Name: 란탄제 기반 분자 단결정에서 광학 이방성 연구를 위한 도구로서의 하이퍼스펙트럼 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 배우세요 하이퍼스펙트럼 이미징을 활용하여 란탄제 기반 분자 단결정의 광학 이방성을 분석하는 방법을. 이 기술은 스펙트럼과 공간 데이터를 결합하여 재료의 구조-특성 관계를 상세히 연구할 수 있게 합니다.

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저자는 [TbEu (bpm)(tfaa)6]단결정의 제공에 대한 오타와 대학의 화학 및 생물 분자 과학학과에서 씨 딜런 Errulat및 교수 Muralee Murugesu 감사합니다. E.M.R, N.R., E.H.는 오타와 대학, 캐나다 혁신 재단(CFI), 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)가 제공하는 재정적 지원을 감사하게 생각합니다.

주의: 이미저를 조작할 때 항상 사용되는 여기 파장에 맞는 안전 고글을 사용하는 것이 좋습니다.
1. 고스펙트럼 현미경의 구성
참고: 하이퍼스펙트럼 이미징 시스템의 개요는 그림 2a에있으며, 이미서의 주요 구성 요소는 설명되어 있습니다. 이미징 시스템은 시료로부터 가시광선 또는 근적외선(NIR) 방출의 검출에 사용될 수 있다. 어떤 검출이 필요한지(가시 또는 NIR)에 따라 라이트는 두 개의 서로 다른 광경로(그림 2e)를통과합니다. 서로 다른 빔 선회 큐브와 이색 필터 큐브(광학 큐브)의 조합은 각각의 경로를 선택하기 위해 계측기의 특정 위치에 배치되어야 합니다.
<ol><li>이미징 시스템에 연결된 컴퓨터의 전원입니다. 컴퓨터 모니터를 켭니다.</li>
	<li>적절한 광학 큐브 구성을 설정합니다(그림2b,c). 참고: 여기서, UV 여기 및 가시 방출 검출을 이용한 HSI 매핑에 대한 이미저구성(optical cube configuration)이설명된다. 그러나 분석된 샘플에 따라 NIR 여기 및 가시 또는 NIR 방출 검출을 위해 이를 변경할 수도 있습니다. 대표 결과 섹션을 참조하여 예를 들어 보겠습니다.<ol>
<li>현미경 단계(도 2a에서1)에서 시작하여 검출기를 향한 방출 빔 경로를 따라(도 2a에서3), 광학 큐브에 대한 첫 번째 위치를 남기고(도 2b에서4) 공석을 두고 공초점 현미경 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2b에서5로 표시된 위치에 배치하여 시료로부터의 방출이 가시광선 경로를 통해 전달되도록 한다.</li>
		<li>검출기를 향한 광학 경로를 따라, 도 2b에서6으로 표시된 위치에서, 검출 경로로 가시 방출을 지시하기 위해 이색 거울 및 필터를 포함하는 가시 광학 큐브(CM1-P01)를 배치한다.</li>
		<li>검출기를 향한 경로를 계속, 공초점 핀홀 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2b에서 7로 표시된 위치에 배치하여 가시광 검출 경로를 통해 빛을 지시한다. 그런 다음 경로를 따라 공초점 분광계 광학 큐브(DFM1-P01)를 도 2c의 위치 8에 배치하여 방출된 빛이 검출기에 도달되도록 합니다.</li>
		<li>HSI 매핑의 경우 사용되는 핀홀의 크기와 일치하도록 검출기 슬릿 개구부(그림 2c의9)를 수동으로 제어합니다(약 50mm는 최적입니다).</li>
		<li>PHySpec 소프트웨어에서 핀홀의 조리개를 선택합니다(그림 3의5). 참고: 핀홀 조리개가 작을수록 신호 강도가 희생되는 HSI 해상도가 좋습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스위치(도2d에서 도 2d)를 ON 위치에 배치하여 광대역 램프(그림2d,인세트)를 켭니다. 여기 빛의 강도를 제어하려면 11(그림2d)으로표시된 노브를 더 높은 값(32 – 가장 낮은 강도) 또는 더 낮은 값(1 – 가장 높은 강도)으로 돌립니다. 광대역 램프 셔터(도 2d의12)를 설정 하는 동안 닫혀 있습니다. 주: 값이 높을수록 램프에서 방출되는 전력 밀도의 감쇠가 높고 값이 낮을수록 감쇠가 낮아집니다.</li>
	<li>스위치를 ON 위치로 설정하여 아래 순서대로 다음 하드웨어를 켭니다.<ol>
<li>ThorLabs 모션 컨트롤러를 켭니다.</li>
		<li>니콘 전원을 켭니다.</li>
		<li>ASI 컨트롤러를 켭니다.</li>
		<li>갈보 컨트롤러를 켭니다.</li>
		<li>ProEm 검출기를 켭니다.</li>
		<li>베이스펙 감지기를켭니다.</li>
	</ol></li>
	<li>컴퓨터에서 PHySpec 소프트웨어를 아이콘을 두 번 클릭하여 엽니다.<ol>
<li>IMA 업컨버전 시스템을 초기화하려면 키보드의 F8 키를 누르고 시스템에 연결 창에서 확인 버튼을 클릭합니다. 참고: 1.5.1단계. 시스템 탭을 클릭한 다음 연결을 클릭하여 시스템에 연결 창에 도착하여 수행할 수도 있습니다. 그런 다음 OK 버튼을 클릭하여 이미징 시스템을 소프트웨어에 연결할 수 있습니다.</li>
		<li>그림 3과같이 모든 메뉴가 인터페이스(컬러카메라, ProEm 및 Bayspec)와화면 왼쪽에 있는 계측기 제어판에 표시되는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. [TbEu(bpm)(tfaa)6]단결정의 하이퍼스펙트럼 이미징
<ol><li>샘플을 준비하기 위해 현미경 유리 슬라이드에 결정을 놓습니다. 더 높은 배율을 사용해야 하는 경우, 얇은 커버 유리로 크리스탈을 덮고 테이프로 고정하여 시료를 대물 렌즈를 향하도록 얇은 커버 유리로 배치할 수 있습니다.</li>
	<li>샘플이 현미경 단계에서 제조된 유리 슬라이드를 놓고 금속암(그림 4a,b)을사용하여 고정합니다.</li>
	<li>사용 목적 위에 샘플을 배치하기 위해 ASI 컨트롤러의 조이스틱(그림4c)을사용하여 샘플을 이동합니다.</li>
	<li>올바른 필터 큐브를 목표 아래 바퀴에 수동으로 배치하여 램프의 UV 여기를 선택하고 검출기쪽으로 가시 방출을 전달하도록 합니다(그림 5의3). 참고: 추가 필터 큐브는 녹색 또는 파란색 광등 여기를 사용할 수 있으므로 적절한 여기 파장에 적합한 필터 큐브를 배치하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>20X 목표(그림 5에서5로 표시)를 샘플 아래에 수동으로 배치하고 현미경의 왼쪽에 있는 흰색 버튼(그림 5에서6)을 눌러 백색광을 켭니다.<ol>
<li>백색광 전원 버튼 아래의 노브를 돌려 밝기를 조정합니다(그림 5의7).</li>
	</ol></li>
	<li>PHySpec 소프트웨어에서 컬러 카메라 창에서 재생(비디오) 버튼을 누르면 라이브 스캔이 발생합니다.<ol>
<li>컬러 카메라 창에 검은색 이미지가 표시되면 색상 카메라 탭 아래의 계기판제어판에 있는 노출 시간(그림 3에서2) 및/또는 게인 값(그림 3의3)을 늘립니다. 조회한 이미지가 너무 밝으면 노출 시간 및/또는 이득 값을 줄입니다.</li>
		<li>현미경의 오른쪽에 있는 전방 손잡이(그림 5의2)가 R로 설정되어 신호의 20%를 카메라/쌍안경으로 보내고 신호의 80%를 검출기로 전송합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>목표와 스테이지 사이의 거리를 조정하여 샘플에 초점을 맞춥니다(그림4b). 이것은 현미경의 오른쪽에 그림 4d에 표시된 노브를 돌려 수행됩니다. 참고 : 더 큰 손잡이는 거친 조정에 사용되며, 작은 손잡이는 더 섬세하고 작은 초점 변경을위한 것입니다.</li>
	<li>수동으로 선택한 목표도 소프트웨어에서 선택되어 있는지 확인합니다. 먼저 상단 메뉴 모음의 보기 단추를 클릭한 다음 한 개의 [보기] 막대를 클릭하여 배율 표시줄을 클릭하여 이미지에 축척 막대를 표시합니다(그림 3의1). 그런 다음 명령 제어판의 갈바노미터 탭으로 이동하여 사용된 목표를 선택합니다(그림 3의4). 소프트웨어에서 적절한 목표를 선택하여 표시된 축척 막대가 올바른지 확인합니다.</li>
	<li>소프트웨어에서 SpectraPro SP-2300 탭에서 탭 전환기 (ProEM – 6 그림 3)로이동하여 적절한 검출기를 선택하고 탭 필터 (ProEM의 경우 1200 gr / mm – 그림 3의경우 7)로 이동하여 격자를 선택하십시오..</li>
	<li>시료의 UV 여기가 일어날 수 있도록 광대역 램프 셔터(도 2에서12)를 엽니다. 광대역 램프(UV) 여기의 강도를 제어하기 위해 강도 손잡이(도 2d에서11)를 원하는 위치(예: 8 – 중간 강도)로 돌립니다.<ol>
<li>와이드 필드 조명(개방 조리개) 또는 더 작은 스팟 조명(더 닫힌 조리개) 중에서 선택하려면 그림 5에표시된 스틱과 노브를 사용하여 UV 램프 필드 조리개 크기를 제어합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SpectraPro SP-2300 탭에서 파장을 선택하여 샘플 방출을 관찰합니다.</li>
	<li>시료의 방출 파장을 알 수 없는 경우 방출 스펙트럼을 획득합니다.<ol>
<li>시퀀서에서 + 기호를 클릭하여 방출 스펙트럼을 수집하기 위한 새 시퀀스("노드")를 추가합니다.<ol>
<li>분광계를 클릭한 다음 스펙트럼 수집(스펙트럼 스캔)을클릭합니다. Spectrum Acquisition</li>
			<li>최소 파장(즉, 400nm)과 최대 파장(즉, 700nm)을 입력하고 확인을 클릭하여 스펙트럼이 기록될 스펙트럼 범위를 설정합니다.</li>
			<li>소프트웨어의 왼쪽 메뉴에서 적절한 노출 시간을 선택합니다. 매우 밝은 시료의 경우 더 짧은 시간(예: 0.1s)을 선택하고 희미한 방출기의 경우 더 긴 시간(예: 2s)을 선택합니다.</li>
			<li>광대역 램프(UV) 여기의 경우 여기 전력을 조정합니다(위의 1.3단계 참조). 참고: NIR 다이오드 여기의 경우 PHySpec 소프트웨어 의 왼쪽에 있는 중립 밀도 드롭다운 메뉴에서 조정할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>시퀀서에서 더블 재생 버튼을 클릭하여 전체 시퀀스를 실행합니다. 스펙트럼이 표시되면, 샘플 방출의 검출을 위한 관심 영역을기록하십시오(예: Tb3+및 Eu3+기반 샘플의 경우 580 ~ 640 nm).</li>
		<li>필요에 따라 시료의 초점을 변경하거나 PHySpec 소프트웨어의 노출 시간을 조정하여 신호 감지를 최적화합니다. 전술한 바와 같이 여기 소스(광대역 램프)의 전력을 변경하여 시료 방출 강도의 증가를 통해 신호 검출의 추가 최적화를 달성한다.</li>
	</ol></li>
	<li>이에 따라 컬러 카메라의 노출 시간(예: 0.5s ~ 2)과e.g., 게인(그림 3에서3)을 조정하여 양질의 이미지를 얻습니다. Figure 3 필요한 경우 PHySpec 소프트웨어 창 상단의 메뉴 두 번째 행에 있는 배율 표시/숨기기 막대버튼을 클릭하여 이미지에 축척 막대를 추가합니다.</li>
	<li>권장 사항: 하이퍼스펙트럼 큐브를 획득하기 전에, 백색광 아래결정의 밝은 필드 광학 현미경 이미지를기록(도 6a)및/또는 UV 전체(도6b)또는 제한된 조명(도6c)조명(셔터 조리개에 의해 제어되는 UV 조명, 그림 5에4로 나타낸). 이렇게 하려면 샘플에 포커스를 맞추고 컬러 카메라의 재생 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>파일을 클릭한 다음 창 보기 내보내기를클릭하고 원하는 형식을 선택하여 가져온 이미지를 내보내고 원하는 확장자(.h5, . JPEG).</li>
	<li>하이퍼스펙트럼 이미지를 획득하기 전에 방 조명뿐만 아니라 백색광 조명을 끕니다.</li>
	<li>하이퍼스펙트럼 큐브를 얻으려면 새 시퀀스를 작성합니다. 따라서 시퀀서에서 + 기호를 클릭하여 새 노드를 추가합니다.<ol>
<li>공초점 이미저를 클릭합니다.<ol>
<li>다중 스펙트럼 수집을클릭합니다. 여기서, 원하는 시야는 x 및 y 방향및 스텝 크기에서 획득할 점의 수에 의해 정의된다. 예를 들어 x에서 100포인트, y에서 100점을 5μm 단계 크기로 사용하여 500 x 500 μm의 이미지를 얻습니다. 참고: 각 지점의 총 수집 지점 수와 통합 시간은 하이퍼스펙트럼 큐브의 총 수집 시간에 직접적인 영향을 미칩니다.<ol>
<li>원하는 X 위치(예를 들어, 100) 및 Y 위치(예를 들어, 100)를 입력하고 원하는 스텝 크기(예를 들어, 5 μm)를 카운트한다. 눈에 보이는 방출 매핑(및 NIR 감지의 경우 소프트웨어 옵션)을 위해 카메라 동기화에 대한 하드웨어 옵션을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>시퀀서에서 새로 추가된 다중 스펙트럼 수집 선을 클릭하여 노드를 강조 표시합니다.</li>
	<li>재생 버튼을 클릭하여 선택한 노드를 실행합니다. 참고: 획득에 소요되는 남은 시간은 노드 옆에 표시됩니다(예: 분(예: 28분).</li>
	<li>수집이 완료되면 하이퍼스펙트럼 큐브를 적절한 파일 형식(.h5)에 저장합니다.</li>
</ol>3. 하이퍼 스펙트럼 데이터 분석
<ol><li>수집 직후 저장된 hyperspectral 큐브가 소프트웨어에서 자동으로 열리지 않으면 위쪽 메뉴 모음에서 파일을 클릭한 다음 커서를 가리키고 열기를 클릭하여 .h5 파일로 저장된 Open File…. hyperspectral 큐브를 Select data(s) to open 복구하고 열기 를 클릭합니다.</li>
	<li>하이퍼스펙트럼 큐브 파일을 가져오면 표시된 하이퍼스펙트럼 큐브 이미지를 수정하여 큐브 이미지 상단의 막대를 왼쪽(예: 하부 파장, 예: 580nm) 또는 오른쪽(더 높은 파장, 예: 638nm)으로 이동하여 특정 스펙트럼 파장의 강도를 표시합니다. 참고: 선택한 파장이 이 위쪽 막대의 왼쪽에 표시됩니다(그림 7의1).</li>
	<li>분석에 대한 관심의 파장을 선택한 후(예를 들어,최대 강도, 이는 [TbEu(bpm)(tfaa)]의 경우 613.26 nm), 하나의 (또는 전부) 스펙트럼 분석의 세 가지 유형의 확인: (A) 이미지의 형태로 스펙트럼 분포6 (도 7에서2); (b) 관심 영역 전반에 걸친 방출 강도 프로파일(그림 7에서3); (c) 특정 지점 또는 관심 영역에서 스펙트럼의 추출(도 7의4).<ol>
<li>이미지에서 스펙트럼 분포의 경우 자르기 및 Bin 기능을 사용하여 이미지의 신호 대 잡음 비율을 높입니다. 이렇게 하려면 상단 메뉴 처리를 클릭한 다음 데이터를 선택한 다음 자르기 및 Bin옵션을 선택합니다.</li>
		<li>방출 강도 프로파일의 경우 큐브 이미지에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 대상 만들기 또는 X 만들기 프로파일 또는 Y 프로파일 만들기(그림 7의대상 - 5 및 6) 또는 선(그림 7의프로파일 - 7 및 8)을 분석해야 하는 경우 Y 프로파일 을 클릭하고 선택합니다. 커서를 사용하는 대상, 수평 또는 수직 선 프로파일을 드래그하여 분석 영역을 선택하고 큐브를 가로질러 이동합니다.<ol>
<li>프로파일이 제대로 선택되면 지역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 그래프에 대상 추가를선택합니다. 대상(x축)의 물리적 위치의 함수로 방출 강도(y축)를 표시하는 새 그래프를 만드는 옵션을 선택했습니다.y 스펙트럼은 삽입된 새 그래프에 나타납니다(그림 7의6 및 7). 참고: 여러 대상을 만들 수 있으며, 이러한 대상은 서로 다른 색상 방출 프로파일로 표시됩니다(그림 7의5 및 6).</li>
		</ol>
</li>
		<li>대안적으로, 샘플의 특정 영역의 방출 스펙트럼을 얻는다(도 7에서9). 먼저 큐브 이미지 위로 커서를 마우스 오른쪽 단추로 마우스 오른쪽 단추로 이동합니다. 팝업 탭에서 사각형 선택 또는 타원 선택 옵션을 클릭합니다.<ol>
<li>큐브를 가로질러 커서를 클릭하고 드래그하여 원하는 영역 위에 선택 셰이프(예: 사각형)를 그립니다. 영역이 제대로 선택되면 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 그래프에 선택 추가를선택합니다.</li>
			<li>나타나는 창에서 그래프에 추가, 새 그래프 만들기를 선택하여 대상의 방출 스펙트럼을 표시하고 확인을클릭합니다. 참고: 새 색선(그림 7의8)은 대상 방출이 표시되는 그래프에 표시되며, 방출 강도는 y축과 x축의 파장으로 표시됩니다. 이 스펙트럼은 각 파장에 대해 선택한 영역의 평균 강도에 해당합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>스펙트럼이 얻어지면 한 번에 하나의 영역만 선택할 수 있으므로 새 영역을 선택하기 전에 저장합니다. 이렇게 하려면 그래프가 포함된 창을 선택합니다. 파일 메뉴에서 로 저장을 선택하고 원하는 이름을 사용하여 원하는 폴더에 그래프를 저장하도록 선택합니다.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없다. 저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

여기에 설명된 하이퍼스펙트럼 이미징 프로토콜은 샘플의 정확한 위치에서 분광 정보를 얻을 수 있는 간단한 접근법을 제공합니다. 설명된 설정을 사용하여 공간해상도(x 및 y 매핑)는 0.5 μm까지 도달할 수 있으며 스펙트럼 해상도는 가시 범위에서 매핑하는 데 0.2 nm, NIR 범위에 는 0.6 nm가 될 수 있습니다.
단결정에 hyperspectral 매핑을 수행하기 위해, 샘플 준비는 쉬운 절차를 따릅니다 : 결정은 단순히 필요에 따라 커버 유리로 덮여 유리 현미경 슬라이드에 배치 할 수 있습니다. 소프트웨어의 컬러 카메라 설정에서 적절한 대물 렌즈와 밝은 필드 이미지를 사용하여 샘플을 초점을 맞추는 것은 사전 분석 단계에서 가장 잘 해결된 하이퍼스펙트럼 이미지를 얻기 위한 매우 중요한 단계입니다. 일반적으로 시료가 잘 집중될 때 더 높은 방출 강도가 얻어진다. 이 작업이 완료되면 x 및 y 개수 및 단계 크기와...

하이퍼스펙트럼 이미징(HSI)은,2,각 x-y 좌표가 모든 종류의 분광법, 즉 광발광, 흡수 및 산란 분광분광을 기반으로 할 수 있는 스펙트럼 정보를 포함하는 공간맵을생성하는 기술이다.3 결과적으로 x-y 좌표가 공간 축이고 z 좌표가 분석된 샘플의 스펙트럼 정보인 3차원 데이터 집합("하이퍼스펙트럼 큐브"라고도 함)을 얻습니다. 따라서, 하이퍼 스펙트럼 큐브는 기존의 분광법보다 샘플의 더 상세한 분광 조사를 제공, 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함. HSI는 원격 감지(예: 지질학, 식품 산업., 4)의분야에서 수년간 알려져 왔지만, 최근에는 생체 의학 응용 분야3,36,,77,8을위한6나노물질2,,5 또는 프로브의 특성화를 위한 혁신적인 기술로 부상하고 있다. 일반적으로 말하자면, UV/가시/근적외선(NIR) 도메인에 한정되는 것이 아니라, 예를 들어 다른 물질의 원소 분포를 특성화하기 위해 X선과 같은 다른 방사선 소스를 사용하여 확장할 수있다 9 – 또는 테라헤르츠 방사선, 여기서 HSI는 생물학적 조직에서 열 감지를 수행하기 위해 사용되었다8. 또한, 광발광 매핑은 단층 MoS210의광학적 특성을 프로브하기 위해 라만 매핑과 결합되었다. 그러나, 광학,HSI의 보고된 응용 가운데, 여전히 란탄계 물질11,12,13,,14,,15,,16,,17의HSI에 대한 몇 가지 예가 있다., 예를 들어, 우리는 인용할 수 있다: 조직에서암의 검출6,생물학적 조직에서의 광 침투 깊이의 분석7,다중 생물학적 이미징3,하이브리드 시스템11의다성분 에너지 전달분석, 및 나노입자의 분광특성의 응집 유발 변화에 대한 조사12. 분명히 HSI의 매력은 환경별 발광에 대한 지식을 생성하여 프로브에 대한 동시 공간 및 스펙트럼 정보를 제공하는 적합성에서 비롯됩니다.
본 명세서에서 이러한 강력한 기술을 활용하면 이종핵 결핵3+-Eu3+ 단결정[TbEu(bpm)(tfaa)]6]6(도 1a)13의광학 이방성을 조사하는 프로토콜을 기술한다. 관찰된 광학 이방성 은 다른 결정학적 방향에서 Ln3+ 이온의 상이한 분자 패킹에서 유래(그림 1b),더 밝게 보여주는 일부 결정 면의 결과, 다른 사람은 조광 광발광을 보여주는. 결정의 특정 면에서 증가된 발광 강도는 Ln3+··· Ln3+ 이온 거리는 가장 짧은13이었다.
이러한 결과에 의해 동기를 부여, 우리는 HSI를 통해 광학 이방성을 분석하는 상세한 방법론의 설립을 제안, 특정 분자 배열에서 유래 이온 에너지 전달 프로세스 및 조정 발광 특성의 더 나은 이해를위한 경로를 열어18,,19. 이러한 구조-특성 관계는 나노 및 마이크로 스케일의 도파관 시스템 및 광자기 저장 장치를 포함하되 이에 국한되지 않는 혁신적인 광학 재료 설계를 위한 중요한 측면으로 인식되어 왔으며, 보다 효율적이고 소형화된 광학 시스템에 대한 수요를해결한다 20.

<table><tbody><tr><td>현미경 유리 슬라이드</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td>샘플 준비에 사용되는 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>가시 광선 및 근적외선 초분광 공초점 이미저</td><td>PhotonETC</td><td></td><td>분석에 사용되는 현미경, 사용자 요구에 따라 제작되었으므로 카탈로그 번호가 없습니다.</td></tr></tbody></table>

란탄제 기반 분자 단결정에서 광학 이방성 연구를 위한 도구로서의 하이퍼스펙트럼 이미징

Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals

이 작품에서, 우리는 발광 란탄화물 (Ln3 +)계분자 단결정의 분석에서 초스펙트럼 이미징 (HSI)의 새로운 응용을위한 프로토콜을 설명합니다. 대표적인 예로, 우리는 UV 흥분하에서 밝은 가시 방출을 나타내는 이종 핵 Ln 기반 복합체 [TbEu(bpm)(tfaa)6](bpm=2,2'-비피리미딘, tfaa- =1,1,1-trifluoracetytytonate)의 단일 결정을 선택했습니다. HSI는 발광 구조의 2차원 공간 이미징과 획득된 이미지의 각 픽셀의 스펙트럼 정보를 결합하는 새로운 기술입니다. 구체적으로, [Tb-Eu] 복합체의 단결정에 대한 HSI는 연구된 결정의 여러 지점에서 발광 강도의 변동을 밝히는 국소 스펙트럼 정보를 제공했다. 이러한 변화는 결정 구조의 각 방향에서 Ln3+ 이온의 상이한 분자 패킹에서 유래하는 결정에 존재하는 광학 이방성에 기인했다. 본 명세서에 기재된 HSI는 분자 물질의 분광 공간 조사를 위한 이러한 기술의 적합성의 예이다. 그러나 중요한 것은 이 프로토콜은 다른 유형의 발광 물질(예: 미크론 크기의 분자 결정, 무기 미세 입자, 생물학적 조직의 나노 입자 또는 라벨이 부착된 세포 등)에 대해 쉽게 확장될 수 있으며, 구조-물성 관계에 대한 심층적인 조사를 위한 많은 가능성을 열어줍니다. 궁극적으로 이러한 조사는 바이오 이미징에서 도파관 또는 광전자 장치와 같은 기술 응용 분야에 이르기까지 광범위한 응용 분야에 대한 첨단 재료 엔지니어링에 활용될 수 있는 지식을 제공할 것입니다.

Ln 기반, 분자 단결정(즉, [TbEu(bpm)(tfaa)]6], 도 1a에대한 데이터 수집을6위한 초스펙트럼 현미경의 구성을 설명하기 위해, 도 2는 설정에서 광학 큐브의 올바른 배치뿐만 아니라 시스템의 개요를 나타낸다. 그림 3은 HSI 획득 시 사용된 메뉴를 포함하는 PHySpec 소프트웨어의 스크린샷을 보여 줍니다. 도 4 및 도 5는 분석할 샘플을 포함하는 유리 슬라이드의 배치를 포함하여 현미경 단계를 보다 자세하게 보여준다. 선택된 UV 조명은 결정의 가시적 적색 발광을 나타내기 위해 켜졌다(도4a 및 도 5에서1). <stro...

여기서, 우리는 발광 하이퍼 스펙트럼 이미징 데이터를 얻고 하이퍼 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 란탄 기반 단결정의 광학 이방성 기능을 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based ...

하이퍼스펙트럼 이미징을 통해 샘플 내의 정확한 위치에서 분광 정보를 수집할 수 있습니다. 예를 들어, 단일 결정 수준에서 광학 이소성부비의 공개. 샘플의 스펙트럼 및 공간 데이터의 생성은 분광법 또는 형광 현미경 검사법만으로도 가능한 것보다 샘플에 대한 보다 상세한 조사를 가능하게 합니다.해상도에 영향을 주는 많은 조정 가능한 매개 변수는 처음에는 압도적으로 보일 수 있습니다. 그러나 체크리스트를 만드는 것은 시스템에 익숙해지는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 이미징 하드웨어의 수동 튜닝과 소프트웨어 조작이 필요합니다.두 가지 방법이 서로 어떻게 보완되는지 를 시각적으로 설명하는 것이 필수적입니다. 넬슨 루타호가와 함께 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 후 동료인 에밀리 로드리게스가 될 것입니다. 현미경 단계에서 시작하여 검출기를 향한 방출 빔 경로를 따라 하이퍼스펙트럼 이미징 매핑을 위한 심조 구성을 설정하려면 광학 현미경 공막 바로 옆에 광학 큐브의 위치를 두고 가시광선 경로를 통해 샘플에서 배출을 지시하는 위치에 공초점 현미경 광학 큐브를 배치합니다.검출기를 향한 광학 경로를 따라 보면 눈에 보이는 방출을 그 위치에서 검출 경로로 안내하기 위한 이색 거울과 필터를 포함하는 가시 광학 큐브를 배치합니다. 검출기를 향한 경로를 계속, 가시광선 검출 경로를 통해 빛을 지시하기 위해 올바른 위치에 공초점 핀홀 광학 큐브를 배치하고,방출 된 빛이 검출기에 도달하도록 적절한 위치에 공초점 분광계 광학 큐브를 배치합니다. 모든 큐브가 제자리에 있는 경우 선택한 핀홀크기에 맞게 검출기의 슬릿 개구부를 수동으로 조정합니다.그런 다음 PHySpec 소프트웨어에서 핀홀의 조리개를 선택합니다. 테르비움 유로피움 이중 플루오로아티라스티라톤산 단일 결정의 하이퍼스펙트럼 이미징 매핑의 경우, 시료 아래에 광학 현미경의 20배 목표를 수동으로 배치하고 현미경의 왼쪽에 있는 흰색 버튼을 눌러 백색광을 켭니다. 버튼 아래 손잡이를 돌려 밝기를 조정합니다.현미경의 오른쪽에 있는 전방 노브를 R로 설정하여 신호의 20%를 카메라에 보내고 신호의 80%를 검출기로 보냅니다. PHySpec 소프트웨어의 컬러 카메라 창에서 재생을 눌러 라이브 스캔을 시작합니다. 컬러 카메라 창에 너무 어둡거나 검은색 이미지가 표시되면 노출 시간 및/또는 색상 카메라 탭 아래의 게인 값을 늘립니다.이미지가 너무 밝은 경우 노출 시간 및/또는 게인 값을 줄입니다. 샘플에 집중하려면 현미경의 노브를 돌려 스테이지의 목표 사이의 거리를 조정하고 광대역 램프 셔터를 열어 샘플의 UV 여기를 허용합니다. 그런 다음 강도 노브를 원하는 위치로 돌려 광대역 램프 여기의 강도를 제어합니다.눈부조 표시/숨기기 스케일 바를 클릭하여 크리스탈의 밝은 필드 광학 현미경 이미지에 스케일 바를 추가하고 UV 전체 또는 제한된 조명 아래에서 결정의 이미지를 관찰합니다. 제한된 조명 또는 넓은 필드 조명 중에서 선택하려면 스틱과 노브를 사용하여 UV 램프 필드 조리개 크기를 조정합니다. SpectraPro SP 2300 탭에서 파장을 선택하여 샘플 방출을 관찰하고 검출기의 노출 시간을 조정합니다.시퀀서에서 하이퍼스펙트럼 큐브를 얻으려면 플러스를 클릭하여 새 노드를 추가하고 Confocal Imager를 클릭합니다. 다중 스펙트럼 수집을 클릭하고 원하는 X 및 Y 위치 카운트와 원하는 단계 크기를 입력합니다. 카메라 동기화 및 보이는 방출 매핑의 하드웨어 옵션을 선택하고 확인을 클릭합니다.시퀀서에서 새로 추가된 다중 스펙트럼 획득 선을 클릭하여 노드를 강조 표시하고 재생을 클릭하여 선택한 노드를 실행합니다. 캡처된 하이퍼스펙트럼 이미징 데이터를 분석하기 위해, 예를 들어, 이미지의 스펙트럼 분포를 위해, 처리 메뉴에서, 데이터 및 자르기 및 굽힘을 선택하여 이미지의 신호 대 노이즈 비율을 증가시다. 방출 강도 프로파일의 경우 큐브 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 한 줄의 분석을 위해 X 프로파일 만들기를 선택합니다.드래그하여 영역을 선택하고 관심 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 그래프에 추가를 선택하려면. 대상의 물리적 위치의 함수로서 배출 강도를 표시합니다.강도 프로파일이 새 그래프에 나타납니다. 샘플의 특정 영역의 방출 스펙트럼을 얻으려면 큐브 이미지 위에 커서를 마우스로 가져가면 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 사각형 선택을 클릭합니다. 드래그앤클릭을 클릭하여 원하는 영역에 선택 셰이프를 그립니다.그런 다음 관심 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 그래프에 선택 추가를 선택합니다. 그래프 추가 창에서 새 그래프 만들기를 선택하여 대상의 방출 스펙트럼을 표시하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 새 리전을 선택하기 전에 획득한 스펙트럼을 저장합니다.여기서, 적절한 초점에서 샘플을 조정한 후 기록된 결정의 밝은 필드 이미지가 나타난다. 결정의 바늘 같은 형태는 명확하게 관찰 될 수있다. 여기서, 완전한 조명 또는 국소밀한 조명을 가진 UV 여기아래 동일한 결정의 이미지를 관찰할 수 있다.제한된 조명은 웨이브 가이드와 같은 동작을 유발할 수 있는 크리스탈 내의 에너지 또는 광 전달의 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이 이미지에서, 강한 방출은 직접 여기 아래가 아닌 지점에서 검출되며, 이는 효율적인 에너지 이동이 결정을 통해 일어난다는 것을 시사합니다. 획득된 하이퍼스펙트럼 큐브로부터, 특정 파장을 나타내는 이미지의 형태로 스펙트럼 분포를 얻을 수도 있다.획득된 하이퍼스펙트럼 큐브의 임의의 픽셀 또는 영역에서 특정 방출 파장의 강도 프로파일과 방출 스펙트럼. 예를 들어, 이 분석에 대한 배출 스펙트럼은 europium 이온의 가장 특징적인 방출 대역을 보여줍니다. 더욱이, 상이한 결정면을 따라 공간 프로파일은 팁과 측면 면에서 더 밝은 방출을 나타내며, 세 가지 공간 방향에서 란탄/란탄이온 거리와 상관관계가 있을 수 있다.하이퍼스펙트럼 큐브의 합리적인 기록 시간에 좋은 신호를 얻으려면 현미경 구성, 초점 및 검출기 노출 시간을 조정하는 것이 중요합니다. 배출 UV 여기 및 가시 방출, 이 기술은 근적외선 여기 및 근적외선 방출 검출을 사용하여 수행 될 수있다. 이를 통해 대규모 발광 재료에 적용할 수 있습니다.종속 적인 기능의 배열과 광학 신호의 상관 관계 나노 바이오 상호 작용의 체외 평가를 포함 하 여 구조/속성 관계의 조사에 대 한 매우 흥미로운이 기술.

hyperspectral-imaging-as-tool-to-study-optical-anisotropy-lanthanide

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

원고는 레이저 제한 해상도와 광발광(PL) 분광법을 모두 통합하는 포논 보조 준공진 형광 분광법의 방법을 설명합니다. 이 방법은 광학 포논을 사용하여 에너지 영역에서 원자와 같은 반도체 구조의 선폭 제한 해상도 스펙트럼을 제공합니다. 이 방법은 또한 단일 분광계 광학 분광학 설정으로 쉽게 실현할 수 있습니다.

높은 해상도 포논 도움을 준 공명 형광 분광학

X 선 스펙트럼은 고온 플라즈마에 풍부한 정보를 제공합니다. 이 원고는 공간적으로 토카막 플라즈마 중간 원자 번호 원소의 수소와 헬륨 등의 이온을 확인하는 데 사용되는 X 선 분광계 이미징 높은 파장 해상도의 동작을 제공합니다.

하이 온도 플라즈마 진단으로 사용하기 위해 X 선 영상 크리스탈 분광학 적용

여기, 우리는 photoexcited 분자는 열에서 주위 지역 구조의 변형의 관측 시간 해결 적외선 진동 분광학 및 전자 회절의 차동 감지 분석 프로토콜 제시 액체 크리스탈, 구조와이 광 물질의 역학 관계에 원자 관점 주는.

Photoresponsive 액정의 구조 역학을 관찰을 위한 새로운 기술

빠른 2 차원 x 선 형광 및 x 선 microdiffraction 매핑 라우에 (색채 방사선) 또는 분말 (단색 방사선) 회절을 사용 하 여 단일 결정 또는 분말 샘플의 수행을 의미 beamline 설치를 설명 합니다. 결과 지도, 방향, 위상 분포, 긴장과 플라스틱 개 악에 대 한 정보를 제공합니다.

싱크 로트 론 엑스레이 Microdiffraction 및 광물 및 암석 샘플의 형광 이미징

포토닉 밴드 구조는 제한된 전자기 모드가 포토닉 크리스탈 내에서 전파되는 방식을 이해할 수 있게 해줍니다. 자기 원소를 통합하는 포토닉 크리스탈에서는 밀폐 및 공진 광학 모드와 같은 강화되고 수정된 자기 광학 활동이 수반됩니다. 우리는 푸리에 공간 현미경검사법에 의해 자기 광학 대역 구조를 추출하는 측정 절차를 기술합니다.

광나노구조체의 스펙트럼 및 각도 해결 된 자기 광학 특성 분석

여기서, 우리는 다이아몬드 광원에서 빔 라인 I23에 진공 엔드 스테이션으로 결정의 극저온 샘플 준비 및 전송을위한 프로토콜을 제시, 긴 파장 대식차 X 선 결정학 실험.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

이 기고는 결정-온-크리스탈 장치에서 단백질 결정화를 설정하는 방법과 온칩 결정화 플랫폼을 사용하여 실온에서 자동화된 직렬 데이터 수집을 수행하는 방법을 설명합니다.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

명시야, 2차 고조파 생성(SHG) 이미징 방식과 함께 광대역 진동 합-주파수 생성(VSFG) 이미지를 얻기 위해 다중 모드의 빠른 초분광 이미징 프레임워크가 개발되었습니다. 적외선 주파수가 분자 진동과 공명하기 때문에 대칭 허용 샘플에 대한 미세한 구조 및 중경 형태 지식이 드러납니다.

라인 스캐닝 진동 합계-주파수 생성 현미경을 사용한 다중 모드 비선형 초분광 화학 이미징

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

우리는 반데르발스 결정이 압전 세라믹에 전달된 경우 ΔR/R 고정 검출을 통해 ΔR/R 측정을 가능하게 하는 재현 가능한 변형 변조 압전 반사분광 분광법 프로토콜을 제시하며, Aspnes 공식에 대한 3차 미분 적합을 이용해 ΔR/R 스펙트럼을 통한 직접 광학 전이를 특성화하는 결과를 얻었습니다.

반데르발스 층상 결정의 광학 전이의 압전 반사 분광법

배우세요 하이퍼스펙트럼 이미징을 활용하여 란탄제 기반 분자 단결정의 광학 이방성을 분석하는 방법을. 이 기술은 스펙트럼과 공간 데이터를 결합하여 재료의 구조-특성 관계를 상세히 연구할 수 있게 합니다.

란탄제 기반 분자 단결정에서 광학 이방성 연구를 위한 도구로서의 하이퍼스펙트럼 이미징

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