라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

이 프로토콜은 한 세포 집단에서 GPCR 작용제의 완전한 기능 성 농도 반응 관계의 기록을 가능하게하고 낮은 세포 샘플 수에 대해서도 상세한 작용성 특성화를 제공합니다. 직렬 도징의 주요 장점은 단일 웰이 전체 농도 응답 분석에 충분하기 때문에 처리량의 증가입니다. 이 기술은 폐쇄된 미세 유체 용기의 장기 온 칩 형식과 같은 희귀하고 복잡한 생물학적 모델에서 단일 트랜스듀션을 연구하는 데 적합합니다.

적절한 장비를 사용할 수 있는 경우 프로토콜을 수행하기가 어렵지 않습니다. 적절한 농도로 다양한 GPCR 리간드 솔루션을 준비하는 것이 성공의 열쇠입니다. 대학원생인 마이클 스키바와 학부생 앤 밀드너(Anne Mildner)가 실험실에서 수술을 시연할 것입니다.

전극 어레이에 세포 파종의 경우 각 전극 어레이의 우물에 적절한 세포 농도를 추가하고 실온에서 10~15분 동안 세포가 우물 바닥에 균질하게 정착할 수 있도록 합니다. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 배양기에서 적어도 36시간 후에, 세포층을 위상 대비 현미경검사법으로 검사하여 세포와 각 전극의 완전한 커버리지를 보장한다. 그런 다음 각 우물의 세포 배양 배지를 미리 따뜻하게 하고 혈청이 없는 배지의 적절한 부피로 교체한다.

임피던스 레코딩을 시작하려면 전극 배열을 임피던스 분석기의 연결 어레이 홀더에 배치하고 전극과 임피던스 분석기 사이의 적절한 저임피던스 접촉을 확인합니다. 소프트웨어의 사용자 인터페이스에서 전극 유형 및/또는 다중 웰 형식을 선택합니다. 단일 및 다중 주파수 데이터 수집 모드를 사용할 수 있고 분석할 웰 수가 낮거나 시간 해상도가 중요하지 않은 경우 여러 주파수 기록을 선택합니다.

최대 시간 해상도를 확인하려면 단일 모니터링 주파수를 선택합니다. 그런 다음 시간 과정 데이터 수집을 시작하고 데이터를 저장할 위치에 대한 데이터 폴더를 선택합니다. 임피던스 판독값은 모든 웰에 대해 지정된 수의 주파수로 기록되어 8웰 어레이에 대한 고뇌모드에서 직렬 추가 프로토콜을 시작하고, 세포에 관심 있는 고뇌의 가장 낮은 농도의 30 마이크로리터를 추가한다.

그런 다음 세포가 미리 정의된 기간 동안 반응하고 평형화한 후 각 직렬 희석이 추가될 때까지 다음 농도의 30 마이크로리터를 첨가하게 한다. 데이터를 분석하려면, 고뇌솔루션의 첫 번째 추가 전에 마지막 데이터 요소의 임피던스를 빼고, 임피던스 값을 정상화하기 위해 추가 0의 시간을 설정합니다. 정규화된 임피던스 의 시간 과정을 플롯하고 개별 시간 코스를 플롯하여 각 추가 단계 후 임피던스에서 최대치를 식별합니다.

이러한 값으로 데이터 시트를 구성하고 최대 임피던스 변경 값을 고뇌스트 농도의 함수로 플롯합니다. 그런 다음 데이터 피팅 루틴을 사용하여 4파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 반 최대 유효 농도 및 최대 응답을 결정합니다. 본 대표적인 실험에서 히스타민 농도를 증가시키고 있는 10개의 솔루션이 15분마다 세포에 순차적으로 첨가되었고, 임피던스의 변화는 매 시점에서 측정되었다.

임피던스 변화는 히스타민 농도의 함수와 7개의 우물에서 실험 데이터 포인트에 장착된 4파라미터 물류 모델의 전달 기능으로 플롯될 수 있다. 가능한 히스타민 수용체 다운레충제, 세포 둔감 또는 과잉 자극을 고려하기 위해, 분석을 위한 데이터 범위는 이 단일 직렬 투약 실험에 대해 도시된 바와 같이 감소될 수 있다. 그런 다음 3파라미터 최적화를 데이터에 적용할 수 있으며, 이 분석을 위해 0.75 플러스 또는 마이너스 0.12 마이크로몰러의 반 최대 유효 농도를 제공합니다.

히스타민 수용체 길항제 디페히드라민의 첨가 20 분 전에 첫 번째 히스타민은 세포 반응을 유도하기 위해 더 높은 작용제에 대한 필요성에 대응하는 직렬 투약 계획 내에서 임피던스의 지연 증가를 초래한다. 투여량 반응 관계에서, 길항제의 효과는 곡선의 오른쪽 이동으로 표현되며, 반최대 유효 농도의 증가에 대응하는, 길항제는 고뇌에 비해 경쟁적인 리간드인이다. 직렬 도징 계획의 성공적인 적용은 기술적으로 쉽지만 올바른 타이밍으로 모든 단계를 수행하는 것이 어렵기 때문에 사려 깊은 계획이 필요합니다.

직렬 도징은 병렬로 모니터링되는 샘플 수에 대해 제한된 다른 판독 시스템으로 농도 응답 연구를 수행할 수 있는 길을 열었습니다. 직렬 투약의 특정 장점은 세포 역학과 같은 다른 현상제 변화에 민감한 완전히 새로운 판독값으로 수용체 매개 신호 변환의 연구를 허용합니다. 흡입하거나 삼킬 때 위험할 수 있으므로 수용체 작용제의 스톡 솔루션을 준비할 때 장갑과 고글을 착용하십시오.