Name: 단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 학습하세요 Nicotiana benthamiana에서 NLR 면역 수용체의 상호작용 파트너를 식별하는 TurboID 근접 라벨링 방법을. 이 기술은 식물 단백질-단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 사업은 국립 트랜스제닉 과학 기술 프로그램(2019ZX08010-003 ~ Y.Z.), 중국 국립 자연과학 재단(31872637 ~ Y.Z.), 중앙대학 기초연구기금(2019TC028 ~Y.Z.), NSF-IOS-1344의 보조금으로 지원되었다. NSF-IOS-1339185 및 NIH-GM132582-01~ S.P.D.K.

참고: 메서드의 개요는 그림 1에나와 있습니다.
1. 식물 재료 준비
<ol><li>고밀도로 젖은 토양에서 N. 벤타미아나 씨앗을 재배하고 23-25 °C에서 16 h 빛 (약 75 μmol /m2s) 및 8 h 어두운 광주기를 가진 기후 챔버에서 유지합니다.</li>
	<li>약 1 주일 후, 조심스럽게 4 'x 4'냄비에 각 젊은 묘목을 전송하고 같은 챔버에 묘목을 유지.</li>
	<li>약 4주 동안 챔버내식물을 유지하여 후속농윤(15)을위해 4-8의 잎 단계로 자랄 때까지 유지한다.</li>
</ol>2. 터보 ID 융합의 건설
<ol><li>표준 분자 복제 기술을 사용하여 목표 단백질과 터보ID(아드진 플라스미드 #107177 PCR TurboID)와 의 융합을 생성합니다. 여기서, 우리는 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인을 관심의 표적 단백질로 사용하고 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어 하에 터보ID에 융합된 TIR을 구성하였다(p35S::TIR-TurboID). 참고: 터보ID 효소를 표적 단백질의 카르복실-종단 또는 아미노 말단에 융합하는 것은 관심 있는 단백질에 의존할 것이다. 보통, 세포질 단백질의 경우, 터보ID 융합이 표적 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 한, 두 테르미니는 모두 허용되어야 한다. 그러나, 막 국한 된 단백질의 경우, 단백질 토폴로지는 터보 ID 융합에 가장 적합한 종단을 결정하기 전에 사전에 특성화되어야합니다.</li>
	<li>후속 정량적 프로테오믹 분석을 위한 대조군역할을 하는 동일한 프로모터 하에서 TurboID 융합 시트린을 구성한다. 참고: 표적 단백질에 대한 프로테오메 근위를 확인하기 위한 TurboID 제어를 구성하는 것이 중요합니다. TurboID 융합 대조군은 TurboID 융합 표적 단백질의 발현 수준과 유사한 발현 수준을 나타내야 한다. 이것은 아그로인침투 동안 아그로박테리움 농도를 조절하여 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 대조군 단백질이 관심 있는 표적 단백질과 유사한 세포내 국소화 패턴을 가지는 것이 중요하다.</li>
</ol>3. 농업 여과
<ol><li>플라스미드를 아그로박테리움으로 의한 변형
	<ol>
<li>아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101의 단계 2.1 및 2.2~50 μL로부터 생성된 플라스미드의 0.5 μg을 추가, 앞서16에기재된 바와 같이 제조하였다. 참고 : GV2260과 같은 다른 아그로 박테리움 균주도 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>얼음에 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>60s에 대한 42 °C에서 수조에서 열 충격.</li>
		<li>400 μL의 LB 배지(10 g/L 트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl; pH = 7.0)를 아그로박테리움에 넣고 90분 동안 28°C에서 배양합니다.</li>
		<li>LB 한천에 튜브의 전체 함량을 플레이트 플라스미드를 선택하기 위해 적절한 항생제로 보충, 뿐만 아니라 아그로 박테리움 (GV3101 : 50 mg / L gentamicin 및 50 mg / L 리팜피신).</li>
		<li>개별 식민지가 보일 때까지 36-48 시간 동안 28 °C에서 플레이트를 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>항생제 (단계 3.1.5 참조)와 신선한 LB 한천 접시에 여러 개별 식민지를 선택하고 줄무늬와 28 °C에서 하룻밤 성장. 참고 : 아그로 박테리움에서특정 이진 구문의 존재를 확인하기 위해 콜로니 PCR을 수행하는 것이 더 최적입니다. 우리의 경험에서, 식민지의 95 % 이상은 도입 된 바이너리 구문이 포함되어 있습니다.</li>
	<li>LB 배지의 3 mL플러스 적절한 항생제(단계 3.1.4 참조)를 관심의 구성을 항구하는 아그로박테리움 콜로니와 접종하고, 아그로박테리움 배양물의 OD600이 2.0에 도달할 때까지 28°C에서 밤새 흔들어 배양한다.</li>
	<li>세포를 3,000 x g에서 원심분리하고 아그로인침투 완충제에서 OD600 = 1.0으로 재중단한다(10 mM MgCl2,10 mM MES [pH = 5.6], 250 μM 아세토시링곤). 참고: 아그로인침투 전에 RT에서 2시간 동안 접종을 배양하는 것이 최적이지만, GV3101 균주에 대한 우리의 경험에서, 배양 없이 표적 단백질 발현 사이에 큰 차이가 없었다.</li>
	<li>완전 성숙한 N. 벤타미아나 잎의 (abaxial) 표피에 접종을 침투시키기 위해 1 mL 바늘리스 주사기를 사용한다. 참고 : 세 가지 생물학적 복제에 대한 잎 재료의 충분한 양을 준비하기 위해 : 전체 잎은 일반적으로 침투, 세 잎은 식물 당 침투하고, 3 ~ 4 식물은 각 구조에 사용됩니다. 각 잎에 대 한, 1.5-2.0 재 중단 된 아그로 박테리아의 mL충분 하다.</li>
	<li>36시간 후 침투 후(hpi), 200 μM 비오틴(10 mM MgCl2 용액)을 TurboID 구도로 미리 침투한 잎에 침투시다.</li>
	<li>섹션 4에 설명된 바와 같이 잎 조직을 수확하기 전에 추가로 3-12 시간 동안 식물을 유지하십시오. 참고: 비오틴 침윤을 위한 36 hpi를 선택하는 이유는 이전 연구11에의하면 이 시점에서 표적 단백질 발현이 최고조에 달하기 때문이다. 관심 있는 표적 단백질의 최적 발현에 필요한 시간을 결정하는 것이 좋습니다. 인큐베이션 시간 포스트 비오틴 침윤은 연구 하에 실험 설계 및 표적 단백질에 의존한다. 보통, 비오틴 치료의 3-12 시간 터보 ID 융합에 의해 표적 단백질에 근접 대부분의 단백질의 라벨을 허용.</li>
</ol>4. 잎 샘플 수집
참고: 잎 샘플의 후속 처리를 위해 멸균 장갑을 착용하여 시료의 각질 오염을 방지하십시오. 모든 시약은 가능한 한 각질이 없어야 합니다.
<ol><li>잎자루의 기지에서 침투 된 잎을 자르고 잎 정맥을 제거 한 다음 액체 질소로 잎 조직을 플래시 동결시.</li>
	<li>유봉 및 모르타르를 사용하여 잎 조직을 갈아서 잎 분말을 15 mL 또는 50 mL 매 튜브에 -80°C에서 저장하여 후속 사용을 위해 사용한다. 참고 : 다른 식물에서 세 가지 생물학적 복제의 각각에 대한 잎의 3 ~ 4 조각을 가져 가라. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 후속 단계에 앞서, 면역블롯 분석에 의해 표적 단백질의 단백질 발현 및 생체측을 평가하는 것이 좋습니다. 전형적인 웨스턴 블롯은 그림 2에나와 있습니다.</li>
</ol>5. 잎 총 단백질 추출
<ol><li>약 0.35 g의 잎 가루를 2 mL 튜브로 옮긴다. 각 샘플에 대해 두 개의 튜브를 준비합니다. 주의: 액체 질소로 냉각된 물체를 만지면 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>RIPA 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl [pH = 7.5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % NP40 [v /v], 0.1 % SDS [w /v], 0.5 % 나트륨 deoxycholate [w /v], 1 mM DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 1 정) 잎 분말 0.35 g.</li>
	<li>10 분 동안 튜브를 소용돌이.</li>
	<li>샘플을 얼음위에 30분 그대로 둡니다.</li>
	<li>튜브를 여러 번 거꾸로 뒤집어 서 4-5 분마다 내용물과 섞습니다.</li>
</ol>6. 탈염에 의한 무료 비오틴 제거
참고: 이 섹션은 약 50분 정도 소요됩니다.
<ol><li>탈염 열을 평형화합니다.<ol>
<li>탈염 컬럼 의 하단에있는 실러를 제거하고 50mL 튜브에 컬럼을 넣습니다.</li>
		<li>1000 x g 및 4 °C에서 원심 분리하여 2 분 동안 저장 용액을 제거하고 뚜껑이 느슨해지도록하십시오.</li>
		<li>탈염 컬럼을 50 mL 튜브에 넣습니다. RIPA 용해 완충액 5 mL로 컬럼을 3x 평형화하고, 매번 1000 x g및 4°C에서 원심분리를 2분 동안 하고 유동을 폐기한다.</li>
		<li>탈염 컬럼을 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 후속 사용을 위해 4°C에서 일시적으로 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>16,500 x g및 4 °C에서 5.4 단계에서 튜브를 10 분 동안 회전시키고 두 튜브에서 상류를 새로운 2 mL 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>1,500 μL의 단백질 추출물을 평형 탈염 컬럼의 수지 의 상부에 첨가합니다(6.1.4단계). 단백질 추출물이 수지에 들어가면 RIPA 라시스 완충액100 μL을 추가합니다. 참고: 1,400 μL의 RIPA 용해 완충액이 잎에서 단백질 추출에 사용되었지만, 단백질 추출 및 탈염 후 총 부피는 원래 의 부피에 비해 어느 정도 변함없이 증가했습니다. 따라서, 단계 5.1 및 5.4에 기재된 바와 같이 각 그룹에서 샘플의 조합은 샘플당 적어도 1,500 μL의 단백질 추출물을 초래할 수 있다.</li>
	<li>1000 x g 및 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리를 하고 탈염 된 샘플을 얼음에 일시적으로 둡니다.</li>
</ol>7. 브래드포드 분석서를 사용하여 탈염 단백질 추출물의 정량화
<ol><li>각 그라데이션 BSA 솔루션의 50 μL을 준비하십시오: 0 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL, 및 1 mg/mL.</li>
	<li>5 μL 샘플을 ddH2O의 45 μL과 혼합하여 탈염 단백질 추출물을 희석시켰다.</li>
	<li>5x 브래드포드 리젠트(쿠마시 브릴리언트 블루 G250 100 mg, 메탄올 47mL, 85% 인산 100 mL, ddH2O 53 mL)를 희석하여 1x 브래드포드 리젠트를 준비합니다.</li>
	<li>각 그라데이션 BSA 용액 50 μL과 희석된 단백질 추출물 50 μL을 1x 브래드포드 리젠트의 2.5 mL에 첨가합니다.</li>
	<li>RT에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>ELISA 플레이트의 한 웰에 각 샘플의 용액 200 μL을 추가합니다(샘플당 3개의 기술 복제).</li>
	<li>마이크로 플레이트 리더를 사용하여 OD595를 측정합니다.</li>
	<li>그라데이션 BSA 용액의 값을 기반으로 표준 곡선을 그리고 탈염 된 단백질 샘플의 농도를 계산합니다. 보통, 잎의 0.7 g에서 얻은 총 단백질 농도 범위에서 3-6 mg/mL.</li>
	<li>후속 친화성 정제를 위해 6-8 mg의 탈염 단백질 추출물을 준비하십시오.</li>
</ol>8. 생체 질화 단백질의 농축
<ol><li>스트렙타비덴-C1-컨쥬게이징 된 자기 비드 200 μL을 2 mL 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>RT에서 1 분 동안 RIPA 용해 완충액 1 mL로 스트렙 타비덴 -C1-컨쥬게이트 된 자기 구슬을 평형화하십시오.</li>
	<li>세척 할 때마다 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 3 분 동안 흡착하고 파이펫팅으로 용액을 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>8.2 단계와 8.3단계를 반복합니다.</li>
	<li>탈염 된 단백질 추출물을 평형 성수연-C1-컨쥬게이스 자기 구슬로 옮김.</li>
	<li>튜브를 4°C에서 12시간(또는 하룻밤)에 인큐베이션하여 생체티니화 단백질을 화결화하여 화결단백질을 화결시켰다.</li>
	<li>구슬이 튜브의 한쪽에서 수집 될 때까지 RT에서 4 분 동안 자기 랙에 구슬을 캡처 한 다음 부드럽게 파이펫에 의해 상급을 제거합니다.</li>
	<li>튜브에 세척 버퍼 I (물에 2 % SDS)의 1.7 mL를 추가하고 8 분 동안 RT에서 회전자에 보관하십시오. 8.3 반복 단계.</li>
	<li>세척 버퍼 II (50 mM HEPES : pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 % 데옥시콜산 [w /v], 1% 트리톤 X-100)를 튜브에 넣고 8 분 동안 RT에서 회전자위에 보관하십시오.</li>
	<li>세척 버퍼 III 의 1.7 mL을 추가 (10 mM 트리스-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% 데옥시콜산 [w/v]), 1% NP40 [v/v]) 튜브에 8 분 동안 RT에서 회전자에 유지. 8.3 반복 단계.</li>
	<li>50 mM Tris-HCl (pH = 7.5)의 1.7 mL를 추가하여 세제를 제거한 다음 8.3 단계를 반복합니다.</li>
	<li>구슬을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 8.11 및 8.3 단계를 반복합니다.</li>
	<li>RT에서 50 mM 암모늄 중탄산염 완충액으로 구슬을 5 분 동안 6 x 씻어 내보소.</li>
	<li>자기 구슬에 50 mM 의 암모늄 중탄산염 버퍼 1 mL을 추가하고 잘 섞습니다.</li>
	<li>면역블롯 분석을 위해 100 μL의 구슬을 제거하여 생체 면역 단백질의 농축을 확인합니다. 그림 3에전형적인 웨스턴 블롯이 나와 있습니다.</li>
	<li>나머지 단백질 샘플을 플래시 동결시키고 -80°C에 저장하거나 드라이 아이스에서 LC-MS/MS 분석을 위해 즉시 보냅니다. 참고: 일반적인 MS 결과는 이전 간행물에 표시됩니다(Zhang et al. 2019; 그림 2, 보충 데이터 1 및 보충 데이터 2)11. 전체 데이터 집합은 식별자를 사용하여 MassIVE(http://massive.ucsd.edu>)에서 사용할 수 있습니다: MSV000083018 및 MSV000083019.</li>
</ol>

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<li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
<li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+labeling+of+interacting+proteins%3A+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

터보ID 비오틴 리가제는 바이오ID10의효모 디스플레이 기반 의 방향 진화에 의해 생성된다. 그것은 다른 PL 효소에 비해 많은 장점을 갖는다. TurboID는 최적의 성장 온도가 약 25 °C10인파리와 웜을 포함한 다른 모델 시스템에 PL을 적용 할 수 있습니다. PL 접근법은 동물 시스템에서 널리 사용되어 왔지만 식물에서의 적용은 제한적입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 식물-병원체 상호 작용 연구에서 널리 사용되고 있는 모델 공장인 N. 벤타미아나에TurboID 기반 PL을 확립하기 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 잎 샘플 준비, 자유 비오틴 제거, 추출된 단백질의 정량화 및 생체 티니화 단백질의 농축을 설명합니다.
동물 세포 배양 시스템에서 자유 비오틴은 PBS 완충액4로세포를 세척함으로써 크게 제거될 수 있지만, ...

PPI는 다양한 세포 과정의 기초입니다. PPI를 확인하기 위한 전통적인 방법은 질량 분석법 (IP-MS)와 결합된 효모 2 하이브리드 (Y2H) 검열 및 면역침전을 포함합니다 1. 그러나 둘 다 몇 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 예를 들어, Y2H 스크리닝은 표적 식물 또는 동물 종의 Y2H 라이브러리의 가용성을 요구한다. 이 도서관의 건설은 노동 집약적이고 비싸다. 더욱이, Y2H 접근법은 더 높은 진핵 세포의 세포 상태를 나타내지 않을 수 있는 이종 단세포 진핵 생물 효모에서 수행된다.
대조적으로, IP-MS는 일시적 또는 약한 PPI를 포착하는 데 있어 낮은 효율을 나타내며, 또한 낮은 풍부하거나 높은 소수성을 가진 단백질에 적합하지 않다. 수용체 같이 키나아제 (RLKs) 또는 면역 수용체의 NLR 가족과 같은 식물 신호 통로에서 관련시킨 많은 중요한 단백질은 낮은 수준에서 표현되고 수시로 그밖 단백질과 일시적으로 상호 작용합니다. 따라서, 그것은 크게 이러한 단백질의 조절의 기본 메커니즘의 이해를 제한.
최근에는 엔지니어링된 아스코르베이트 과산화수산아제(APEX)와 돌연변이 대장균 리게틴 리가제 비라R118G(BioID로 알려짐)에 기초한 근접 라벨링(PL) 방법이 개발되어 PPIs2,3,4의,4연구에 활용되고 있다. PL의 원리는 관심있는 표적 단백질이 효소와 융합되어 비질 바이오티닐-AMP(bio-AMP)의 형성을 촉매한다는 것입니다. 이러한 자유 바이오-AMP는 PL 효소에 의해 방출되고 표적 단백질 부근으로 확산되어 10 nm5의추정 반경 내에 있는 1차 아민에서 근위 단백질의 생체측을 허용한다.
이 접근법은 과도 또는 약한 PPI를 캡처하는 기능과 같은 기존의 Y2H 및 IP-MS 접근 방식에 비해 상당한 이점이 있습니다. 더욱이, PL은 그들의 모국세포 환경에서 표적 단백질의 근위 단백질의 라벨링을 허용한다. 다른 PL 효소는 다른 시스템에 적용할 때 독특한 단점이 있습니다. 예를 들어, APEX는 BioID에 비해 더 높은 태깅 역학을 제공하고 포유류 시스템에 성공적으로 적용되지만,2이 접근법에서 독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항은 식물의 PL 연구에 적합하지 않습니다.
대조적으로, BioID 기반 PL은 독성H2O2의사용을 피하지만 라벨링 속도가 느립니다 (생체 이식을 완료하기 위해 18-24 시간이 필요함) 따라서 과도 PPI의 캡처가 덜 효율적입니다. 더욱이, BioID에 의한 효율적인 PL에 필요한 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물4와같은 일부 유기체에 외부 스트레스를 유발한다. 따라서 식물(즉, 쌀 톱니세포, 애기장대 및 N. 벤타미아나)에서 BioID 기반 PL의 제한된 배치가6,7,78,9로보고되었다.,8 최근 기술된 터보ID 효소는 APEX 및 BioID 기반 PL. TurboID의 결핍을 극복하여 RT10에서10분 이내에 PL을 성취할 수 있는 높은 활성을 보였다. TurboID 기반 PL은 포유류 세포, 파리 및 웜10에성공적으로 적용되었습니다. 최근, 당사및 기타 연구그룹은 N. 벤타미아나 및, 애기장대 식물 및 토마토 털뿌리11,12,13,,,14를포함한 다양한 식물 시스템에서 PPI를 연구하기 위한 TurboID 기반 PL의 사용을 독립적으로 최적화및 확장시켰다. 비교 분석에 따르면 TurboID는 BioID11,,14에비해 식물에서 PL에 대해 더 나은 성능을 보입니다. 또한 전통적인 방법을 사용하여 얻기 어려운 상호 작용 파트너가 일반적으로 어려운 NLR 면역 수용체11과의 새로운 상호 작용의 수를 확인함으로써 질라에서 TurboID 기반 PL의 견고성을 입증했습니다.
이 프로토콜은 N. 벤타미아나 식물에서 NLR 면역 수용체의 N-말단 TIR 도메인의 상호작용 단백질의 식별을 설명함으로써 질라에서 터보ID 기반 PL을 설명한다. 이 방법은 N. 벤타미아나에관심있는 모든 단백질로 확장 될 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 애기장대등 다른 식물 종에서 PPI를 조사에 대 한 중요 한 참조를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>721 분광 광도계</td><td>Metash, Made in</td> China <td>Q/SXFZ6</td><td>OD600 측정용</td></tr> 암<tr><td>모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>시그마</td><td>B4639-1G</td><td>50 mM 재고</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5702</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>원심분리기 5417R</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11697489001</td><td></td></tr><tr><td>Deoxycholic acid</td><td>Sigma</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>VWR Life Science</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>친화성 정제용</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 플레이트</td><td>Corning</td><td>Costar 3590</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-212</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF 멤브레인</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>웨스턴 블롯 분석용</td></tr><tr><td>리튬 염화 용액(LiCl), 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>저속 냉장 원심분리기</td><td>Zonkia, 중국산</td><td>KDC-2046</td> 염화마그네슘 <td>탈염용</td></tr><tr><td>, 육수화물(MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 랙</td><td>Invitrogen</td><td>123.21D</td><td>비드 흡착용</td></tr><tr><td>Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N07710</td><td>OD595 측정용</td></tr><tr><td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td><td>Sigma</td><td>I8896-100ML</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 HA</td><td>로슈</td><td>11867423001</td><td></td></tr><tr><td>회전 믹서</td><td>Kylin-Bell 실험실 기기</td><td>WH-986</td><td>IP</td></tr><tr><td>쇼크 인큐베이터</td><td>Labotery, 중국에서 만든</td><td>ZQPZ-228</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데 옥시 콜레이트</td><td>시그마</td><td>D2510-100G</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)</td> <td>시그마</td><td>L4390-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab7403</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>시그마</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560E</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 인큐베이터</td><td>블루 파드, 중국산</td><td>GHP-9080</td><td>Agrobacterium 인큐베이션</td></tr><tr><td>Zeba 스핀 탈염 컬럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89893</td><td>비오틴 제거용</td></tr></tbody></table>

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보id 기반 근접 라벨링

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

근접 라벨링(PL) 기술은 엔지니어링된 아스코르브베이트 과산화수배 (APEX) 또는 대장균 비오틴 리가제 비라(BioID로 알려짐)를 사용하여 포유류 세포에서 단백질-단백질 상호작용(PPI)을 식별하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 APEX 기반 PL에서2독성 과산화수소(H2O2)의요구 사항, 비오틴(16-24시간)의 배양 시간 연장, BioID 기반 PL의 더 높은 인큐베이션 온도(37°C)는 식물에서의 적용을 심각하게 제한합니다. 최근에 설명된 TurboID 기반 PL은 BioID 및 APEX의 많은 한계를 해결합니다. TurboID는 실온(RT) 조건에서 단 10분 만에 단백질의 신속한 근접 라벨링을 허용합니다. TurboID의 유용성은 동물 모델에서 입증되었지만, 우리는 최근 터보 ID 기반 PL이 관심있는 단백질에 근접한 단백질의 라벨링에 대한 BioID에 비해 식물에서 더 나은 성능을 보였다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 뉴클레오티드 결합 류신-리치 반복(NLR) 단백질 패밀리의 N-말단 톨/인터류키핀-1 수용체(TIR) 도메인을 이용하여 단백질 상호작용 파트너의 식별을 위한 단계별 프로토콜이다. 이 방법은 친화도 정제에 의한 생체 연단백질의 벡터 구성, 단백질 발현 구조, 비오틴 처리, 단백질 추출 및 탈염, 정량화 및 농축에 대해 설명합니다. 여기에 기술된 프로토콜은 니코티아나 및 다른 식물 종에서 관심 있는 다른 단백질을 연구하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.

설명된 프로토콜에 기초하여 예상되는 결과를 나타내는 대표적인 데이터는 Zhang et al11에서조정된다. 그림 1은 N. 벤타미아나에서터보ID 기반 PL을 수행하기 위한 절차를 요약한 것입니다. 도 2는 침윤된 N. 벤타미아나 잎에서단백질 발현 및 생체이식화를 나타낸다. 도 3은 침윤된 잎내의 생체티니화 단백질이 후속 질량 분석 분석을 위해 효율적으로 농축되었다는 것을 보여준다. streptavidn-C1-컨쥬게이션 된 자기 구슬을 사용하여 생체 관절 단백질을 농축 한 후 다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었으며 농축 된 단백질의 서쪽 얼룩 분석이 얼룩진 밴드를 보였다는 점에 유의해야합니다(그림 3). 유사한 관측은 몇몇 최근 간행된<sup ...

여기서 설명된 것은 니코티아나 벤타미아나 잎 조직에서 NLR 면역 수용체의 TIR 도메인의 상호작용 파트너의 식별을 위한 근접 라벨링 방법이다. 또한 니코티아나 및 다른 식물 종에서 이 기술을 사용하여 관심 있는 다른 단백질 간의 상호 작용을 식별하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR 면역 수용체는 다양한 병원체에 대한 식물 방어를 중재하는 데 중요한 역할을합니다. 우리는 니코티아나 벤타미안 식물에 있는 면역 수용체와 같은 NLR를 포함하는 Toll/interleukin-1 수용체 도메인의 상호 작용 파트너의 식별을 위한 TurboID 기지를 둔 근접 라벨링 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 식물 종에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사하기위한 중요한 참조를 제공하고 니코티아나 벤타미안에 관심있는 모든 단백질로 확장 될 수있다.TurboID 기반 근접 라벨링 접근법은 생체 내에서 일시적 또는 약한 단백질 단백질 상호 작용을 포착하는 데 사용할 수 있기 때문에 전통적인 접근 방식에 비해 뚜렷한 이점을 가지고 있습니다. 고밀도에서 젖은 토양에서 N.benthamiana 씨앗을 재배하여 시작합니다. 섭씨 23~25도의 18시간 빛과 8시간 어두운 사진 으로 기후 챔버에서 유지하십시오.그들은 후속 농가 침투에 대한 4 ~ 8의 잎 단계로 성장할 때까지 약 4 주 동안 챔버에 식물을 유지합니다. TurboID 융합을 구성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 아그로박테리움 tumefaciens 유능한 세포로 변환합니다. 완전히 성숙한 N.benthamiana 잎의 축축표의 접종에 침투하기 위해 1 밀리리터 바늘없는 주사기를 사용합니다.여과 후 36시간 동안 200마이크로몰러 비오틴을 잎에 침투하여 잎 조직을 수확하기 전에 3~12시간 동안 식물을 유지합니다. 잎 샘플을 수집하려면, 쁘띠올의 기지에서 침투 잎을 잘라 잎 정맥을 제거하고, 액체 질소에 조직을 동결 플래시. 잎 조직을 유봉과 박격포로 갈아서 15 또는 50 밀리리터 팔콘 튜브에 섭씨 영하 80도에 저장합니다.총 단백질을 추출하려면 약 0.35 그램의 잎 분말을 2 밀리리터 튜브로 전달하십시오. 이 과정에서 액체 질소의 저온에서 조직을 유지하십시오. 700 마이크로리터의 RIPA 용해 버퍼를 파우더에 넣습니다.튜브를 10분 동안 소용돌이치며 30분 동안 샘플을 얼음 위에 두고 튜브를 반전시켜 4~5분마다 내용물들을 섞습니다. 10 분 동안 섭씨 4도에서 20, 000 배 g에서 튜브를 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 수집합니다.탈염 컬럼을 통해 샘플을 실행하여 무료 비오틴을 제거합니다. 컬럼 하단의 실러를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 놓습니다. 그런 다음 캡을 풀고 컬럼을 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 분리합니다.탈염 컬럼을 신선한 50 밀리리터 튜브에 넣고 RIPA 리시스 버퍼 5밀리리터로 컬럼을 3번 평형화합니다. 원심분리기는 1, 000배, 섭씨 4도에서 2분간 2분간, 매번 흐름을 폐기합니다. 1.5 밀리리터의 단백질 추출물을 평형 컬럼의 수지 위에 넣습니다.그리고 추출물이 수지에 들어가면 RIPA 리시스 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 컬럼을 2분 동안 원심분리하고 탈염된 샘플을 얼음 위에 두어 추가 사용이 가능해질 때까지 그대로 둡니다. 탈염 단백질 추출물을 정량화하려면 바이오 라드 분광계를 사용하여 OD595를 측정합니다.그라데이션 BSA 용액의 값을 기준으로 표준 곡선을 그리고 탈염 단백질 샘플의 농도를 계산합니다. 실온에서 1분 동안 RIPA 용해 버퍼 1밀리리터로 자성구를 분리합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 구슬을 3분 동안 흡수하고 용액을 부드럽게 흡인시합니다.그런 다음 세탁을 한 번 더 반복합니다. 단백질 추출물을 평형 마그네틱 구슬로 옮기고 회전기에서 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 튜브를 배양하여 단백질을 정화합니다. 다음 날, 마그네틱 랙으로 구슬을 캡처하고 슈퍼 나티브를 흡인.다음으로, 튜브에 추가하여 1.7 밀리리터의 워시 버퍼로 구슬을 씻고 8 분 동안 로터에 배양하십시오. 앞서 설명한 대로 상체를 제거하고 세척 버퍼 2의 1.7 밀리리터로 세척을 반복하고 버퍼 3을 세척합니다. 세제를 제거하기 위해 50 밀리머 트리 HCL의 1.7 밀리리터를 추가합니다.그런 다음 튜브를 자기 랙에 놓고 상체를 제거합니다. 50 밀리머 트리스 HCL의 1 밀리리터로 세척을 반복하고 구슬을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮겨보십시오. 마지막으로, 50 밀리몰라 중탄산염 버퍼로 구슬을 세척당 5분간 6회 세척합니다.면역blot 분석을 위해 100 마이크로리터의 비드를 사용하여 생체화 단백질의 농축을 확인하고 나머지 시료를 영하 80도에서 보관할 수 있도록 플래시를 동결합니다. 서양 얼룩은 농약 이내 N.benthamiana 잎에서 단백질 발현 및 생체 자극을 분석하는 데 사용되었다. 침투된 잎에 있는 생물요닉한 단백질은 후속 질량 분광법 분석을 위한 연쇄상비딘 C1 공액 자기 구슬로 효율적으로 농축되었다.다양한 크기의 다른 단백질이 포착되었고 농축 된 단백질의 서양 얼룩 분석은 얼룩진 밴드를 보였다. 이 절차를 시도할 때는 탈염 열 의 하단에있는 실러를 제거하고 각 원심 분리 전에 캡을 느슨하게해야합니다. 이 프로토콜은 니코티아나 벤타미안에 대한 관심있는 다른 단백질에 쉽게 적응할 수 있으며 다른 식물 종에서 TurboID PL을 확장하는 데 사용할 수도 있습니다.

turboid-based-proximity-labeling-for-planta-identification-protein

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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