Name: 실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 배우세요 실험적 진화를 통해 E. coli에서 플라스미드 빈도와 항생제 내성을 추적하는 방법을. 복제 플레이팅으로 플라스미드 동역학을 정량화하여 세균 내성 연구에 활용할 수 있습니다.

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창의적인 지원과 기술 지원을 해주신 고르 마가리안에게 감사드립니다. 이 작품은 ZMB 젊은 과학자 교부금 에 의해 지원되었다 2017/2018 (TW에 수여) 및 DFG 초점 프로그램 1819 (그랜트 번호. DA1202/2-1은 TD에 수여됩니다.

1. 항생제 내성 유전자를 운반하는 모델 플라스미드의 건설
참고: 균주 대장균 K-12 MG1655는 모든 실험에서 모델 유기체로 사용하였다(DSM No. 18039, 독일 미생물 및 세포 배양, DSMZ). 균주 대장균 DH5α17을 플라스미드 시공 시 사용하였다.
<ol><li>PCR은 선택한 플라스미드 백본을 증폭시키고 PCR에 의해 프로모터 영역을 포함하는 내성 유전자를 증폭시다(도1).<ol>
<li>PCR은 플라스미드 템플릿 pLC(GenBank acc.no.) 상에서 고충실성 폴리머라제 및 올리고뉴클레오티드 pBBR1_for(5'-GCGGCCCCGGCTCT-3')와 pBBR1_rev(5'-TACCGGCGCGCGCGCGGCCC-3')를 사용하여 플라스미드 백본을 증폭시다. MH238456)18.</li>
		<li>PCR은 고충실도 폴리머라제 및 올리고뉴클레오티드 nptII_gib_for 사용하여 네이티브 Tn5 프로모터19를 포함하는 내성 유전자 nptII를 증폭(5'-GCGCCGGAGCTCTTGCGCGCCGCCC-3')와 nptII_gib_rev(5'-CGGTGGGGGCGCGCCGCCGCCGCAAAAAAGCCCGCCAGTGA)를 사용한다. nptII 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제에 대해 인코딩하고 카나마이신에 대한 내성을 부여한다. 참고: 플라스미드 백본에 약 20 bp의 상보서열을 가진 저항성 유전자에 대한 프라이머를 설계하여 융합될 것이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선택한 키트를 사용하여 두 PCR 조각을 청소합니다.</li>
	<li>정제된 항생 저항 유전자 PCR 생성물(이 의 프로모터 영역 포함)을 정제된 플라스미드 백본에 결합하고 등등조립체 20을사용하여 상동 영역을 융합시키고, 50°C에서 60분 동안.</li>
	<li>융합된 생성물인 균주 대장균 DH5α를 전기화한다.<ol>
<li>4°C 및 2.5 kV에서 2 mm 큐벳에 전기 유능한 세포의 40 μL에 단계 1.3에서 제품의 2 μL을 소개합니다. 리소제니 국물 (LB) 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.</li>
		<li>총 부피를 마이크로퍼지 튜브로 이송하고 37°C에서 250 rpm에서 교배하여 플라스미드 상에서 저항 마커의 발현을 허용한다.</li>
		<li>플레이트 100 μL은 적절한 항생제(카나마이신 25 μg/mL)를 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 항생제 내성 유전자를 선택하고 따라서 플라스미드 운반 세포를 선택한다. 나머지를 스핀 다운, 상판을 제거, 100 μL LB에서 세포를 다시 중단하고 선택적 한천 접시에 플레이트. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>클론을 확인하기 위해 상업용 미니 프렙 키트를 사용하여 알칼리성 용해를 통해 구성된 플라스미드를 추출합니다.<ol>
<li>실온에서 12,000 x g에서 원심분리하여 고정된 하룻밤 배양물 5 mL을 수확한다. 재서스펜션 용액에서 세포를 다시 일시 중단한 다음 세포 용액을 용해시키고 중화시다. 12,000 x g에서5 분 동안 원심 분리기 .</li>
		<li>키트에 제공된 DNA 결합 컬럼에 상온액을 전달하고 용출 완충액으로 컬럼 멤브레인을 용출하기 전에 2x 원심분리하여 500 μL 세척 용액으로 컬럼을 두 번 세척한다.</li>
		<li>플라스미드의 Sanger 시퀀싱을 수행하여 서열이 올바른지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스미드 타당성이 확인되면, 전술한 바와 같이 플라스미드(현재 pCON)를 균주 대장균 MG1655로 전기화한다. 이것은 변형 대장균 MG1655 pCON을 산출한다.</li>
</ol>2. 시간이 지남에 따라 다양한 조건에서 플라스미드 운반 박테리아 모니터링
참고: 진화 실험은 2개의 온도(37°C 및 20°C)와 3개의 인구 병목 현상 크기에서 비선택적 조건(LB 매체)하에서 플라스미드 운반 균주를 가지고 진행됩니다. 실험 설계는 다양한 조건하에서 플라스미드 지속성을 연구하는 데 사용됩니다.
<ol><li>시간이 지남에 따라 플라스미드 주파수를 따르는 진화 실험의 설계(그림 2)<ol>
<li>항생제(카나마이신 25 μg/mL)로 보충된 LB 한천 플레이트상에 구성된 플라스미드 운반균주(E. coli MG1655 pCON)를 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양한다.</li>
		<li>각 우물에 1 mL의 LB 배지로 96 개의 딥 웰 플레이트를 준비하십시오. 세균 조상으로, 독립적 인 우물에서 한천 접시에서 여덟 무작위 고립 된 식민지를 선택합니다. 플레이트 쉐이커에서 37°C 및 450 rpm에서 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>다음날 실험 설계에 따라 8개의 복제 인구를 새로운 딥 웰 플레이트로 옮김(그림2). 배양은 희석을 위해 PBS를 사용하여 총 부피 1mL LB에서 1:100(큰 병목 현상, L), 1:1,000(중간 병목 현상, M) 또는 1:10,000(작은 병목 현상, S)을 희석한다. 희석된 배양액은 모두 37°C 및 20°C에서 배양된다. 참고: 96-deep-well 플레이트의 교차 오염을 제어하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 박테리아가없는 LB 배지와 접종 웰을 상호 하여 바둑판 플레이트 디자인을 사용합니다. 전체 진화 실험을 통해이 패턴을 사용합니다.</li>
		<li>37°C에서 배양된 배양배양은 12시간마다 이송되고 20°C에서 배양하는 동안 24시간마다 이송된다. 참고: 모든 전송 이벤트 동안 병목 현상 크기 처리가 적용되고 총 98전송에 걸쳐 직렬 전송이 반복됩니다. 전송 수는 독자의 실험적 디자인에 따라 달라집니다.</li>
		<li>모든 인구의 냉동 글리세롤 주식을 정기적으로 준비, 일주일에 2 배.</li>
	</ol></li>
	<li>복제 도금에 의한 플라스미드 주파수 모니터링(그림 3) 참고 : 진화 실험 동안, 집단에서 플라스미드 운반 세포의 빈도는 숙주의 비율에서 추정된다. 복제 도금 프로토콜은 그림 3에도시되어 있습니다.<ol>
<li>진화 실험 동안 인구의 플라스미드 주파수를 결정하기 위해 고정 배양은 비선택적 LB 한천 플레이트에서 연속적으로 희석되고 도금됩니다. 플레이트 당 250-500 콜로니의 수율에 따라 희석을 조정합니다. 참고 : 도금 전에 두꺼운 LB 한천 접시를 준비하십시오 (~ 30 mL 한천).</li>
		<li>도금 된 인구는 실험에서 그들의 성장 온도에 따라 하룻밤 성장을 위해 배양된다. 참고 : 식민지는 작아야하므로 37 ° C에서 배양 및 24 시간.</li>
		<li>하룻밤 성장 후, 수동 또는 자동화 된 식민지 카운트 스테이션을 사용하여 모든 식민지를 계산하고 배양에서 총 세균 인구 크기를 계산합니다. 참고: 한천 판 의 가장자리에 있는 콜로니는 총 세균 세포 수에 포함되지 않아야 합니다.</li>
		<li>토클레이브에 의한 면 벨벳의 사각 조각(~20 x 20cm)을 살균합니다. 참고: 벨벳 천은 오토클레이브가 가능하려면 면 100%이어야 합니다. 살균 후 천을 말리는 것이 중요합니다.</li>
		<li>벨벳 천을 살균 한 후 둥근 블록에 천을 놓고 금속 고리로 고정하십시오. 주름을 피하는 것이 중요합니다. 조심스럽게 고정 벨벳 천 표면에 성장 식민지 (한천 아래로 향하게)와 접시를 배치합니다. 모든 식민지가 조심스럽게 원형 방식으로 페트리 접시를 눌러 벨벳 표면에 닿는지 확인하십시오.</li>
		<li>LB 한천 접시를 조심스럽게 제거하고 항생제 (카나마이신 25 μg / mL)로 보충 된 선택적 접시를 벨벳 천에 놓습니다. 접시가 앞에서 설명한 대로 페트리 접시를 조심스럽게 눌러 모든 벨벳을 만지고 있는지 확인하십시오. 그 후 접시를 제거합니다. 하룻밤 성장을 위해 접시를 실온에서 둡니다.</li>
		<li>다음날, LB 한천 플레이트와 선택적 플레이트를 모두 평가한다. 선택적 매체에 성장하는 식민지는 플라스미드 숙주 (즉, 항생제 내성)로 계산되며, 식민지가없는 반점은 플라스미드가없는 콜로니이며 따라서 항생제에 내성이없는 식민지입니다 (즉, 플라스미드를 잃었습니다). 이것은 서로 위에 판을 배치하고 성장을 비교 (즉, 누락 된 식민지를 표시) 두 판에 식민지 번호를 계산하여 수행됩니다. 이것은 진화 실험 도중 플라스미드를 분실한 세포의 수를 산출합니다.</li>
		<li>전체 진화 실험을 따라 이 절차를 정기적으로 반복합니다(예: 14회 전송할 때마다).</li>
	</ol></li>
</ol>3. 젤 전기 동동을 사용하여 플라스미드 멀티머의 시각화
참고: 저카피 플라스미드의 플라스미드 추출은 종종 시각화 전에 효소적으로 소화되어야 하는 숙주 염색체 DNA로 오염을 유발합니다.
<ol><li>1.5단계에서 기재된 바와 같이 알칼리성 용해를 이용한 5 mL 고정된 하룻밤 세포 배양으로부터 플라스미드 DNA를 추출한다.</li>
	<li>그 후, 염색체 DNA 오염을 제거하기 위해 염색체 DNA만 절단하는 ATP 의존적 DNase로 추출된 플라스미드 DNA를 치료합니다(재료 표참조). 37°C에서 30분 동안 배양한 후, 선택한 키트를 사용하여 DNA를 청소합니다.</li>
	<li>모든 플라스미드 적합성(단량체 또는 멀티머)의 열린 원 분자를 생성하려면, 플라스미드 DNA 샘플을 닉킹 효소(Nb.BsrDI)로 배양하고 65°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>병렬로, 선형 플라스미드 분자(즉, 플라스미드 크기 비교를 위해)를 생성하기 위해, 플라스미드를 한 번 절단하는 당신의 선택의 제한 효소(예를 들어, HindIII)를 사용한다. 참고 : 이것은 선형 DNA 플라스미드 단량체가 발생합니다. 열린 원 분자는 선형 방식으로 마이그레이션되지 않습니다.</li>
	<li>플라스미드 크기와 형태를 시각화하기 위해, 전기조는 아가로즈 겔 1% (w/v) 및 1× TAE 완충액에서 4.3 V/cm에서 120 분 동안 닉 및 선형 플라스미드 DNA 샘플을. 샘플은 Midori 녹색으로 염색되고 젤은 젤 이미징 시스템에서 시각화됩니다 (재료 표참조). 1kbp 사다리를 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜에서는, 우리는 박테리아에 있는 항생 저항의 지속성을 위한 plasmid 진화의 역할을 조사하기 위하여 분자 생물학, 실험적인 진화 및 DNA 시각화에 있는 기술을 결합하는 접근을 제시합니다. 제시된 접근은 다른 연구 분야의 방법을 결합하더라도, 모든 적용된 기술은 간단하고 표준 미생물학 실험실에서 수행될 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 플라스미드 운반 유전자형의 유전적 검증을 포함하는 모델 시스템 균주의 구성을 포함한다. 특히, 많은 플라스미드는 항생제 내성 유전자를 자연적으로 인코딩합니다. 따라서, 판독기는 프로토콜의 1단계를 생략하고 2단계로 직접 진행할 수 있다. 다음으로, 진화 실험은 결과가 깊은 우물 판에 복제 인구의 위치에 의해 편향되지 않도록 복제 인구의 무작위 디자인을 포함해야한다. 또한, 오염이 결과를 위조할 수 있으므로 진화 실험에서 직렬 전달 및 희석 단계를 신중하게 수행하는 것이 특히 중요하다. 마지막으로, 복제 도금은 세심한 주의를 기울여 수행되어야 합니다. 큰 콜로니 크기는 문제가 될 수 있지만, 24 시간 미만에 대한 플레이트를 인큐베이팅하여 피할 수 있습니다. 마찬가지로, 한 플레이트에 있는 콜로니의 수는 복제 도금 결과를 편향시킬 수 있습니다. 따라서 도금 및 복제 전에 인구를 희석해야 합니다.
당사의 접근 방식의 가장 큰 장점 중 하나는 중장비 없이도 쉽게 재현할 수 있다는 것입니다. 또한, 마커 유전자를 따르는 복제 도금의 또 다른 장점은 살아있는 세포만이 평가된다는 것입니다, 죽은 세포가 살아있는 것으로 평가될 수 있는 유세포 측정 또는 qPCR과는 대조적으로. 따라서, 복제 도금은 플라스미드 운반 세포의 계수에 대한 편향을 덜 도입한다. 그럼에도 불구하고, 복제 도금의 한 가지 제한은 하나의 실험 실행에서 평가할 수 있는 집단 크기(즉, 셀 수)일 수 있다.
우리의 접근을 사용하여, 우리는 최근에 플라스미드 안정성 진화가 박테리아에 있는 항생 저항 유전자의 지속성을 약하게 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 우리는 특히 항생제의 존재없이 조건에서 시간이 지남에 따라 저항을 따르는 것이 매우 중요하다 플라스미드 매개 저항 지속성을 따르는 도구로 접근을 개발했다.

플라스미드는 원핵생물에서 유비쿼터스인 원형의 자가 복제 유전 적 요소입니다. 그(것)들은 미생물 인구 사이 특료를 전송할 수 있기 때문에, 측량 유전자 전송의 에이전트이고, 따라서 미생물 진화에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 여겨져 있습니다. 플라스미드는 단시간에 걸쳐 성장을 제한하는 조건에 대한 신속한 적응의 동인(예를 들어, 항생제 또는 살충제1의존재) 및 다른 라이프스타일 모드로의 장기적인 전환(예를 들어, 병원성2의출현)에 대한 책임이 있다. 유전자의 전송에 플라스미드의 충격에 대한 가장 눈에 띄는 예는 의료 진료소 또는 산업 농장에서 와 같은 항생제의 변동 수준에 노출된 생태계에서 문서화됩니다3. 강한 긍정적인 선택 때문에, 많은 플라스미드는 항균 저항 유전자를 위한 인코딩하고 수시로 그들의 세균성 호스트에 다중 저항을 부여하는 것을 발견됩니다. 플라스미드는 인구 또는 세균 종 간의 이동을 가능하게 하여 다중 항균 저항성의 급속한 전파를 초래합니다. 비선택적 조건하에서 플라스미드는 세포에 필수적이지 않으며 종종 기생 요소라고도 합니다. 그럼에도 불구하고, 플라스미드는 본질적으로 유비쿼터스이며 그 진화는 세균 성 염색체의 그것과 매우 얽혀 있습니다. 자연 환경 (변동 및 비 선택적)에서 플라스미드 지속성은 제대로 이해되지 않지만, 본질적으로 항생제 내성 유전자의 지속성에 대한 우리의 이해를 위해 매우 중요합니다.
실험적 진화는 미생물 집단의 연구를 위한 강력한도구입니다 4. 실험적 진화는 플라스미드 유지보수에 대한 강력한 선택을 부과하면 플라스미드 적당 비용을 감소시키는 플라스미드 또는 숙주 염색체의 보상(즉, 적응형) 진화로 이어지며, 차례로 플라스미드 풍부(즉, 플라스미드 지속성)를 용이하게 한다는 것을입증했다5,6,7. 따라서, 시간이 지남에 따라 플라스미드-숙주 상호작용을 따르는 것은 두 원소의 적응의 중요한 메커니즘을 드러낼 수 있다. 더욱이, 실험적 진화는 다양한 조건 하에서 시간이 지남에 따라 플라스미드 운반 세포의 풍부를 정량화할 수 있게 한다8,9,10.
진화 실험에서 플라스미드 지속성은 형광 활성화 세포 선별(FACS)11,정량적 PCR(qPCR)11,또는 재배 기반 방법에 의한 유세포분석법을 포함한 여러 전략에 의해 모니터링될 수 있다. 유세포측정법은 FACS 기계를 필요로 하며, 플라스미드상에서 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 검출 가능한(형광) 마커 유전자의 도입을 요구한다. 그러나, GFP 발현은 몇몇 세포 속성을 변경하고 또한 세포 분열 도중 플라스미드 상속에 영향을 미칠 수 있는 세포(12)에있는 플라스미드 위치에 영향을 미칠 수 있습니다. 플라스미드 풍부도를 측정하는 qPCR 접근법은 플라스미드 카피 수에 의해 매우 편향될 수 있으며, 이는 세균 성장 단계및 시간이 지남에 따라 크게 달라질 수있다 13. 마지막으로, 배양 기반 및 도금 접근법은 선택 가능한 마커 유전자의 도입을 요구한다. 이것은 종종 자연 플라스미드에 인코딩되는 항생제 내성 유전자일 수 있습니다. 따라서 유전 적 조작이 필요하지 않습니다. 항생 저항은 전통적인 복제 도금 접근에 선행될 수 있습니다. 따라서, 천연 플라스미드 역학을 연구하기 위해, 복제 도금은 플라스미드 인코딩된 항생제 반응성14를모니터링하는데 적합하다.
플라스미드 분자(예를 들어, 플라스미드 크기를 평가하기 위해)를 시각화하기 위해 여러 가지 방법이 적용될 수 있다. 전체 플라스미드는 PCR 기반 접근법을 사용하여 증폭될 수 있습니다. 그러나, 이것은 플라스미드 서열이 시간이 지남에 따라 변경될 수 있기 때문에 진화 실험 중에 어려울 수 있는 특정 프라이머의 설계를 필요로 한다. 또한, PCR 프라이머에 대한 다중 결합 부위로 인해 PCR 기반 접근법에서 플라스미드 멀티머를 증폭시키기가 어렵다. 다중 플라스미드 분자는 플라스미드 복제 종단 또는 플라스미드 분자의 재조합을 통해 나타날 수 있으며 대부분 머리에서꼬리까지 15를지향한다. 플라스미드 시각화의 또 다른 접근법은 아가로스 겔 전기 동공 분석과 플라스미드 DNA 가닥을 갈라지거나 닉하는 DNA endonucleases에 의해 플라스미드 분자의 효소 소화를 결합합니다. 상이한 크기의 동일한 플라스미드(예를 들어, 단량체 대 멀티머)는 플라스미드 분자를 시각화할 때 관찰될 수 있는 상이한 겔 동원을 초래한다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 플라스미드 적합성(즉, 다중화 상태)을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 플라스미드 형태는 플라스미드 멀티머가 세포분열(16)동안 자주 손실되기 때문에 플라스미드 안정성의 지표로서 사용될 수 있다.
최근 작업에서, 우리는 플라스미드 풍부를 위해 선택적이지 않은 조건에서 플라스미드 지속성을 따랐습니다 (즉, 항생제 선택없이). 우리는 두 개의 서로 다른 온도 (20 ° C 와 37 ° C)와 세 가지 인구 크기 (즉, 희석 속도)에서 플라스미드 지속성을 비교했습니다. 다양한 희석율 또는 인구 병목 현상을 적용하면 박테리아 및 플라스미드 진화에 대한 인구 규모의 영향을 조사할 수 있습니다. 우리의 결과에 따라, 우리는 플라스미드가 세균 성 숙주에게 중립적 일 수 있으며 선택 압력8없이안정성을 진화 시킬 수 있음을 제안합니다. 진화된 플라스미드 안정성은 플라스미드 멀티머 형성8의감소에 의해 부여된다.
여기서, 우리는 항생 저항 유전자의 유지에 관하여 플라스미드 진화의 plasmid 지속성 및 조사의 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 모델 플라스미드에 항생제 내성 유전자의 삽입을 포함하여 여러 단계를 가지고 있습니다 (자연 저항 플라스미드를 사용할 때 생략 될 수 있음), 플라스미드의 잠재력을 평가하기 위한 실험적 진화의 사용이 뒤따릅니다. 비선택적 조건하에서 복제 도금을 이용하여 시간이 지남에 따라 플라스미드 주파수 역학을 결정하고, 시각화에 의한 플라스미드 게놈의 분석을 수행한다. 여기에서 기술된 프로토콜은 플라스미드의 진화 와 지속성을 조사하기 위하여 디자인되었습니다, 그러나 또한 염색체 저항 유전자의 진화를 따르기 위하여 적용될 수 있습니다 (또는 그밖 마커 유전자) 시간이 지남에 따라.

<table><tbody><tr><td>96-딥-웰 플레이트</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-딥-웰 플레이트</td><td>Roth</td><td>EN07.1</td><td>2 ml, 정사각형</td></tr><tr><td>96-딥웰 플레이트(극저온)</td><td>Starlab</td><td>E1702-8400</td><td>마이크로 희석 튜브 시스템</td></tr><tr><td>콜로니 카운터</td><td>스튜어트</td><td>SC6+</td><td></td></tr><tr><td>면 벨벳</td><td>커튼 샵</td><td></td><td>100% 면 필요</td></tr><tr><td>전기영동 챔버</td><td>BioRad</td><td></td><td>아가로스 젤 전기영동</td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>아가로스 젤 전기영</td></tr><tr><td>동 큐벳</td><td>BioRad</td><td></td><td>1652089 0.1cm</td></tr><tr><td>전기천공기</td><td>BioRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet 젤 추출 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0832</td><td>PCR fragment clean-up</td></tr><tr><td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td>플라스미드 추출 키트</td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50125852</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 (플레이트 쉐이커)</td><td>Heidolph</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 (쉐이커)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 44</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052, 3125000028</td><td></td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Capp</td><td>ME8-1250R</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>유로파인</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td><td></td></tr> <tr><td>PlasmidSafe 효소</td><td>진원지</td><td>10059400</td><td></td></tr><tr><td>반응 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>복제 블록 및 금속 링</td><td>VWR</td><td>601-3401</td><td>PVC 실린더 69mm; 링 102cm</td></tr><tr><td>Resctriction 효소</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr></tbody></table>

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

플라스미드는 미생물 집단에서 부속 유전자 기능의 측면 유전자 전달 및 저수지의 차량으로서 미생물 생태학 및 진화에 중요한 역할을 합니다. 이것은 특히 변화하는 항생제 노출과 같은 급변하는 환경에서 그렇습니다. 우리는 최근에 플라스미드가 플라스미드 존재에 대한 긍정적 인 선택없이 대장균에서 항생 저항 유전자를 유지하는 것으로 나타났습니다. 여기에서 우리는 장기 적인 진화 실험에 있는 plasmid 유전자형 및 표현형을 둘 다 따르는 것을 허용하는 실험 시스템을 기술합니다. 우리는 분자 기술을 사용하여 대장균 숙주에서 실험적 진화 배치 시스템 접근법에 도입되는 모델 플라스미드를 설계합니다. 우리는 항생 저항 지속성을 정량화하는 동안 대장균 인구의 복제 도금을 적용하여 시간이 지남에 따라 플라스미드 주파수를 따릅니다. 또한, 우리는 플라스미드 니킹 및 아가로즈 겔 전기 영동에 의한 플라스미드 다중체 형성의 정도를 분석하여 숙주 세포에서 플라스미드의 형태를 모니터링합니다. 이러한 접근법을 통해 우리는 진화하는 플라스미드의 게놈 크기뿐만 아니라 플라스미드 상속에 매우 중요한 위상적 형태인 위상을 시각화할 수 있습니다. 우리의 시스템은 전통적인 미생물학 접근과 분자 전략을 결합하고 오랜 시간 동안 세균 성 인구에 있는 plasmids를 따르기 위하여 설치를 제공합니다. 제시된 접근법은 미래에 광범위한 모바일 유전 적 요소를 연구하기 위해 적용될 수 있다.

여기에서, 우리는 인구에 있는 plasmid 지속성을 정량화하여 플라스미드 진화를 공부하는 접근을 제시합니다. 첫째, 우리는 이후에 진화 실험에 도입되는 대장균 균주 MG1655 pCON을 운반하는 플라스미드를 구축하는 방법을 보여준다. 둘째, 우리는 진화하는 세균 집단에 있는 plasmid 풍부를 따르는 간단한 방법을 제시합니다. 마지막으로, 우리는 플라스미드 분자의 크기와 형태를 시각화하는 방법을 보여줍니다.
제시된접근법을 사용하여 8의 전작에서 우리는 항생제가 없는 대장균에서 항생제 내성 플라스미드의 지속성에 따른 진화 실험을 수행하였다(도4). 우리의 대표적인 결과는 37 °C에서 인구의 진화와10-4의희석 비율을 보여줍니다. 플라스미드 운반 세포의 풍부에 따라, 우리는 시간이 지남에 따라 주파수 플라스미드 운반 숙주 세포의 감소를 관찰하였다(그림4). 우리의 접근은 플라스미드 손실이 응축된 플라스미드 게놈 건축의 결과였다는 것을 것을을 발견하기 위하여 가능하게 했습니다, 저항 유전자의 전사 및 플라스미드 자체의 복제에 의해 소개된 충돌에 기인한 플라스미드 불안정성으로 이끌어 냈습니다. 플라스미드 분자를 시각화함으로써 이러한 충돌이 불안정한 플라스미드 형태(즉, 플라스미드 다중체 형성, 그림 5)로이어졌다는 것을 발견할 수 있었습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 항생제에 노출되지 않고 플라스미드 안정성 진화를 관찰하였다(그림4). 진화된 안정성은 전사-복제 충돌을 폐지하고 안정적으로 상속된 플라스미드의 형성으로 이어진 플라스미드 본질복제에 의해 부여되었다. 우리의 결과는 이렇게 유전 요소의 적응 진화에 있는 재결합 그리고 게놈 증폭의 중요성을 보여줍니다.
<img alt="플라스미드 구성 다이어그램; PCR 증폭, 등온 융합, 대장균 형질 전환 과정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: pCON의 플라스미드 디자인. 플라스미드 pCON을 구축하는 데 사용되는 복제 전략의 개략적 표현. 플라스미드 백본(pBBR1) 및 항생제 내성유전자(nptII)는등등융합(20)에의해 PCR 증폭 및 융합된다. 이것은 플라스미드 pCON 및 스트레인 MG1655 pCON을 산출한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="대장균 지속성 테스트; 직렬 전송, 복제 도금 및 온도 변화의 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 장기 진화 실험의 설계. 직렬 전송 실험의 개략적 표현입니다. 플라스미드 운반(pCON) 모집단은 선택적 매체에 도금된다. 조상 식민지는 무작위로 접시에서 선택되어 직렬 전송 시스템에 도입됩니다. 전송은 서로 다른 크기의 인구 병목 현상을 시뮬레이션하기 위해 세 가지 희석 접근법으로 수행됩니다. 희석은 연속적으로 반복됩니다. 실험은 2개의 온도 정권에서 수행된다. 플라스미드 숙주 주파수는 복제 도금을 통해 실험을 따라 측정된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="식민지 복제 다이어그램; LB-한천 플레이트 이식, Km25 민감도 테스트, 미생물학 방법." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 복제 도금. 세균 집단의 복제 도금에 사용되는 단계의 개략적 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="박테리아 진화 그래프; 호스트 비율 대 전송; pCON 플라스미드에 대한 항생제 효과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 시간에 따라 대표pCON 주파수. pCON 지속성은 진화 실험 동안 호스트(대표 복제 모집단)의 비율로 나타난다. 98 전송을 위해, pCON 플라스미드 인구는10-4의희석 계수와 비선택적 조건 하에서 발전했습니다. 플라스미드 pCON을 운반하는 모든 복제는 인구에서 감소하였다. 그 후, 인구는 하룻밤 배양을 위한 항생제에 드러내고 플라스미드 안정성 진화를 위해 시험하기 위하여 비선택적 조건 하에서 다시 경배되었습니다. 이 그림은 Wein 등에서수정되었습니다. 8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="DNA 겔 전기영동, 제한 분석, 선형화, DNase 분해 결과, 다량체 밴드." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 플라스미드 형태에 대한 대표적인 분석. 모델 플라스미드 pCON의 시각화. 가시화는 추출 후 직접 치료되지 않은 플라스미드 DNA, 선형화 플라스미드 DNA, 그리고 효소적으로 닉닉된 DNA(즉, 오픈 서클 플라스미드 DNA)만 절단하는 DNase로 처리됩니다. 플라스미드를 선형화하면 모든 플라스미드의 크기가 동일하다는 것을 알 수 있습니다. 염색체 DNA를 제거하고 닉핑 pCON은 이dimers 및 그밖 multimers의 존재를 제시합니다. 이 그림은 Wein 등 에서수정되었습니다. 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리의 실험적인 접근은 세균성 인구에 있는 plasmid 풍부하고 항생 저항을 시간이 지남에 따라 전략을 제공합니다.

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

플라스미드는 세포 사이와 인구 사이를 이동할 수 있기 때문에 측면 유전자 전달의 아주 중요한 에이전트인 대부분의 세균성 종 및 서식지에서 유비쿼터스인 초염색체 원소입니다. 그 같은 전송의 가장 눈에 띄는 눈에 띄는 눈에 띄는 예 중 하나는 플라스미드에 인코딩 된 항생제 저항 유전자의 보급이다. 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 모델 플라스미드를 만들려면 플라스미드 백본을 선택하고 PCR은 플라스미드 템플릿에 결합되는 높은 충실도 폴리머라제와 프라이머를 사용하여 백본을 증폭시합니다. 우리의 경우 우리는 pBBR1 플라스미드 백본을 사용했습니다. 다음으로, 고충실도 폴리머라제를 이용하여 네이티브 Tn5 프로모터를 포함하는 내성 유전자 nptII를 증폭한다. 플라스미드 백본에 대한 서열 상보성의 약 20개의 기본 쌍을 가진 저항 유전자에 대한 프라이머를 설계한다. PCR 후, 정제된 저항 유전자 PCR 제품의 상동성 영역을 60분 동안 50도에서 이더스말 어셈블리를 사용하여 정제된 플라스미드 백본에 융합한다. 융합된 제품을 전기포공을 사용하여 E.Coli DH5-Alpha로 변환합니다. 선택적 매체에 혼합물의 100 마이크로리터를 플레이트하고 약 24시간 동안 37도에서 배양한다. 플라스미드는 추출, 검증 및 대장균 야생 형 균주 MG1655로 변환 할 수 있습니다. 이 수율 균주 MG1655 pCON.항생제 노출 하는 동안, 박테리아는 살아남기 위해 플라스미드를 필요로. 따라서, 플라스미드는 긍정적 인 선택하에있다. 비 선택적 조건하에서, 그래서 항생제없이, 플라스미드는 세포에 일회용이다. 우리의 연구의 목적은 시간이 지남에 따라 이러한 비 선택적 조건하에서 플라스미드를 따르는 것이었습니다. 이를 위해, 우리는 항생제 내성 유전자를 가진 작은 플라스미드를 장착하고 대장균에 그것을 소개했습니다. 우리는 진화 실험을 실시하고 복제 도금을 통해 플라스미드 주파수를 모니터링했습니다. 플라스미드 운반 균주 mg1655 pCON은 이제 진화 실험에 도입된다. 첫 번째, 플레이트 mg1655 pCON 에 LB 한천 접시 항생제로 보충 하 고 37도에서 하룻밤 배양. 이 접시에서 무작위로 8 조상 식민지를 선택하고 일정한 흔들림과 함께 37도에서 하룻밤 을 배양. 다음 날, 인구는 96 개의 깊은 우물 판에서 수행되는 실험으로 옮겨져 있습니다. 복제본을 플레이트 전체에 무작위로 분배하는 것이 매우 중요합니다. 예를 들어 바둑판 접근 방식에서. 우리의 실험에서 문화권은 희석되고 다른 희석속도와 두 가지 온도로 전달됩니다. 모든 전송 이벤트 동안 희석 처리가 적용되고 직렬 전송은 총 98 회 전송을 통해 반복됩니다. 진화 실험을 통해 인구에서 플라스미드의 빈도는 플라스미드 운반 세포의 비율에서 추정된다. 복제 도금은 1950 년대에 에스더와 조슈아 레더 버그에 의해 대중화 되었다 그들은 박테리아에서 약물 저항을 공부 하기 위해 그것을 사용. 이 방법은 표현형을 위해 그들의 스캐닝을 고급화할 수 있게 하고 연구 결과의 끝에 페니실린 저항이 게놈에 있는 자발적인 돌연변이 때문에 박테리아에서 생길 수 있다는 것을 밝혔습니다. 실험 중 인구의 플라스미드 주파수를 결정하기 위해 고정 배양은 비선택적 LB 천판에 연재적으로 희석되고 도금됩니다. 플레이트당 250 내지 500개의 콜로니의 수율에 따라 희석을 조정한다. 도금 된 인구는 24 시간 미만 37도에서 하룻밤 성장을 위해 배양됩니다. 식민지는 여전히 작을 때 복제하는 것이 가장 좋습니다. 하룻밤 성장 후 독자의 선택의 자동화 된 식민지 카운터를 사용하여 모든 식민지를 계산합니다. 이 배양에 총 박테리아 인구 크기를 산출. 플레이트 가장자리에 있는 식민지는 제외해야 합니다. 플레이트를 복제하려면 항생제로 보충된 선택적 한천 판, 둥근 블록, 블록에 맞는 금속 링 및 멸균 벨벳 천이 필요합니다. 이 자동 clavation에 의해 살균 할 수 있기 때문에 천은 100 % 면이 될 필요가있다. 블록에 천을 놓고 금속 반지로 고정합니다.조심스럽게 고정 벨벳 천 표면에 계산 된 식민지와 접시를 배치합니다. 모든 플레이트 표면이 천에 닿도록 원을 그리며 접시를 누릅니다. 모든 식민지가 벨벳을 만지는 것이 매우 중요합니다. LB 플레이트를 제거하고 선택 접시를 벨벳에 놓습니다. 주의 깊게 두드리는 것을 반복합니다. 접시가 벨벳에 완전히 닿는 것이 다시 중요합니다. 그 후, 선택적 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 하룻밤 동안 실온에서 배양됩니다. 다음 날, LB와 항생제 플레이트 모두 평가를 위해 필요합니다. 플레이트를 서로 위에 놓고 성장을 비교합니다. 식민지없는 공간을 쉽게 발견 할 수 있습니다. 이들은 항생제에 저항하지 않는 식민지입니다. 따라서, 이 식민지는 플라스미드를 잃었다. 결국, 항생제 판에 얼마나 많은 식민지가 누락되어 있는지 표시하십시오. 이 숫자는 당신에게 플라스미드 손실을 제공합니다. 진화 실험 주간 동안 모든 모집단의 복제도금을 반복한다. 플라스미드 손실은 플라스미드 다중 기형에 의해 발생할 수 있습니다. 플라스미드 구조에서 작업할 때 선호하는 숙주 변형에 주어진 유전자의 발현을 위해 국가가 취할 수 있는 확인과 관련하여 생체 내에서 플라스미드의 토착 행동은 일반적으로 간과되는 것이 간과된다. 그러나 진화적 맥락에서 그러한 변화의 확인은 매우 중요할 수 있습니다. 플라스미드 확인의 분석은 매우 까다로운 노력이 될 수 있습니다. 특히 플라스미드 멀티머는 PCR이나 시퀀싱으로 제대로 식별할 수 없기 때문에 분석하기 어렵다. 다른 한편으로는, 플라스미드 멀티머는 잠재적으로 큰 크기와 느린 전기 포동성 이동성 때문에 젤 전기 전광에 의해 분석하기 어렵습니다. 우리의 프로토콜은 내가 어떤 주어진 플라스미드 준비를 말할 것이다 에서 플라스미드 멀티머의 선별 및 식별을위한 간단하고 간단한 방법을 제공합니다. 시각적 플라스미드 분자는 알칼리성 용액을 사용하여 5 mL 고정 하룻밤 세포 배양에서 플라스미드를 추출한다. 낮은 복사 플라스미드의 플라스미드 추출은 종종 시각화 전에 소화해야 숙주 염색체 DNA로 오염으로 이어집니다. 염색체 DNA 오염을 제거하려면 플라스미드-세이프로 추출된 플라스미드 DNA를 치료합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 주어진 대상 시퀀스에 대한 임의의 돌연변이 라이브러리를 작성하는 간단한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 대장균의 생체내에서 수행됩니다이 방법은, 새로운 효소 활동을 진화하기 위해 기능 선택과 함께 할 수있는 방법을 보여줍니다.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

약물 농도를 동적으로 조정하여 항생제 약물 내성의 특성을 분석할 수 있는 저비용의 구성 가능한 모비드도스타트를 설명합니다. 이 장치는 다중화된 미세유체 플랫폼과 통합될 수 있습니다. 이 접근 방식은 실험실 항생제 약물 내성 연구를 위해 확장할 수 있습니다.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

여기 우리는 항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할을 테스트 하는 실험 방법 제시.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

우리는 mini-Tn7 기반 발현 시스템을 사용하여 Acinetobacter baumannii의 조작된 유출 결핍 균주에 유출 펌프 유전자의 단일 복제 염색체 보완을 위한 손쉬운 절차를 설명합니다. 이 정밀한 유전 도구는 유전자 발현을 제어할 수 있으며, 이는 다제내성 병원체에서 유출 펌프의 특성 분석에 핵심입니다.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

접근 가능한 오픈 소스 미세유체(microfluidic) 워크플로우는 박테리아의 플라스미드 보유에 대한 병렬 분석을 위해 제공됩니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 겔 미세방울 내 단일 세포 미세군체의 플라스미드 존재를 정량화함으로써 이 방법은 기존 플레이트 카운팅에 대한 정확하고 접근 가능하며 확장 가능한 대안을 제공합니다.

Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

배우세요 실험적 진화를 통해 E. coli에서 플라스미드 빈도와 항생제 내성을 추적하는 방법을. 복제 플레이팅으로 플라스미드 동역학을 정량화하여 세균 내성 연구에 활용할 수 있습니다.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

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