-DA 작업 용액 500마이크로리터를 각 웰에 추가하고 30분 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.인큐베이션 후, 우물에서 DCFH-DA를 제거하고 DMEM으로 두 번, PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 500 마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 형광 현미경에 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 세포의 대표적인 이미지를 취하십시오.그런 다음 PBS를 제거하고 200 마이크로리터의 방사성 면역 침전 분석 분석 버퍼를 각 우물에 추가합니다. 5 분 동안 얼음에 접시를 배양하고, 1.5 밀리리터 튜브로 세포 용액을 수집합니다. 4°C에서 10분 동안 21, 130회 G에서 튜브를 원심분리합니다.그런 다음 상체의 100 마이크로리터를 검은 색 96 웰 플레이트로 옮기습니다. 485 나노미터의 내분 파장에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하고 530 나노미터의 방출 파장을 사용하여 각 우물의 형광을 측정합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 단백질 분석 용액을 가진 투명 96웰 플레이트에 상체의 마이크로리터 1개를 전송하여 브래드포드 분석으로 단백질 농도를 측정합니다.단백질 농도를 사용하여 형광 강도를 정상화하십시오. HCT116 대장암세포는 산화 스트레스를 유도하기 위해 100개의 미세몰라 철황산염 또는 10개의 미세몰어 독소비신으로 치료되었다. 예상대로, 녹색 형광은 극적으로 두 치료에 의해 증가했다.상대강도 변화를 정량화하기 위해 세포는 단백질 농도로 lysed 및 정규화되었다. 상대형형광강도는 철황산염 또는 독소루비신에 의해 현저히 증가되었다. 이 절차를 수행할 때DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고 세포 상태 장애를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척을 수행하는 것이 중요합니다.이 프로토콜에 의한 총 ROS검출 외에도, 특히 과산화수소와 같은 ROS를 수행할 수 있다.

detection-total-reactive-oxygen-species-adherent-cells-2-7

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Biochemistry

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이 프로토콜은 고처리량 스크리닝 접근 방식을 사용하여 형광 염료 프로브로 디하이드로에티듐(DHE)을 사용하여 세포 내 활성 산소종(ROS)을 정량화하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 세 가지 서로 다른 간세포 암종 세포주에서 세포 내 활성 산소종(ROS)의 정량적 평가 방법을 설명합니다.

Dihydroethidium(DHE) 형광 염료를 사용한 활성 산소종(ROS) 생성의 고처리량 스크리닝 평가

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

배우세요 DCFH-DA 염색을 이용한 부착세포의 총 반응성 산소종 검출 방법입니다. 형광현미경과 판독기로 ROS 위치와 강도를 정량화하여 HCT116 대장암 세포에서 산화 스트레스를 분석할 수 있습니다.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

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