Name: 유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9와 전기천공을 활용한 동결 해동 배아를 이용한 유전자 변형 마우스의 고효율 생산 방법입니다. 이 기술은 높은 편집 효율과 낮은 모자이크 비율로 유전자 기능 연구와 질병 모델링에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

사와다 히토미와 엘리자베스 가르시아에게 동물 보호에 감사드립니다. 이 작품은 KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 및 16K01946)와 호쿠긴 연구 보조금 (H.N.에), 그리고 지치 의과 대학 젊은 조사상 (H.U.)에 의해 지원되었다. 오츠카 토시미 장학재단은 M.D.를 후원했습니다.

이 연구에서 수행된 모든 동물 관리 및 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 가이드의 규칙 및 규정에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 도야마 대학, 도쿄 대학, 지치 대학, 맥스 플랑크 플로리다 신경 과학 연구소의 실험실 동물의 동물 관리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 시약에 대한 정보는 재료 표에표시되어 있습니다.
1. CRISPR 시약 설계
<ol><li>crRNA 디자인<ol>
<li>CRISPR 다이렉트19 19(https://crispr.dbcls.jp/)를 방문하여 오프타겟 사이트가 줄어든 특정 crRNA를 설계합니다. 참고: crRNA 20(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/)을20 디자인하는 다른 많은 유용한 도구가 있습니다.</li>
		<li>표적 뉴클레오티드 서열을 삽입하고 다음과 같은 변경을 수행합니다. PAM 시퀀스 요구 사항 = NGG 특이성 검사 = 마우스 (무스 근육) 게놈, GRCm38 / mm10 (2011 년 12 월) 참고: 일례로, 티로시나제(Tyr) 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, 엑소온 2(9476-9692로부터의 뉴클레오티드 서열)를 표적으로 하였다.</li>
		<li>디자인을클릭하고 매우 구체적인 조회의 경우 매우 구체적인 대상만 표시합니다.</li>
		<li>잠재적인 오프 타겟 효과를 줄이려면"12 mer+PAM"및"8 mer+PAM"의열에서 가장 낮은 값으로 대상 시퀀스를 선택합니다. 참고: 이 열에서("1")은 시퀀스가 의도한 대상 사이트와 완벽하게 일치하는 지, 숫자보다 큰 숫자는 잠재적인 오프 타겟 사이트의 존재를 나타냅니다.1</li>
		<li>crRNA 합성 회사로부터 생성된 올리고뉴클레오티드를주문한다(상표 1). 참고: 엑소판 2 Tyr 유전자의 경우, 다음과 같은 표적 서열이 사용되었다: GGACCACTTACTACGTAATCC, +TGG를 PAM 서열로서(도 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) HDR 매개 편집 실험(즉, 노크인 마우스 생성)을 위한 설계.<ol>
<li>ssODN 길이를 양쪽에 30-60 개의 뉴클레오티드 (nt) 상동성 무기를 포함하여 약 80-180 bp로 설계하십시오. 참고: 30-35 nt 상동성 암 및 gRNA에 상보적인 것을 포함하는 75-85 nt 길이의 ssODN은, 높은 노크인 편집 효율21을보였다.</li>
		<li>PAM 서열에 의도된 수정 및 자동 돌연변이를 삽입하거나, 가능하지 않은 경우, 5′ PAM의 인접 베이스에서 게놈 편집 후 재절단을 차단한다. 참고: 본 연구에 사용된 crRNA 및 ssODN은 보충 표 1에나열되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 체외 수정, 배아 동결 보존 및 동결 해동
<ol><li>체외 수정<ol>
<li>슈퍼로볼레이트 C57BL/6J 암컷 마우스(4 또는 8주령)에 임신한 암말 혈청 생식샘 자극호르몬(PMSG)을 가진 IP 주사에 의한 후 48시간 후에 7.5 IU 인간 융생식샘자극호르몬(hCG)을 주사하였다. 참고: 배란 된 난모세포의 수는 초고배란22를사용하여 약 3 배 증가 될 수 있습니다.</li>
		<li>성적으로 성숙한 C57BL/6J 수컷 마우스(3-5개월 생)에서 카우다 부고디마이드를 제거합니다. 참고 : 남성 마우스를 희생하지 않고 정자를 수집 할 수 있습니다.</li>
		<li>해부 바늘로 정자의 혈전을 추출하고CO2 인큐베이터에서 인간 관 액 (HTF)의 200 μL 드롭에서 1.5 시간 동안 capacitation.</li>
		<li>hCG 주입 후 16-18시간 후 oviducts로부터 적운-난자 복합체(COC)를 수집하고 2시간 이하의CO2 인큐베이터(5%CO2,37°C)에서 파라핀 액체로 덮인 HTF 배지의 신선한 200 μL 드롭으로 배양한다. 참고:CO2 흡입을 통한 안락사로 인해 IVF 및 배아발달에영향을 미치기 때문에 마취하에 자궁경부 탈구에 의해 마우스를 희생하는 것이 바람직하다.</li>
		<li>인큐베이션 배지의 경계로부터 COCs를 함유하는 HTF 배지의 200 μL 드롭까지 1-5 μL의 정자 현탁액을 추가하고 3시간 동안CO2 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이터화한다.</li>
		<li>난모세포를 칼륨 보충 된 심플렉스 최적화 배지 (KSOM) 3 x로 씻어 남은 정자와 적운 세포를 제거하십시오.</li>
		<li>반전된 현미경을 사용하여 핵 형성 및 1세포 배아의 등급을 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 세포 배아의 동결 보존<ol>
<li>CO2 인큐베이터에서 10분 동안 20% FBS(파라핀 액체로 덮여 있지 않음)를 함유하는 HTF의2 200 μL 드롭에서 1세포 배아를 배양하였다.</li>
		<li>20-100개의 배아를 1M 디메틸 설폭사이드(DMSO)24용액(DMSO)의 50 μL로 옮니다.</li>
		<li>100개의 배아를 함유한 용액의 5 μL을 저온튜브 바닥으로 옮기고 냉각기 또는 얼음을 사용하여 0°C에서 5분간 식힙니다.</li>
		<li>45 μL의 DAP213(2M 디메틸 설폭사이드, 1M 아세타미드, 3M 프로필렌 글리콜) 용액을 튜브 벽을 따라 천천히 추가하고 튜브를 캡으로 막고 냉각기 또는 얼음에 0°C에서 5분 동안 보관합니다. 참고: 캡을 너무 단단히 고정하여 샘플 해동 중에 쉽게 제거하지 마십시오.</li>
		<li>튜브를 액체 질소에 빠르게 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아 해동<ol>
<li>저온튜브의 뚜껑을 열고, 남은 액체 질소를 버리고, 37°C로 예열된 0.25M 수크로오스 용액 900 μL을 첨가한다. 참고 : 0.25 M 수크로오스 용액은 차가운 용액의 사용이 해동 후 배아 생존력을 감소시키기 때문에 사전에 37 °C로 따뜻하게해야합니다.</li>
		<li>10 배 신속하게 파이펫과 플라스틱 접시에 냉동 튜브의 내용을 전송합니다. 참고 : 파이펫팅은 기포가 생성되지 않고 배아를 손상시키지 않도록 신중하게 수행해야합니다.</li>
		<li>파라핀 액체로 덮인 KSOM 배지에서 형태학적으로 정상적인 수정 난모를 2x 세척하고 전기 가루가 될 때까지CO2 인큐베이터에 보관합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. CRISPR 시약의 조립 및 전기 화
참고 : 전기 를 위해, 우리는 백금 플레이트 전극 (높이 : 0.5mm, 길이 : 10mm, 폭 : 3mm, 갭 : 1mm)와 이전에 설명 한 1 단계 형 전기 포더(재료 표)를사용했다. 2 단계 형 전기 포더도 사용할 수 있습니다(재료 표).
<ol><li>CRISPR 시약의 준비 및 조립<ol>
<li>HDR 매개 편집 실험을 수행하는 경우 CRISPR 시약(즉, crRNA, tracrRNA 및 Cas9 단백질)과 ssODN을 주문한다(재료표 및 보충표 1).</li>
		<li>어닐링 용액을 다음과 같이 준비합니다.<ol>
<li>감소 된 혈청 최소 필수 매체 용액(재료 표)에서1 μg / μL crRNA 및 1 μg / μL tracrRNA를 준비하고 각 용액의 6 μL을 뉴클레아제없는 완충액42 μL에 추가하십시오.</li>
			<li>95°C에서 건조 히터에 혼합물을 3분 동안 배양하고 RT에서 5분간 식힙니다.</li>
			<li>Opti-MEM I에서 희석된 1 μg/μL HiFi Cas9 단백질을 준비하고 총 부피 60 μL에 대해 이전 혼합물에 6 μL을 첨가합니다.</li>
			<li>HDR 매개 편집 실험을 수행할 때 6 μL의 1 μg/μL ssODN을 추가합니다. 최종 부피는 60 μL이어야 하기 때문에 3.1.2.1단계에서 36 μL의 뉴클레아제 없는 물을 사용하십시오. 참고: crRNA, tracrRNA, Cas9 단백질 및 ssODN의 최종 농도는 100 ng/μL입니다.</li>
			<li>1개의 홀 슬라이드 유리에 최종 혼합물(RNP 복합체)의 최대 100μL까지 100μL까지 전달하고 10분 동안 37°C에서 배양한다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>전기 기공화<ol>
<li>CRISPR 시약의 새로운 혼합물의 6 μL로 전극 갭을 채우고 혼합물에 20-25 개의 배아를 추가합니다. 참고: 전기 펄스 중에 배아를 손상시킬 수 있는 배아와 전기 천공 전극 사이의 접촉을 피하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>한 단계 형 전기 포더에 대한 다음과 같은 조건에서 전기 개더레이션을 수행 : 전압: 25V, 펄스 방향(Pd) + ON : 3 ms, 끄기 : 97 ms 반복: 5x 참고: 전기 포출은 모자이크를 방지하기 위해 첫 번째 DNA 복제 전에 게놈 편집이 발생하도록 해동 후 1 시간 이상 수행해야합니다.</li>
		<li>2단계 식 전기포더기의 경우 다음과 같이 조건을 설정합니다. 포링 펄스 = 40V, Pd + ON = 1 또는 2.5 ms; 펄스 간격 = 50 ms 반복: 4x, 감쇠 10% 전송 펄스 = 5 또는 7V; PD +/-. ON: 50 ms; 펄스 간격 = 50 ms. 반복 = 5x; 감쇠 = 40%. 참고: 제조업체에서 지정한 특정 범위 내에서 임피던스를 유지하려면 볼륨을 조정하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>수정된 크렙스 링거 중탄산염 완충제 2(M2) 배지로 배아를 3x 세척한 다음, 파라핀 액체로 덮인 KSOM 배지 한 방울로 2개의 세척을 하였다.</li>
		<li>세척된 배아(KSOM 배지)를CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하여 추가 이식을 위해 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 배아 이식
<ol><li>의사 임신 여성 마우스를 준비합니다. 메이트 ICR 암컷 마우스 (3-6 개월) vasectomized 남성 마우스와 함께 1 일 배아 전송 하기 전에 (ET). 참고 : 마우스는 copulatory 플러그에 대한 다음 아침을 확인해야합니다. 플러그가있는 마우스는 의사 임신으로 간주되며 ET에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>흡입 공기 및 KSOM (파라핀 액체 없이) 성공적인 이식을 위한 마커로서 유리 모세관에 2-3 mm의 교대 간격으로.</li>
	<li>20-24개의 배아를 KSOM 200 μL 드롭(파라핀 액체 제외)에 넣고 각 난관에 이식하기 위해 10-12개의 배아를 유리 모세관에 그립니다.</li>
	<li>이소플루란 (흡입) 또는 메데토비미딘/미다졸람/부토판놀(0.3 mg/kg, 4.0 mg/kg, 및 5.0 mg/kg)을 결합한 용액의 IP 주입으로 암컷 마우스를 마취시금으로 마취시금. 마취된 마우스를 가열 패드의 복부 쪽에 놓습니다. 보습 젤로 마취 된 마우스의 눈을 보호하십시오.</li>
	<li>등쪽 중간선의 하부부분을 따라 면도하고 포비돈의 요오드로 주변을 소독하고 70% 에탄올로 소독합니다.</li>
	<li>등지 중간선에 평행하게 긴 ~ 1cm 절개를합니다.</li>
	<li>난관을 꺼내 멸균 플라스틱 커튼에 놓습니다. 따뜻한 멸균 식염수로 촉촉하게 유지하십시오.</li>
	<li>입체 현미경 아래에 난관을 놓습니다.</li>
	<li>마이크로스프링 가위로 암풀라상류에서 몇 밀리미터 상류에 있는 인펀디벌룸과 암풀라 사이의 난관 벽에 구멍을 뚫습니다.</li>
	<li>배아를 포함하는 유리 모세관의 끝을 구멍에 넣고 모세관 홀더의 마우스피스에 부드럽게 불어 기포가 암풀라에서 보일 때까지 배아를 추방합니다. 참고: 난관 당 10-12 배아 사이 를 전송합니다.</li>
	<li>난관 벽에서 유리 모세관을 철회하고 생식 기관을 부드럽게 다시 신체 구멍으로 밀어 넣습니다.</li>
	<li>배아를 다른 난관에 도입하기 위해 이전 과정을 반복합니다.</li>
	<li>ET 절차를 완료하면, 간단한 중단 봉합패턴 (50, 흡수성, 편조 합성 봉합사)으로 복막을 봉합한 다음 간단한 중단 패턴 또는 매장 된 피하 중단 스티치 패턴 (60)으로 피부를 봉합하십시오. 흡수성, 단합성 봉합사).</li>
	<li>마취에서 회복 될 때까지 37 °C 온난화 판에 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.</li>
	<li>수술 후 7일 동안 매일 동물의 건강을 모니터링하십시오.</li>
</ol>5. 지질 분석 및 서열 분석
<ol><li>게놈 DNA 추출 참고: 우리는 NucleoSpin 조직 DNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 권고에 따라 마우스 귀 조직에서 게놈 DNA를 추출했습니다.<ol>
<li>180 μL의 버퍼 T1과 25 μL의 프로틴라제 K 용액을 시료에 넣고 10초 동안 와르싱하여 혼합합니다.</li>
		<li>56°C에서 2시간 동안 또는 완전한 용해가 얻어지실 때까지 배양합니다. 인큐베이션의 30분마다 10초동안 소용돌이.</li>
		<li>완충B3 200 μL을 추가하고, 30초 동안 격렬하게 소용돌이를 넣고, 70°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>시료와 와류에 100% 에탄올 210 μL을 힘차게 넣습니다.</li>
		<li>각 샘플에 대해 하나의 조직 컬럼을 수집 튜브에 넣고 샘플을 컬럼에 적용합니다.</li>
		<li>11,000 x g에서1 분 동안 원심 분리기를 버리고 흐름을 버리고 컬럼을 수집 튜브에 다시 놓습니다.</li>
		<li>버퍼 BW 500 μL을 추가하여 샘플을 세척하고(1차 세척), 1분 동안 1분 동안 원심분리기를 11,000 x g에서제거하고 흐름을 버리고 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>버퍼 B5 의 600 μL을 컬럼 (2 차 세척)에 추가하고 1 1 분 동안 1 분 동안 원심 분리기를 11,000 x g에서넣고 흐름을 버리고 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>11,000 x g에서 1 분 동안 컬럼을 원심 분리하여 실리카 막을 건조시키고 NucleoSpin 조직 컬럼을 1.5 mL 미세 원심 분리지 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>버퍼 BE 100 μL을 넣고 실온에서 1 분 동안 배양 한 다음 11,000 x g에서1 분 원심 분리합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR 증폭 및 정제<ol>
<li>표적 궤적을 둘러싼 400-500 bp 서열을 증폭시키기 위해 프라이머3 플러스 웹사이트(https://primer3plus.com/)를 사용하여 프라이머를 설계한다.</li>
		<li>새로운 PCR 프로토콜을 설계하고 경험적으로 테스트합니다.</li>
		<li>원치 않는 효소, 뉴클레오티드, 프라이머 및 완충 성분을 제거하기 위해 PCR 제품을 정제합니다. 표준 정제 방법은 다음과 같이 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>PCR 제품의 50 μL에 페놀 50 μL을 넣고 소용돌이로 섞습니다.</li>
			<li>11,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기를 하고 상부 투명 층을 새로운 튜브로 옮긴다.</li>
			<li>99.5% 에탄올 120 μL, 30초 동안 5M 암모늄 아세테이트 및 와류 20 μL을 첨가합니다.</li>
			<li>RT에서 10분, 원심분리기를 11,000 x g에서 10분 동안 유지합니다.</li>
			<li>상급제를 버리고 70 % 에탄올 1 mL로 DNA 펠릿을 씻으십시오.</li>
			<li>RT에서 펠릿을 10분 동안 건조시키고 10 μL의 RNase 자유물에 녹입니다. 참고: 페놀은 인체에 독성이 있기 때문에 PCR 컬럼 기반 정제 키트는 다시 주석을 달수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>생거 시퀀싱<ol>
<li>DNA 정량 분석(재료 표참조)을 실행하여 정제된 PCR 앰플리폰을 정량화합니다.</li>
		<li>PCR 제품 및 시퀀싱 프라이머를 시퀀싱 서비스 공급자에게 보냅니다.</li>
		<li>사용 가능한 온라인 웹 사이트를 사용하여 순서를 분석합니다. 참고: 이 연구에서는 CRISP-ID 25(http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/)를 서열 분석에 사용했습니다.25</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2Fcas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA+-+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-822 (2012).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FVCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Mashiko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mutant+mice+by+pronuclear+injection+of+circular+plasmid+expressing+Cas9+and+single+guided+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA.</a> Scientific Reports. 3, 3355(2013).</li>
<li>Yen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mosaicism+and+allele+complexity+induced+by+CRISPR%2FCas9+RNA+injections+in+mouse+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes.</a> Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS ONE. 10 (11), 1-7 (2015).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382(2014).</li>
<li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR%2FCas9-based+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315(2015).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockout+mice+by+DNA+microinjection+of+various+CRISPR%2FCas9+vectors+into+freeze-thawed+fertilized+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Darwish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-efficient+generation+of+mutant+mice+using+freeze-thawed+embryos+of+the+C57BL%2F6J+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frozen-thawed+oocytes+for+efficient+production+of+normal+offspring+from+cryopreserved+mouse+spermatozoa+showing+low+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility.</a> Comparative Medicine. 55 (2), 136-139 (2005).</li>
<li>Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRdirect%3A+Software+for+designing+CRISPR%2FCas+guide+RNA+with+reduced+off-target+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites.</a> Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).</li>
<li>Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WeReview%3A+CRISPR+Tools-Live+Repository+of+Computational+Tools+for+Assisting+CRISPR%2FCas+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments.</a> Bioengineering. 6 (3), 63(2019).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 4811(2019).</li>
<li>Takeo, T., Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superovulation+using+the+combined+administration+of+inhibin+antiserum+and+equine+chorionic+gonadotropin+increases+the+number+of+ovulated+oocytes+in+C57BL%2F6+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-11 (2015).</li>
<li>Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+via+CO2+inhalation+causes+premature+cortical+granule+exocytosis+in+mouse+oocytes+and+influences+in+vitro+fertilization+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development.</a> Molecular Reproduction and Development. 86 (7), 825-834 (2019).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rate+of+unfertilized+mouse+oocytes+after+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 87 (2), 479-483 (1989).</li>
<li>Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISP-ID%3A+Decoding+CRISPR+mediated+indels+by+Sanger+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing.</a> Scientific Reports. 6, 28973(2016).</li>
<li>Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+genome+editing+in+vitrified%2Fwarmed+mouse+zygotes+created+by+ivf+via+ultra-superovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation.</a> Experimental Animals. 67 (4), 535-543 (2018).</li>
<li>Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+albino+Xenopus+tropicalis+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases.</a> Development Growth and Differentiation. 54 (9), 777-784 (2012).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).</li>
<li>Dumeau, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+gene+deletions+by+mouse+zygote+electroporation+of+Cas12a%2FCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1.</a> Transgenic Research. 28 (5-6), 525-535 (2019).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+Generation+of+Knockin+Mice+by+CRISPR+RNP+Electroporation+and+AAV+Donor+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+Gene+Cassette+Knockin+by+CRISPR%2FCas9-Mediated+Genome+Editing+with+Adeno-Associated+Viral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+RNA-guide+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+Mitotic+Checkpoint+Signaling+and+Kinetochore+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Smits, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Plasticity+Rescues+Target+Activity+in+CRISPR+Knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts.</a> Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).</li>
</ol>

저자는 관련 재무 공시가 없습니다.

기재된 프로토콜은 높은 효율과 낮은 모자이크 레이트(표1)를가진 GM 마우스의 생성을 허용한다. CRISPR/Cas9 리보뉴클레오프로테인(RNP) 및 동결 해동 배아로의 전기 화: 생식 공학 및 게놈 편집 기술 모두에서 가장 유용한 최신의 진보를 활용하기 때문에 고급 배아 조작 기술이 없는 연구원은 돌연변이 마우스를 쉽게 만들 수 있습니다. 이러한 발전은 GM 마우스의 생성을 촉진하고 신속히 진행하였다. 도 3에기재된 바와 같이, GM 마우스를 생성하는 데 ~4주가 걸린다. 유사한 접근법26을사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리의 방법은 효율성, 출산율 및 모자이크의 측면에서 우수하다.
동결 보존 전에 FBS에서 1 세포 배아의 배양은 배아의 발달 속도를 개선하는 데 중요합니다. 프로토콜에 기술된 저온 보존 배아의 전기 천공 조건은 CRISPR 시약의 편...

클러스터된 정기적으로 간격을 두는 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 시스템은 게놈1에있는 전례 없는 표적으로 한 수정을 제공하는 과학적인 돌파구입니다. CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 가이드 RNA(gRNA)와 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 CRISPR RNA(트라크RNA)2로 구성됩니다. gRNA는 Cas9 단백질을 게놈내의 특이적 궤적, 20개의 뉴클레오티드가 crRNA에 상보적이며, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접하여 지시한다. Cas9 단백질은 표적 서열에 결합하고 오류가 발생하기 쉬운 비동동성 단부 접합(NHEJ) 또는 고충실도 상동성 상동성 수리(HDR)3,,4,,5에의해 수리되는 이중 가닥 파손(DSB)을 유도합니다. NHEJ는 삽입 및 /및 삭제 (indels)로 이어지며, 따라서 코딩 서열이 표적화 될 때 기능의 유전자 손실로 이어집니다. HDR은 상동성 서열을 포함하는 복구 템플릿의 존재에 정확한 게놈 편집에 이르게3,,4,,5. NHEJ와 HDR은 각각 녹아웃 및 노크 인 마우스를 생성하기 위해 활용되었습니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 뛰어난 효능과 충실도를 갖춘 GM 마우스의 생성을 현저히 가속화했지만, 이러한 방법을 적용하는 과학자들은 종종 기술적 인 과제를 겪습니다. 첫째, 종래의 프로토콜은 수정란6,,7의프로핵에 CRISPR 편집 도구를 도입하기 위한 미세 주입이 필요하다. 이 기술은 시간이 많이 걸리며 일반적으로 광범위한 교육이 필요합니다. 따라서 여러 그룹이 미세 주입을 전기 천공8,,9,10,,11,12,13으로대체했습니다. 그러나, 초기 전기 천공 프로토콜에서 신선한 배아는 전기 천공에 사용되었다. 이는 각 실험 전에 신선한 배아를 준비하는 것이 어렵기 때문에 또 다른 문제를 일으켰다14.
최근 우리및 다른 사람들은 동결해동배아의 사용을 결합하여 게놈 편집을 위한 전기포공화, 이는 GM마우스(15,,16)의생성을 용이하게 한다. 이 프로토콜은 고급 배아 조작 기술이없는 연구원이 고효율로 인간 질병의 동물 모델을 신속하게 생성 할 수 있게합니다. 이 프로토콜은 또한 설립자16에서유전적 이질성과 같은 GM 마우스 생성에 대한 실질적인 과제를 현저히 감소시킨다. 모자이크주의를 극복하기 위해, 우리는 게놈의 첫 번째 복제 전에 편집이 발생하는지 확인하기 위해 배아 해동 후 1 시간 이내에 CRISPR 시약의 전기 천공을 수행합니다. 또 다른 개선은 바람직하지 않은 모자이크주의를 감소시키기 위해 Cas9 mRNA 대신 Cas9 단백질의 사용을 포함한다17. 또한, 우리는 2 세포 단계16에발달 속도를 증가시키는 1 세포 배아 동결 보존을위한 최적의 방법을 개발 : 태아 소 혈청 (FBS)의 사용은 극적으로 수정 후 동결 해동 oocytes의 생존을 향상, 아마도 동결 해동 비 수정 oocytes더탄력18을만드는 동일한 메커니즘에 의해.
여기에서 우리는 1 세포 C57BL/6J 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법을 포함하여 동결 해동 된 배아를 사용하여 GM 마우스의 생성을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 여기에는 1) gRNA 설계, CRISPR 시약 제제 및 조립이 포함됩니다. 2) IVF, 동결 보존, 및 1 세포 배아의 해동; 3) CRISPR 시약의 전기 화동결 해동 배아; 4) 가성 임신 한 여성 마우스의 난관으로 배아 전달; 및 5) F0 설립자 동물의 게노티핑 및 서열 분석.

<table><tbody><tr><td>0.25 M 자당</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>SUCROSE</td><td></td></tr><tr><td>1 M DMSO</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>1M DMSO</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (일본 도쿄)</td><td>Vetorphale 5mg</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein: Alt-R&reg; S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>일본 SLC(일본 하마마츠)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAP213</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>DAP213</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. (미주리주 세인트루이스)</td><td>ES-009-C</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>MOCHIDA Pharmaceutical Co., Ltd. (일본 도쿄)</td><td>HCG Mochida 3000</td><td></td></tr><tr><td>HTF</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>HTF</td><td></td></tr><tr><td>ICR 마우스</td><td>일본 SLC (일본 하마마츠)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Petterson Vet Supply, Inc. (콜로라도주 그릴리)</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>KSOM</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>KSOM</td><td></td></tr><tr><td>LN2 Tank</td><td>Chart Industries (Ball Ground, GA)</td><td>XC 34/18</td><td></td></tr><tr><td>M2</td><td>ARK Resource Co., Ltd. (일본 구마모토)</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. (Koriyama, Japan)</td><td>1124401A1060</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Co. (Tokyo, Japan)</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Sandoz K.K. (Tokyo, Japan)</td><td>1124401A1060</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free buffer</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin DNA extraction kit</td><td>Takara Bio Inc (쿠사츠, 일본)</td><td>740952 .5</td><td></td></tr><tr><td>원 홀 슬라이드 글라스</td><td>Matsunami Glass Ind. (키시와다, 일본)</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>원스텝 타입 Electroporator</td><td>BEX Co., Ltd. (도쿄, 일본)</td><td>CUY21EDIT II</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 리퀴드</td><td>NACALAI TESQUE Inc. (교토, 일본)</td><td>SP 26137-85</td><td></td></tr><tr><td>백금 플레이트 전극</td><td>BEX Co., Ltd. (도쿄, 일본)</td><td>LF501PT1-10, GE-101</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>ASKA Animal Health Co., Ltd (일본 도쿄)</td><td>SEROTROPIN 1000</td><td></td></tr><tr><td>포비돈 요오드화물</td><td>Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY)</td><td>C12400</td><td></td></tr><tr><td>환원혈청 최소 필수 배지: OptiMEM I</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO)</td><td>22600134</td><td></td></tr><tr><td>2단계 타입 Electroporator</td><td>Nepa Gene Co., Ltd. ( 일본 이치카와)</td><td>NEPA21</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

유전자 변형 (GM) 마우스의 사용은 유전자 기능을 이해하고 인간 질병의 기본 메커니즘을 해독하는 데 중요해졌습니다. CRISPR/Cas9 시스템을 통해 연구자들은 전례 없는 효율성, 충실도 및 단순성으로 게놈을 수정할 수 있습니다. 이 기술을 활용하여 연구원들은 GM 마우스를 생성하기 위한 신속하고 효율적이며 쉬운 프로토콜을 찾고 있습니다. 여기에서 우리는 동결 해동 된 배아의 더 높은 발달 속도로 이어지는 1 세포 배아의 냉동 보존을위한 개선 된 방법을 소개합니다. 최적화된 전기 천공 조건과 결합함으로써 이 프로토콜은 짧은 시간 내에 고효율 및 낮은 모자이크 비율로 녹아웃 및 노크인 마우스를 생성할 수 있게 합니다. 또한, 우리는 CRISPR 시약 준비, 체외 수정, 동결 보존 및 1 세포 배아의 동결 보존 및 해동, CRISPR 시약의 전기 천공, 마우스 생성 및 설립자의 게놈을 포함하는 최적화 된 프로토콜에 대한 단계별 설명을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 연구원은 비교할 수 없는 용이성 GM 마우스를 준비 수 있어야, 속도, 그리고 효율성.

1M DMSO 및 DAP213 용액에서 동결 보존을 한 후 10 분 동안 20 % FBS를 함유하는 HTF에서의 배양을 포함한 1 세포 배아의 냉동 보존을위한 우리의 수정 된 방법은 동결 해동 된 배아의 발달 속도를 2 세포 단계로 향상시켰습니다(그림 1, p = 0.009, 학생 t-test). 동결 해동 배아는 GM 마우스의 생산을 위해 사용되었고 전기 포어화 조건은 최적화되었다: 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 전기포더레이터를 사용하여 3 ms 펄스와 97 ms 간격으로 25 V의 5회 반복. 프로토콜의 적용성은 알비노 티로시나아제 유전자(Tyr) 녹아웃 마우스의 생성에 의해확인되었다(도 2). 이를 위해, gRNA 표적화 엑손2(도 2A)와CRISPR 시약을 프로토콜 섹션에 기재한 대로 제조하였다. 편집 도구는 게놈의 첫 번째 복제 전에 발생 게놈 편집을 보장하...

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

우리의 프로토콜은 단일 세포 마우스 배아에서 유전자 변형 마우스의 쉽고 효율적이며 신속하게 제조를 용이하게합니다. 우리의 프로토콜은 동결 해동 된 1 세포 단계 배아와 전기 기공의 사용을 결합하여 고효율 및 낮은 모자이크 속도로 돌연변이 마우스를 포함한 유전자 변형 마우스의 빠른 생성을 허용합니다. 체외 수정의 경우, 임신 한 암말 혈청 생식선 호르몬의 7.5 국제 단위의 인트라보네탈 주사를 통해 4 또는 8 주 된 여성 C57BL / 6J 마우스를 4 8 시간 후에 슈퍼 배란하여 시작하십시오.다음으로, 성적으로 성숙한 3~5개월 된 남성 C57BL/6J 마우스에서 카우다 부피티미스를 제거하고 해부 바늘을 사용하여 정자의 혈전을 추출합니다. 그런 다음 HTF의 200 마이크로 리터 드롭에서 혈전을 섭씨 37도, 이산화탄소 는 5%로 1.5시간 동안 배양합니다. 인간의 융기 생식선 주입 후 16~18시간, 난소에서 적정 성 난낭 복합체를 수집하고 200개의 HTF 마이크로리터로 복합체를 배양하여 세포 배양 인큐베이터에서 2시간 이하의 배양에 대한 큐베이션을 한다.인큐베이션의 끝에서, 잠복기 배지의 경계에서 정액 현탁액의 1 내지 5 마이크로리터를 적혈구 난모세포 복합체의 200 마이크로리터 드롭에 추가하고 세포 배양 인큐베이터에 공동 배양을 3 시간 동안 배치한다. 인큐베이션의 끝에서, 칼륨보충 간단한 임의의 최적화 매체를 세 번 세척하여 남은 정자와 적수 세포를 제거하고 반전된 현미경을 사용하여 한 세포 배아의 프로핵 형성 및 등급을 확인한다. 1개의 세포 배아 냉동 보존을 위해, 세포 배양인에 있는 10 분 인큐베이션을 위해 20% 태아 소 혈청으로 보충된 HTF의 신선한 200 마이크로리터 드롭으로 배아를 전송합니다.인큐베이션이 끝나면 20~100개의 배아를 1개의 어금니 디메틸 설옥산화물 용액의 50마이크로리터로 이송하고 용액 5마이크로리터에서 최대 100개의 배아를 극저온튜브 바닥으로 옮기다. 튜브 의 측면에 DAP213 용액의 45 마이크로 리터를 추가하기 전에 0섭씨에서 5 분 동안 배아를 식힙니다. 캡핑 후, 액체 질소에 튜브를 신속하게 저장하기 전에 0섭씨에서 추가로 5 분 동안 세포를 유지합니다.CRISPR RNA의 마이크로리터 당 1 마이크로그램과 극치의 혈청 최소 필수 배지로 tracrRNA의 마이크로리터 당 1마이크로그램을 준비합니다. 각 RNA 용액의 6마이크로리터를 42마이크로리터의 뉴클레아제 프리 버퍼에 추가하고 혼합물을 섭씨 95도에서 3분간 건조 히터에 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 실온에서 혼합물을 5분간 냉각하고 HiFi Cas9 단백질의 마이크로리터당 1마이크로그램을 최소한의 필수 배지로 준비합니다.희석된 HiFi Cas9 용액6마이크로리터를 RNA 용액에 추가하고 최대 100개의 해동된 배아를 하나의 전체 유리 슬라이드에 생성된 리보뉴클레오단백질 복합용액의 25마이크로리터로 이송한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10 분 동안 배양합니다. 배아 전기포기의 경우, 배양의 끝에 전기포레이터 파라미터를 설정하고 슬라이드를 전기포레이터에 적재한다.전기기는 게놈 편집이 DNA의 첫번째 복제의 앞에 생기고 모자이크를 방지하기 위하여 태아 해동의 1 시간 안에 능력을 발휘해야 합니다. 전기포기 후, 변형된 크렙스 링거 중탄산염 완충제 2매를 2개의 세척으로 3회 세척하여 칼륨 한 방울을 함유하고 액체 파라핀으로 덮인 심플렉스 최적화 배지를 보충한다. 그런 다음 신선한 칼륨으로 배아를 배양하여 하룻밤 동안 세포 배양 배양에서 심플렉스 최적화 배지를 보충하였다.1세포 배아를 위한 이 수정된 냉동 보존 방법을 사용하면 동결 해동된 배아의 발달 속도를 2세포 단계로 향상시킨다. 이 방법을 사용하여, 본 대표적인 실험에서 생성된 마우스의 모든 것은 백색과 검은색 패치로 코트를 베어링한 모자이크 마우스가 하나만 있는 알비노였다. 여기서 M1 대립구를 포함하는 알비노 마우스로부터 크로마토그램의 대표적인 부분을 관찰할 수 있다.그림과 같이, 프로토콜은 높은 효율과 낮은 모자이크 비율로 녹아웃 및 노크 마우스를 생성할 수 있습니다. 실제로, 호머지구스 F0 자손의 F1 자손은 이질적인 돌연변이가 없는 1개의 돌연변이및 1개의 야생모형 대립유전자를 포함하는 이종화구입니다. 수정란이 한 세포 단계에서 깨지기 쉽다는 것을 기억하십시오.태아 소 혈청의 첨가는 배아를 강화합니다. 그러나 각 단계에서 신중하게 처리해야 합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스의 빠르고 효율적인 생산을 촉진하여 인간 질환에서 유전자 기능 및 연구의 분석에 기여할 수 있습니다.

use-freeze-thawed-embryos-for-high-efficiency-production-genetically

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.

수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation

마우스 배아의 에틸렌 글리콜 기반 vitrification 방법이 설명되어 있습니다. 그것은 단순하고 낮은 배아 독성의 다른 방법에 유리하고, 따라서 근친과 유전자 - 수정된 생쥐를 포함하여 마우스의 여러 변종에 광범위하게 적용하실 수 있습니다.

에틸렌 글리콜 기반 Vitrification에 의한 마우스 태아의 Cryopreservation

여기 마우스 정자 cryopreservation을 위해 새로 개발된 I • Cryo 키트를 보여줍니다. 냉동 - 해동 정자와 두 개의 세포 단계의 배아 개발이 키트의 사용 5 마우스 종자에 지속적으로 개선되었다. 1.5 년 동안, 49 유전자 변형 마우스 라인 전 • Cryo 키트와 정자 cryopreservation에 의해 보관했다 나중에 성공적으로 IVF로 회복되었습니다.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

여기 우리는 새로운 장비를 사용 하지 않고 키메라 생산을 증가 하는 프로토콜을 제시. 주입에 대 한 배아의 단순한 방향 변경 생산, 배아의 수를 증가 하 고 잠재적으로 생식 전송 타임을 줄일 수 있습니다.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

제시된 자궁 경부 조작 방법은 정관 수술을받은 수컷과 암컷을 번식시킬 필요없이 생쥐에서 가임신을 유도 할 수 있습니다. 비수술적 배아 이식과 비수술적 인공수정의 성공을 위해서는 가임신유도가 필요하며, 이 두 가지 모두 제시되어 있다.

비수술적 배아 이식 또는 인공 수정 전에 정관 수술을 받은 수컷 없이 암컷 마우스에서 가임신을 유도하는 행위

배우세요 CRISPR/Cas9와 전기천공을 활용한 동결 해동 배아를 이용한 유전자 변형 마우스의 고효율 생산 방법입니다. 이 기술은 높은 편집 효율과 낮은 모자이크 비율로 유전자 기능 연구와 질병 모델링에 필수적입니다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

더 많은 동영상 탐색