Name: 비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 배우세요 비인간 영장류 췌도 산소 소비 측정 방법으로 미토콘드리아 기능과 인슐린 분비 능력을 평가하는 기술입니다. 소량의 췌도로도 정확한 분석이 가능하여 당뇨병 연구와 췌도 이식 연구에 활용됩니다.

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저자는 그들의 시설의 사용에 대한 밴더빌트 높은 처리량 스크리닝 코어를 인정하고 싶습니다, 애질런트 생명 공학, 박사 폴 Kievit (오리건 건강 과학 대학) 비 인간 영장류 고립에 대한, 에릭 Donahue (밴더빌트 대학) 그림 에 대한 도움 1. J.M.E.는 수상 번호 T32GM007347에서 건강의 국가 학회의 NIGMS에 의해 지원되었습니다. M.G.는 NIH/NIDDK(R24DK090964-06)와 재향군인회(BX003744)의 지원을 받았습니다.

1. 분석기 실행 전날 마이크로 플레이트 및 센서 카트리지 준비
섬은 앞서 설명한 대로 3 살 짜리 일본 원숭이에서 격리 되었다13. 이 방법은 시체 기증자로부터 인간의 섬을 분리하는 데 사용되는 것과 매우 유사하지만, 동물이 진정 상태에서 장기 제거 전에 췌장이 종종 콜라게나아제 용액으로 팽창되는 마우스와 다릅니다. 아일렛 검색은 오리건 국립 영장류 연구 센터 (ONPRC)와 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었으며 ONPRC IACUC의 승인을 받았습니다. ONPRC는 미국 농무부(USDA)가 시행하는 동물 복지법 및 규정과 국립보건원이 발표한 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 준수합니다.
<ol><li>스페로이드 마이크로 플레이트의 준비<ol>
<li>중탄산나트륨0.1M 용액 3 mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다. 우리는 0.45 μm 필터(재료 표)를이용했습니다.</li>
		<li>세포 배양 후드에서, 0.1M 중탄산나트륨의 2.8 mL에 세포 및 조직 접착제(재료 표)의200 μL을 추가합니다. 이어서, 이 용액의 20 μL을 96웰 스페로이드마이크로플레이트(재료표)의각 웰의 바닥에 추가한다. 파이펫 팁에서 기포를 제거하고 플레이트 바닥만 덮여 있는지 확인합니다. 마이크로 플레이트의 코팅은 분석 기간 동안 약물이 추가되고 우물에 혼합 될 때 작은 섬이 우물의 측면위로 이동하는 것을 방지합니다. 참고: 분석이 실행될 때 섬에 사용되는 만큼많은 우물을 코팅하는 것이 필요합니다. 몇 개의 웰만 사용하면 셀 접착제 용액을 적절하게 축소할 수 있습니다. 분석법에 사용되는 세포 접착제는 해양 홍합에서 추출한 제형 단백질 용액이다. 또는 마이크로 플레이트 웰을 100 μg/mL 폴리-D-리신 의 20 μL로 코팅 할 수 있습니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C,비CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양한다.</li>
		<li>멸균 환경에서, 플레이트로부터 세포 접착제 용액을 흡인한다. 다중 채널 파이프를 사용하여 37 °C 멸균 수의 400 μL로 각 우물을 두 번 씻으소서. 공기건조시에 두십시오.</li>
		<li>30-40분 후에 접시를 덮고 4°C에서 밤새 보관합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>센서 카트리지의 수분 공급<ol>
<li>멸균 환경에서 센서 카트리지패키지(재료 표)를열고 내용물을 제거합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.</li>
		<li>유틸리티 플레이트의 각 우물을 200 μL 멸균수로 채우고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 넣습니다. 조립된 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 37°C,비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교정의 준비<ol>
<li>50 mL 원엽 튜브에 교정(재료표)의25 mL. 튜브를 37°C,비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 분석의 날에 미디어 준비, 섬 의적 로드 및 센서 카트리지 로딩을위한 프로토콜
<ol><li>미디어 준비<ol>
<li>48.5 mL의 베이스 매질(최소 DMEM, 재료 표참조)에 피루바트 나트륨 1mM 과 글루타민 2mM각각500 μL을 추가합니다. 또한, 추가 496 200 mg/ml 포도 당의 μL (미디어에 포도 당의 최종 농도는 5.5 mM). 참고: 기준선 포도당 농도는 이러한 실험에 대해 일정하게 유지되었다. 그러나, 포도당은 또한 타격10에기재된 약리학적 조작 이외에 호흡을 자극하는데 사용될 수 있다.</li>
		<li>pH가 7.4 +/- 0.1인지 확인하고 필요한 경우 조정합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>센서 카트리지 준비<ol>
<li>인큐베이터에서 센서 카트리지를 꺼내 센서 카트리지 뚜껑을 제거하고 우물에서 물을 버리십시오. 200 mL의 미리 온온 교정을 각 우물에 넣고 센서 카트리지 뚜껑을 교체하십시오.</li>
		<li>센서 카트리지를 인큐베이터에 약 1시간(필요할 때까지) 다시 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>미토콘드리아 스트레스 분석법 약물 준비<ol>
<li>응력 테스트키트(재료 표)를열고 내용물제거합니다. 올리고마이신, 카보닐 시안화물-4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/안티마이신 A(AA)에 대한 재고 및 작업 솔루션을 다음과 같이 구성합니다.<ol>
<li>올리고마이신: 630 μL의 조립된 매체를 튜브에 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 이어서, 포트 농도를 얻기 위해 매체로 45 μM으로 희석 (주입 후 최종 웰 농도는 4.5 μM이 될 것이다)</li>
			<li>FCCP: 튜브에 720 μL의 조립 된 매체를 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 10 μM으로 희석 (최종 웰 농도는 1 μM이 될 것입니다) 참고: BSA 및 / 또는 FBS는 미디어에 추가해서는 안됩니다.</li>
			<li>로테네/AA: 조립된 용지 540 μL을 튜브에 추가하여 50 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 25 μM으로 희석 (최종 유 농도는 2.5 μM이 될 것입니다) 참고: 위의 농도는 우리의 손에 일관된 결과를 생산하고있다. 추가 FCCP는 호흡에 있는 더 이상 증가로 이끌어 냈습니다. 그러나, 약 농도는 작은 섬 크기에 따라 조정 될 필요가 있을 수 있습니다., 특히 다른 종 또는 비 섬 spheroids에서 섬. 참고로, 비인간 영장류 본도의 평균 직경은 약 150 μm15이다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드 판의 준비 및 섬의 전송<ol>
<li>60 mm x 15mm 세포 배양 접시에 췌도를 수작업으로 골라 조립 된 매체를 함유하여 100 % 순도에 가깝습니다. 참고: 섬은 명확하게 정의 된 주변과 둥근 표시해야하며, 외분비 조직 오염 물질보다 조밀하게 나타납니다. 손상되거나 마모된 것처럼 보이는 섬을 피하십시오. 이 실험에서, 섬 크기는 직접 측정되지 않았습니다, 우리는 각 우물과 샘플에 대해 대략 동등한 크기의 섬을 선택하려고 시도했지만.</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 175 μL의 조립된 용지로 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰을 적재합니다.</li>
		<li>P20 파이펫세트를 15 μL로 설정하여, 세포 배양 접시로부터 15개의 아일렛을 흡인한다. 작은 섬은 육안으로 파이펫 팁에 볼 수 있어야합니다.</li>
		<li>섬을 스페로이드 마이크로 플레이트로 옮기려면, 하부 파이펫 팁을 우물 바닥으로 옮기고, 간신히 들어 올리고, 천천히 매우 작은 부피(~5 μL)를 피펫으로 내보푸세요. 모든 섬이 파이펫 팁을 남겼는지 확인합니다. 각 우물은 15 개의 섬을 받아야합니다. 때때로 현미경의 밑에 spheroid 마이크로 플레이트를 검사하여 섬이 측면에 달라붙지 않고 각 우물의 바닥에 있는지 확인합니다. 참고: 섬으로 코너 우물을로드하지 마십시오. 플라스틱에서 산소와 pH 플럭스는 분석 중에 발생할 수 있으며, 이것은 네 개의 코너 웰에서 악화된다.</li>
		<li>모든 섬이 스페로이드 마이크로플레이트로 옮겨지면, 아래 단계를 완료하면서 37°C,비CO2 인큐베이터에서 마이크로플레이트를 배양한다.</li>
	</ol></li>
	<li>센서 카트리지 로드 및 분석 기 실행<ol>
<li>인큐베이터에서 센서 카트리지를 분리합니다. 각 웰에 대한 포트 A-C는 약물 또는 미디어로 로드되어야 합니다. 섬과 네 개의 코너 웰을 포함하는 우물은 약물로로드해야합니다. 섬이없는 비 코너 우물은 미디어로로드해야합니다. 포트 D는 비워 두면 됩니다. 올리고마이신 또는 매폐의 20 μL로 로드 포트 A(각 센서의 왼쪽 상단). FCCP 또는 용지의 22 μL로 로드 포트 B(오른쪽 상단). 로테네/AA 또는 용지의 25 μL이 있는 로드 포트 C(왼쪽 아래).</li>
		<li>30분 간의 기준선 호흡 주기(5사이클 3분 혼합, 3분 측정), 42분 올리고마이신 측정 주기(3분 혼합 7주기, 3분 측정), 30분 FCCP(3분 혼합 5주기, 3분 측정), 30분 로테노네/AA(3분 혼합 5회, 3분)에 대한 세포외 플럭스 분석기 분석기를 프로그래밍합니다.</li>
		<li>분석기를 실행하고 센서를 교정하고 마이크로 플레이트를 삽입하기 위한 화면의 지침을 따릅니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
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<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

섬 산소 소비의 연구는 이전에 작은 섬의 구형 모양에 의해 방해되었습니다, 배양 표면에 대한 준수의 부족, 그리고 잘 당 필요한 섬의 수. 이 프로토콜에서는 소수의 섬에 대한 섬 산소 소비를 측정하기 위한 96웰 스페로이드 마이크로플레이트의 효능을 강조하고 기술적으로 실현 가능하고 일관된 섬을 취급하고 적재하는 기술을 시연합니다. 결과.
작은 섬이 마이크로 플레이트의 바닥에 부착하고 분석을 통해 혼합 단계 동안 흔들리지 않도록하기 위해, 96 웰 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 접착제 용액으로 코팅된다. 이것은 일반적으로 유익하지만, 섬이 제대로로드되지 않은 경우 그들은 따라서 영향을 미치거나 정확한 측정을 배제, 오히려 바닥보다는 우물의 측면에 충실 할 책임이있다. 이에 대처하기 위해, 우리는 접착제 용액 전용 20 μL의 매우 작은 볼륨으로 우물을 코팅하는 것이 좋습니다. 또한, 우리가 보여주는 파이펫팅 기술은 섬이 우물의 바닥에 로드되고 추가 매체의 흐름에 의해 측면을 ...

정상적인 혈당 수준을 유지하기 위해 췌장 β 세포는 포도당의 고도를 감지하고 그에 따라 인슐린을 분비해야합니다. 포도 당 수준과 인슐린 분 비의 결합은 직접 포도 당 물질 대사와 미토 콘 드리 아 산화 인 산화를 통해 ATP의 생산에 연결. 따라서, 미토콘드리아는 자극 분비 커플링1에서중요한 역할을 한다. β 세포 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 손상한 인슐린 분비로 이끌어 내는 결점을 드러낼 수 있습니다. 췌장 α 세포에 의한 글루카곤의 분비는 또한 미토콘드리아 기능2와밀접하게 연관되어 있다. 불멸의 섬 세포주가 일부 유형의 분석에 유용하다는 것이 입증되었지만, 이들 세포의 생리학은 글루카곤3,4에 의한 인슐린 분비의 전위및 인슐린/소마토스타틴5,6에 의한 글루카곤 분비의 억제에 의해 예시된 바와 같이 전체 섬 기능을 정확하게 회귀하지 는 않는다. 이것은 전체, 그대로 섬을 사용하여 산소 소비를 측정할 필요성을 보여줍니다.
아일렛 세포 호흡측정기 의 측정 기술은 산소에 민감한 형광 염료7의 사용에서 산소 소비를 직접 측정하는 고체 센서에 이르기까지 시간이 지남에 따라 진화해 왔으며8. 처음에 단층, 부착 세포를 위해 설계, 일반적으로 사용되는 세포 배양 플레이트 시스템은 췌장 섬에 효과가 입증되었습니다. 작은 섬이 자연적으로 우물에 부착되지 않기 때문에, 그들은 잘 산소 소비의 부정확한 측정의 결과로 배양의 주변에 밀려되는 경향이있다 9. 이 문제에 대처하기 위해, 섬을 포함 할 수있는 중앙 우울증과 전문 24 웰플레이트는 9개발되었다 . 그러나, 24웰 플레이트 시스템은 필요한 많은 수의 섬들(웰당 50-80)과 동시에10개까지시험될 수 있는 조건의 수에 의해 제한되었다. 최근 스페로이드의 세포외 플럭스 분석을 위해 특별히 설계된 96웰 마이크로플레이트의 개발은 이러한 장벽을 극복하여 웰10당20개 이하의 섬으로 섬 호흡을 측정할 수 있게 되었습니다.
여기서, 우리는 일본 원숭이(마카카 fuscata),인간과유사한 섬 생물학을 가진 동물 모델에서 작은 섬에서 산소 소비를 측정하기 위해이 시스템의 사용을 보여줍니다11,12. 이 프로토콜에서는 15개의 마카크 섬을 웰당 분석합니다. 우리의 손에, 잘 생산 당 15 작은 섬 적은 섬 보다 더 높은 기준선 산소 소비, 강력한 활성화 및 약리학 조작에 대 한 응답에 호흡의 억압. 우리는 분석, 각 우물의 중심에 작은 섬을 일관되게 로딩하기위한 효과적인 방법, 이 분석법을 수행 할 때 일반적인 도전을 준비하는 단계를 강조한다.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 접시, 60mm X 15mm 스타일</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak 세포 및 조직 접착제</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>포도당 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>포도당 용액, 200 mg / ml, 멸균 된</td></tr><tr><td>일회용 저장 탱크 (멸균), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>멀티채널 피펫</td></tr><tr><td>EZFlow Sterile 0.45 로딩용 &mu; m PES 주사기 필터, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 팁</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫, 15-1250 &mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>권장</td></tr><tr><td>P20, P200 및 P1000 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>pH 프로브</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 20 &mu; L, 200 &뮤; L, 1000 &뮤; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 기본 매체</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 세포 미토분 스트레스 테스트 키트</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Oligomycin, FCCP 및 Rotenone/Antimycin A</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 분석기</td><td>포함 Agilent</td><td>S7800B</td><td>37 &deg가 있는 준비 스테이션 포함; C non-CO2 incubator</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 스페로이드 Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>센서 카트리지, 스페로이드 마이크로플레이트 및 캘리브런트 포함</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>주사기(멸균), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>멸균 여과용</td></tr><tr><td>물 (멸균)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

전 생체 췌도와 같은 세포의 스페로이드 클러스터에서 산소 소비의 측정은 역사적으로 도전적이었습니다. 우리는 스페로이드의 산소 소비를 측정하기 위해 설계된 96 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 아일렛 산소 소비의 측정을 보여줍니다. 이 분석에서, 스페로이드 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 및 조직 접착제로 코팅된다. 우리는 소량의 접착제 용액을 사용하여 우물의 바닥만에 대한 밑면 준수를 장려합니다. 분석 당일, 15개의 작은 섬은 최적의 섬 위치와 산소 소비의 정확한 측정을 보장하는 기술을 사용하여 각 우물의 기지에 직접 로드됩니다. 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면은 ATP 의존호흡, 최대 호흡 및 양성자 누출을 포함한 비인간 영장류 아일에서 약리학적으로 조사됩니다. 이 방법을 사용하면 웰당 소수의 섬만 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 볼 수 있습니다. 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에 적용 될 수 있습니다.

작은 섬을 마이크로 플레이트에 로드하려면 그림 1A와같이 15 μL의 용지로 15 개의 섬을 흡인해야합니다. 섬은 자연스럽게 몇 초 이내에 파이펫 팁의 바닥으로 정착합니다. 그런 다음, 파이펫 팁은 웰의 바닥으로 내린다. 팁은 매우 약간 들어 올려지고 작은 부피 (약 5 μL)가 섬과 함께 파이펫아웃됩니다. 이 기술은 정확한 산소 소비 측정을 위해 마이크로 플레이트 의 바닥에 잘(그림 1B)의바닥에 아슬렛의 일관된 배치 결과.
도 2는 분석결과 전반에 걸쳐 산소 소비에 대한 개별웰에 의한 대표적인 결과를 나타낸다. 이 특정 실험은 우물의 바닥이 ...

이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

이 방법은 비인간 영장류 및 인간과 같은 관련 종으로부터 소수의 섬으로부터 산소 소비를 정량화하여 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게 합니다. 이 기술은 소수의 기본 섬으로 수행될 수 있으며, 기술적 복제를 증가시키고, 여러 조건의 테스트를 허용하며, 분석의 엄격함과 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이 기술은 미토콘드리아 건강을 평가, 종종 당뇨병에서 손상되고 성공적인 축전 이식의 중요한 예측인 아슬레 기능 및 인슐린 분비의 주요 결산.섬이 전송 후 우물의 중앙에 국한되어 있는지 확인하는 것이 필수적입니다. 그렇게 하지 않으면 일관되지 않은 산소 소비 측정이 발생합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 일하는 학부 생 발레리 리치아르디(Valerie Ricciardi)가 될 것입니다.분석 전날, 세포 및 조직 접착제 200 마이크로리터를 0.1 의 연체 나트륨 중탄산염 용액의 2.8 밀리리터에 추가하고 96 개의 잘 스페로이드 마이크로 플레이트의 각 우물의 바닥에 결과 용액의 20 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫 팁에서 기포가 제거되었는지 확인합니다. 모든 우물이 적재되면 플레이트를 섭씨 37도비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다.1시간 후, 멸균 환경 내에서 플레이트에서 세포 접착제 용액을 흡착하고 37도 의 400 마이크로리터로 각각 2회 세척합니다. 그런 다음 우물이 30~40분 동안 공기를 건조한 후 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있도록 플레이트를 덮습니다. 센서 카트리지에 수분을 공급하려면 멸균 환경에서 센서 카트리지 패키지를 열고 내용물을 제거합니다.센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓고 유틸리티 플레이트의 각 우물을 멸균 수의 200 마이크로리터로 채웁니다. 모든 우물이 적재되면 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 내리고 조립된 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 하룻밤 사이에 37°C의 비이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 분석 당일, 센서 카트리지 뚜껑을 제거하고 유틸리티 플레이트의 우물에서 물을 데수수있습니다.각 웰에 200 밀리리터의 미리 조립된 교정기를 추가하고 센서 카트리지 뚜껑을 교체합니다. 그런 다음 센서 카트리지를 인큐베이터에 약 1시간 동안 다시 배치합니다. 이적을 위해 섬을 준비하려면, 손으로 약 100 % 순도에 조립 된 매체를 포함하는 60 15 밀리미터 세포 배양 접시로 섬을 선택합니다.모든 섬이 수집되면, 조립된 배지175마이크로리터를 제조된 스페로이드 마이크로플레이트의 각 우물을 적재하고, 15마이크로리터로 설정된 P20 파이펫을 사용하여 세포 배양 접시로부터 15마이크로리터의 배지15개 섬으로 흡인한다. 섬섬을 스페로이드 마이크로 플레이트에 시드하려면 파이펫 팁을 우물 바닥으로 낮추고 팁을 거의 들어 올리고 약 5 마이크로리터의 중간 을 천천히 분배합니다. 섬섬을 우물에 적재하려면 섬이 파이펫 끝에 정착한 후 소량의 매체로 웰 센터 의 바닥 바로 위에 부드럽게 놓습니다.모든 섬이 파이펫 팁을 남겼는지 확인하고, 때때로 현미경의 밑에 스페로이드 마이크로 플레이트를 확인하여 섬이 접시 의 바닥에 씨를 뿌리고 우물의 측면에 붙어 있지 않다는 것을 확인합니다. 모든 섬이 옮겨지면 마이크로플레이트를 섭씨 37도비이산화탄소 인큐베이터에 놓습니다. 분석 절차를 시작하기 전에 센서 카트리지의 포트 A를 45 마이크로리터로 로드하고, 포트 B는 갓 준비된 10 마이크로몰라 FCCP 22마이크로리터를, 포트 C는 25마이크로몰라 로테네 AA를 새로 준비했다. 다음으로, 세포외 플럭스 분석기 분석기를 30분 기준선 호흡 기간, 42분 올리고마이신 측정 기간, 30분 FCCP 기간 및 30분 로테네 AA 기간에 대해 프로그래밍한다.그런 다음 센서를 보정하고 마이크로 플레이트를 삽입하기 위해 화면의 지침에 따라 분석서를 실행합니다. 분석 판으로 섬 전달의 경우, 15개의 섬이 도시된 바와 같이 15개의 마이크로리터에서 흡량해야 한다. 이 기술은 각 마이크로 플레이트의 하단 중앙에 섬섬을 일관되게 배치하여 정확한 산소 소비 측정을 가능하게 합니다.개별 우물의 산소 소비를 보여주는 이 대표적인 실험에서는, 우물은 산소 소비의 아주 낮은 기준수준 및 FCCP에 대한 반응의 거의 또는 전혀 결과로 제대로 로드되지 않았습니다. 이 실험에서, 우물의 대부분은 약물에 중요한 기준선 호흡 및 반응을 입증했습니다. 그러나, 두 개의 우물로테네론에 아무 응답도 전시, 약물이 제대로 우물로 출시 되지 않은 제안.이 우물은 추가 분석에서 제외되었습니다. 여기서, 우물이 섬으로 제대로 로드되고 약물을 올바르게 주입한 성공적인 분석결과의 결과를 관찰할 수 있다. 분석 작업을 수행하기 전날 시약및 플레이트를 준비하여 섬이 고립되거나 수신된 직후에 사용할 수 있도록 하는 것이 유익하다.분석에 이어, 섬은 단백질 또는 DNA 추출을 위해 회수되어 산소 소비 데이터를 정상화하거나 미토콘드리아 DNA 함량을 정량화할 수 있다. 일차 영장류 섬의 작은 숫자에서 미토콘드리아 기능을 측정하는 기능은 단일 생물학적 복제에서 다중 약물 및 기타 조작의 테스트를 허용합니다. 1 차 영장류 섬으로 일하는 개인은 이러한 조직과 적절하고 안전한 취급에 훈련을해야합니다.특히, 적절한 개인 보호 장비의 사용과 이러한 샘플의 적절한 폐기.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

랑게르한스의 고립 된 마우스 독도를 이용하여 체외 β-세포 기능을 시금 당뇨병의 병태 생리 및 치료의 연구에 중요한 구성 요소입니다. 많은 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있지만,이 프로토콜은 특히 β-세포의 기능을 결정하는 중요한 매개 변수로 세포 내 순환 아데노신 monophosphate (캠프)의 측정에 대해 설명합니다.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

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정맥 당부 하 검사와 비인간 영장류의 대사 상태의 특성

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

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배우세요 비인간 영장류 췌도 산소 소비 측정 방법으로 미토콘드리아 기능과 인슐린 분비 능력을 평가하는 기술입니다. 소량의 췌도로도 정확한 분석이 가능하여 당뇨병 연구와 췌도 이식 연구에 활용됩니다.

비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석

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