Name: 질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 학습하세요 인간화된 NOG 마우스를 이용한 질 내 HIV 노출 및 감염 치료 프로토콜입니다. 줄기세포 이식, 디지털 PCR 바이러스량 정량, CCR5 변이 분석을 통해 전임상 HIV 연구를 수행할 수 있습니다.

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저자는 오르후스 대학의 생물 의학 동물 시설 직원, 특히 식민지 유지 보수 노력과 마우스 무게를 추적하기위한 Jani Kær 씨에게 감사드립니다. 저자는 표준 치료 cART를 개발하고 지도에 대한 플로리안 클라인 교수에게 감사드립니다. 다음 시약은 NIH 에이즈 시약 프로그램, 에이즈 학과, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (고양이# 11744) 존 카페스 박사와 크리스티나 오크센바우어 박사를 통해 얻어졌습니다.

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저자는 이해 관계의 충돌을 선언하지 않습니다.

가혹하게 면역 손상된 마우스 변형 NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac(NOG)는 인간 세포 및 조직의 이식에 매우 적합합니다. 이 마우스에 있는 선천적이고 적응적인 면역 통로 둘 다 손상됩니다. NOG 및 NSG 마우스는 결함이 있는 T 및 B 세포 기능을 초래하는 Prkdcscid 돌연변이를 품고 있습니다. 더욱이, 이들 마우스는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21과 같은 많은 주요 사이토카인의 결합 복합체에 없어서는 안 될 기능적인 인터류킨-2 수용체 γ사슬(common gamma chain, IL2rg)이 결여되어 있다. NOG와 같은 면역 결핍 마우스는 인간 면역 계통으로 이식되어 HIV 전염 및 면역학 연구를 위한 강력한 도구입니다. 인간화된 마우스를 이용하여 이루어진 이러한 분야에서의 기여는2,...

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 전 세계적으로 3,700 만 명 이상의 감염된 개인을 가진 만성감염입니다 1. 조합 항 바이러스 치료 (cART)는 생명을 구하는 치료이지만 치료법은 여전히 보증됩니다. 따라서, HIV에서 지속적인 연구를 촉진하기 위해 인간의 면역 체계와 그 반응을 반영하는 동물 모델에 대한 필요성이 있다. 세포 및 조직 생착을 지원할 수 있는 여러 종류의 인간화된 마우스는 인간 세포를 중증 면역결핍 마우스2로이식함으로써 개발되었다. 이러한 인간화 마우스는 HIV 감염에 취약하고 비인간 영장류보다 저렴하고 사용하기 쉽기 때문에 비인간 영장류 시미안 면역 결핍 바이러스 모델에 대한 중요한 대안을 제공합니다. 인간화 된 마우스는 HIV 바이러스 성 전염, 병인, 예방및 치료3,4,5,6,7,8,9,10, 11에서연구를 촉진했다.
우리는 NOD의 마우스로 코드 혈액 파생 인간 줄기 세포를 이식하여 개발 된 HIV 연구를위한 유연한 인간화 모델 시스템을 제시한다. Cg-Prkdc는Il2rgtm1Sug/ JicTac (NOG) 배경을scid. 비 태아 기원의 외, 이 마우스의 실제적인 생물 공학은 혈액 간 흉선 (BLT) 구조물의 이식에 관련시킨 마이크로 외과 적 절차에 비해 기술적으로 덜 까다롭습니다.
우리는 질 내 전송을 통해 HIV 감염을 확립하는 방법과 민감한 액적 디지털 PCR (ddPCR) 기반 설정으로 플라즈마 바이러스 부하를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 매일 마우스 다이어트의 일환으로 주어진 표준 cART의 설립을 설명합니다. 이러한 결합 된 방법의 목적은 동물에 대한 스트레스를 줄이고 각 동물을 처리하는 데 소요되는 시간이 제한되어 있는 대규모 실험을 용이하게하는것입니다 12.
인간에서는, CCR5Δ32/wt 또는 CCR5Δ32/Δ32 유전자형은 송신기/창시자 바이러스13를가진 HIV 감염에 감소된 감수성을 일으키는 원인이 되고, 몇몇 예방조치는 HIV 연구 결과의 목적을 위해 줄기 세포를 가진 생명 공학 인간화한 마우스를 취할 필요가 있습니다. 이것은 CCR5 유전자, 특히 Δ32 삭제에서 자연적으로 발생하는 변이체가 스칸디나비아 및 발트 원주민 인구에서 세계14,15의나머지 부분에 비해 더 널리 퍼져 있기 때문에 우리 지역에서 특히 그렇습니다. 따라서, 당사의 프로토콜은 이식 전에 CCR5 변이체에 대한 공여자 조혈 줄기 세포를 스크리닝하기 위한 쉬운, 높은 처리량 분석방법을 포함한다.
질 내 노출을 위해 우리는 감염의 초기 단계에서 여자에게서 격리된 송신기/창시자 R5 바이러스 RHPA4259를 선택했습니다16. 우리는 마우스의 대다수에 있는 성공적인 전송을 산출하기 위하여 충분한 바이러스성 복용량에 마우스를 노출했습니다, 그러나 100% 전송 비율 의 밑에. 이러한 투여량을 선택하면 약물 후보의 항 바이러스 효과가 HIV 예방 실험에서 보호 된 동물을 초래할 수 있고 치료 연구를위한 바이러스 부하가 감소 할 수 있도록 전송 속도에서 충분한 동적 범위를 가능하게합니다.

<table><tbody><tr><td>파란색 패드</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>사용 전에 멸균해야 합니다</td></tr>: <tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19(클론 sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3(클론 OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3(클론 SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34(클론 AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (클론 SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (클론 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (클론 RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>현탁액 완충액</td></tr><tr><td>dNTP mix</td>용 <td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 인간 제대혈 CD34 포지티브 선택 키트 II</td><td>줄기세포</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS 용해 용액 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>사용 직전 dH20에 1:10 희석</td></tr><tr><td>FACS 튜브(Falcon 5mL round-botton)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Fc 수용체 차단 용액(Human Trustain FcX)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Mesoft</td><td>157300</td><td>사용 전에 멸균해야 합니다</td></tr><tr><td>. 가열 램프</td><td></td><td></td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>헤마사이미터(B&uuml; rker-T&uuml; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 가스</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 유세포 분석기</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, PCR-PT 승인</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>마우스 cART 식품</td><td>ssniff Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>맞춤형 제품</td><td></td></tr><tr><td>마우스 구속기</td><td></td><td>맞춤형 제품</td><td></td></tr><tr><td>Needle, Microlance 3, 30G &frac12; "</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>NOG 마우스 NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>VWR 화학 물질</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 바이러스 DNA 및 RNA 분리 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>PCR 승인 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA 중합효소</td><td>Life Technologies</td><td>F549S</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, sterile, ART 20P Barrier</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>100005398</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft 소프트웨어</td><td>, Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QX100 액적 발생기</td>, <td>Bio-Rad</td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100 액적 리더</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 용액</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNAse 크기 F + 반응 버퍼</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>H20</td></tr><tr><td>Softject 1 mL 주사기</td>에 용해<td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Trypane blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (바이러스 소독제)</td><td>듀퐁</td><td>7511</td><td></td></tr></tbody></table>년

질 내 hiv 노출 및 hiv 감염 치료를 위한 인간화된 nog 마우스

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

인간화된 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 바이러스학을 공부하고 항 바이러스 약물을 테스트하는 정교한 플랫폼을 제공합니다. 이 프로토콜은 성인 NOG 마우스에서 인간 면역 계통의 확립을 기술한다. 여기에서, 우리는 탯줄 혈액 유래 인간 CD34+ 세포의 격리에서 마우스로의 그들의 후속 정맥 이식, HIV 감염을 통해 모델의 조작에, 조합 antiretroviral 치료의 모든 실용적인 단계를 설명합니다 ( cART) 및 혈액 샘플링. 대략 75,000 hCD34+ 세포는 마우스로 정맥 주사되고 인간화로 알려져 있는 인간적인 키메증의 수준, 말초 혈액에서 유동 세포측정에 의해 달 동안 세로로 추정됩니다. 총 75,000 hCD34+ 세포는 말초 혈액에서 20%-50% 인간 CD45+ 세포를 산출합니다. 마우스는 HIV를 가진 질 내 감염에 영향을 받기 쉽습니다 및 혈액은 분석을 위해 매주 한 번, 그리고 연장된 기간 동안 매달 두 번 샘플링될 수 있습니다. 이 프로토콜은 액적 디지털 PCR(ddPCR)을 사용하여 플라즈마 바이러스 부하의 정량화를 위한 분석서를 기술한다. 우리는 마우스가 규정식에 있는 배려의 표준 cART 식이요법으로 효과적으로 취급될 수 있는 방법을 보여줍니다. 일반 마우스 차우의 형태로 cART의 전달은 실험 모델의 중요한 정제이다. 이 모형은 새로운 처리 및 HIV 치료 전략의 시험을 위해 뿐만 아니라 전신 및 국소 전노출 예방 화합물의 전임상 분석을 위해 이용될 수 있습니다.

줄기세포 순도 분석을 위한 게이팅 전략은 도 1에도시되어 있다. 도 1A-C는 정제된 CD34+ 인구 및 도 1D-F-흐름-CD34-흐름-절연 과정에서 CD34+ 인구의 최소량이 손실된다는 것을 설명하기 위해 사용된다. 단리된 CD34+ 줄기 세포의 순도는 85%-95% 사이였으며 1% 미만의 T 세포 오염을 가하였다. 그림 1G는 CCR5Δ32/wt 유전자형을 가진 1명의 성인 인간 통제 기증자에서 CCR5 밴드를, 2개의 CCR5wt/wt 및 1개의 CCR5Δ32/wt ...

우리는 줄기 세포 이식, 질 내 인간 면역 결핍 바이러스 노출 및 액적 디지털 PCR RNA를 기반으로 인간화 및 인간 면역 결핍 바이러스 감염 NOG 마우스 모델의 생성 및 평가를위한 프로토콜을 개발했습니다. 정량화.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

이 인간화된 마우스 모형을 설치하는 것은 전임상 HIV 연구 결과에 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 다른 바이러스성 긴장 및 새로운 HIV 내정간섭 둘 다 평가될 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 줄기 세포 기증자 CCR5 변이체 상태를 평가하고 HIV로 인간화된 마우스를 효율적으로 감염시키고 마우스 플라즈마 바이러스 부하를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.RNA 정량화 프로토콜은 플라즈마 샘플에서 검출가능한 임의의 바이러스 RNA 시퀀스를 정량화하기 위해 쉽게 적응될 수 있다. CCR5 델타 32 변이체에 대한 코드 혈액 샘플의 유전자 검사를 위해, 200 마이크로 몰러 dNTP 믹스를 포함하는 PCR 믹스의 11.25 마이크로 리터와 비 펠렛 유량의 1.25 마이크로 리터를 배양, 높은 충실도 DNA 폴리머라제의 마이크로 리터 당 0.01 단위, 및 전방 및 역 프라이머. 각 PCR 반응에 대해 핵이 없는 물로 부피를 약 12.5 마이크로리터로 조정하고 테이블에 표시된 PCR 사이클링 프로그램으로 게놈 조각을 증폭시한다.반응의 끝에서, 2 %아가 로즈 젤에 PCR 제품을 분리. 야생형 알레일과 델타 32 알렐의 PCR 제품은 각각 196개의 베이스 페어와 164개의 베이스 쌍의 PCR 조각을 생성하여 젤 전기포고증으로 밴드를 쉽게 구별할 수 있게 합니다. 질 내 HIV 노출의 경우, 마우스가 있는 작업 공간의 중심에 초점을 맞춘 가열 램프를 놓고 멸균 20 마이크로리터 파이펫 팁을 후드에 적절한 파이펫에 넣습니다.바이러스와 접촉한 모든 재료와 액체의 즉각적인 비활성화를 위해 액체 소독제를 가진 용기를 후드에 넣습니다. 마취된 마우스를 후드 의 뒷면을 향한 마우스의 꼬리와 램프 아래에 멸균 된 파란색 패드에 놓고 마우스의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 꼬리 의 바닥에 동물을 잡아.꼬리 베이스로 마우스를 부드럽게 들어 올리고, 거꾸로 업라이트 위치에서 동물을 지원합니다. 멸균 파이프 팁을 사용하여 항문쪽으로 부드럽게 쓰다듬어 생식기 부위를 자극하여 직장의 비우기를 유도하고 질에 대한 압력을 완화하십시오. 질 개구부를 노출하려면 외음부가 자연스럽게 열리는 등 마우스 꼬리를 손가락에 조심스럽게 감쌉니다.새로운 파이펫 팁을 사용하여, 질 개구부의 수준에 팁을 놓고 외상으로 질로 바이러스의 20 마이크로 리터를 방출하여 중력이 바이러스 현탁액을 질로 끌어 들입니다. 모든 바이러스가 전달되면 중력 유

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)에 감염된 인간화 마우스 모델에서 경구용 복합 항레트로바이러스 요법(구강 cART)의 효과를 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(nucleoside reverse transcriptase inhibitors) 및 인테그라제 가닥 전달 억제제(integrase strand transfer inhibitors)를 포함하여 HIV-1을 표적으로 하는 약물을 영양 보충제 및 항생제와 함께 투여합니다. HIV-1에 감염된 인간화 마우스가 이 혼합물을 섭취한 후, 마우스에 대한 주기적인 검사를 통해 바이러스 복제의 효과적인 억제를 평가합니다.

인간화 마우스 모델에서 HIV-1 감염을 치료하기 위한 경구용 복합 항레트로바이러스 요법

이 비디오는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV)에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 마우스 모델을 생성하는 기술을 보여줍니다. 인간 태아 흉선 조직과 조작된 조혈모세포(HSC)는 면역이 심하게 저하된 쥐의 신장 캡슐에 이식됩니다. HIV에 대항하여 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 HSC는 흉선 조직과의 공동 국소화를 촉진하는 젤라틴 단백질 혼합물에 혼합되어 있습니다. 시술 후 HSC는 다양한 인간 면역 세포로 분화되어 HIV에 대한 기능적 인간 면역 체계를 가진 인간화 마우스 모델을 개발합니다.

HIV에 대한 공학적 면역을 가진 인간화 마우스 모델 구축

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

여기에 기술된 것은 인간화된 마우스에 있는 HIV 감염의 역학을 공부하기 위한 3개의 실험적인 접근입니다. 첫 번째는 만성 감염 사건의 연구를 허용하는 반면, 두 후자는 1 차감염 또는 바이러스 재활성화 후 급성 사건의 연구를 허용합니다.

인간화 면역 결핍 마우스 모델에서 만성, 급성 및 재활성화 HIV 감염

이 프로토콜은 인간화 마우스에서 HIV-1 RNA 복제를 성공적으로 억제하는 경구 조합 항레트로바이러스 약물을 전달하는 새로운 방법을 설명합니다.

HIV-1에 감염된 인간화 마우스에서 경구 조합 항레트로바이러스 치료

이 프로토콜은 EcoHIV 감염과 Tmem119-EGFP 마우스의 조합이 HIV 관련 신경인지 장애의 설치류 모델에서 미세아교세포 변형 및 바이러스 저장소를 조사하기 위한 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 방법을 설명합니다.

Microglia-Manipulated Transgenic Mice에서 EcoHIV 감염 세포 식별

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

학습하세요 인간화된 NOG 마우스를 이용한 질 내 HIV 노출 및 감염 치료 프로토콜입니다. 줄기세포 이식, 디지털 PCR 바이러스량 정량, CCR5 변이 분석을 통해 전임상 HIV 연구를 수행할 수 있습니다.

질 내 HIV 노출 및 HIV 감염 치료를 위한 인간화된 NOG 마우스

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