Name: 세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 학습하세요 세포가 없는 S30 세균 추출물과 리포좀 캡슐화를 이용한 합성 세포 제조 방법을. 이 기술은 현장 치료 단백질 생산과 약물 전달을 위한 생명공학 플랫폼을 제공합니다.

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이 작품은 ERC-STG-2015-680242에 의해 지원되었다.
저자는 또한 테크니온 통합 암 센터 (TICC)의 지원을 인정; 러셀 베리 나노 기술 연구소; 로리 I. 로키 생명 과학 및 공학 학제 센터; 카민 그랜트에 대한 이스라엘 경제부 (52752); 이스라엘 과학기술우주부 – 수석과학자실 (3-11878); 이스라엘 과학 재단 (1778/13, 1421/17); 이스라엘 암 협회 (2015-0116); GIF 젊은 교부금을위한 과학 연구 개발을위한 독일 - 이스라엘 재단 (I-2328-1139.10/2012); 경력 통합 교부금에 대한 유럽 연합 FP-7 IRG 프로그램 (908049); 인지질 연구 센터 그랜트; 암 연구를위한 로젠 블라트 재단, 말라트 가족 재단 보조금; 그리고 Unger 가족 재단. A. 슈뢰더는 알론과 타우브 펠로우십을 인정한다. O. 아디르는 셔먼과 구트위르트의 펠로우십을 인정한다. G. 첸은 셔먼 펠로우십을 인정한다. N. 크린스키는 로스차일드 제왕절개 재단의 바론스 아리안 드 로스차일드 여성 박사 과정에 대해 인정합니다.

참고: 완전한 합성 세포의 생산 프로토콜의 그림은 그림 1에제시되어 있습니다. 사용자의 필요에 따라, 프로토콜의 단백질 발현(섹션 3.2) 및 합성 세포 형성(섹션 4) 부분도 독립적으로 수행될 수 있다(일부 적응).
1. S30-T7 용해의 준비
<ol><li>줄무늬 플레이트는 50 μg/mL ampicillin으로 보충된 LB-한천 플레이트상에서 pAR1219 플라스미드를 발현하는 T7 RNA 폴리머라제로 변형된 대장균 BL21(DE3) 박테리아를 단일 콜로니를 얻었다.</li>
	<li>스타터 용액 준비: 단일 콜로니를 100 mL Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin으로 보충한 LB-미디어 5 mL에 접종하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 하룻밤 동안 성장합니다. 중복을 준비합니다.</li>
	<li>각 5 mL 스타터를 500 mL의 TB 매체에 500 mL로 별도로 접종하여 배플이 있는 2 L Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin을 보충하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 성장하여 OD600 0.8-1에 도달할 때까지 키우십시오. 분광광도계를 사용하여 주기적으로 모니터링합니다.</li>
	<li>T7 RNA 폴리머라제 발현의 유도를 위해 IPTG의 100 mM 스톡(0.4-0.6 mM에 도달)의 2-3 mL을 추가하고 OD600□4에 도달할 때까지 배양을 계속 성장시다.</li>
	<li>각 Erlenmeyer 플라스크에서 2개의 250mL 멸균 원심분리기 튜브로 용액을 옮니다.</li>
	<li>원심분리기는 각각 7,000 x g에서 4°C에서 10분 동안. 상급제는 버리십시오. 참고 : 이 단계에서, 세균 펠릿은 다음 단계로 이동하기 전에 며칠 동안 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>250 mL의 콜드(4°C) S30 용해 완충액 및 원심분리기에서 각 펠릿을 4°C에서 10분 동안 7,000 x g에서 다시 중단합니다. 참고: S30 용해 완충제는 1.9단계에서 균질화기를 사용하여 세포 용해가 수행된 후 단백질 안정성을 유지하기 위해 사용된다. 이 단계부터 1.12까지의 모든 단계를 연속적이고 신속하게 수행해야 합니다. 참고 : 다음 단계로 진행하기 전에, 용해를 저장하는 데 필요한 팁과 1.5 밀리리터 바이알을 미리 냉각</li>
	<li>상급을 버리고 차가운 S30 용해 완충액 의 15 mL에서 모든 펠릿을 함께 다시 일시 중단하십시오. 거즈 패드를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 참고 : 용액 15ml는 균질화 최소 부피 때문입니다. 박테리아 농도 또한 중요 한 것으로 나타났습니다.</li>
	<li>세포 파손에 대한 4 bar (2 패스)의 공기 압력으로 15,000 psi의 작동 압력에서 균질화하십시오. 더 집중되고 활성 용해를 위해 용액 희석을 피하십시오.</li>
	<li>균질화된 현탁액의 10 mL당 0.1 M DTT(주의)의 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>4°C에서 30분 동안 24,700 x g에서 현탁액을 원심분리기.</li>
	<li>용해 활성을 보존하기 위해 다음 단계를 신속하게 수행하십시오 : 상급 을 1.5 mL 바이알에 200 μL aliquots로 나누고 즉시 액체 질소로 동결하십시오. 추가 사용을 위해 -80 °C에서 보관하십시오. 주의: DTT는 자극성 및 유해한 것으로 분류되므로 주의해서 취급해야 합니다.</li>
</ol>2. 오일 용액의 지질 준비
<ol><li>POPC와 콜레스테롤을 클로로포름(주의)에 별도로 녹여 서 각각 100 mg/mL의 최종 농도로 하십시오. 소용돌이 각 유리병 별도로.<ol>
<li>2mL 유리 병에 성분을 결합 : 클로로 포름에 POPC의 50 μL, 클로로 포름에 콜레스테롤 의 50 μL과 미네랄 오일 500 μL을 추가합니다. 합성 세포의 100 μL의 경우, 오일에 지질 2 병이 필요합니다.</li>
		<li>소용돌이, 그리고 약 1시간 동안 가열한 후 80°C에서 화학적 후드로 클로로포름을 증발시다. 지정된 시간/조건을 따르고 솔루션 볼륨을 모니터링하여 완전한 증발이 발생했는지 확인합니다. 참고: 생성된 지질-인-오일 용액은 최대 2주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다. 향상 된 결과 위해, 각 실험 전에 신선한 준비를 사용 하는 것이 좋습니다. 지질 과 콜레스테롤 비율은 원하는 막 조성물에 따라 변경될 수 있습니다. 콜레스테롤의 높은 농도는 최종 합성 세포 용액에 응집체의 형성으로 이어질 수 있습니다. 주의: 클로로포름은 자극성 및 유해한 물질로 분류되므로 주의깊게, 연기 추출이 가능한 부위에 취급되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 외부, 프리 인내 및 공급 용액의 준비
<ol><li>재고 솔루션 준비<ol>
<li>초순수(UPW)를 사용하여 표 2에 나열된 재고 솔루션을 준비합니다. 참고: 재고 용액은 사전에 준비하고 추가 사용이 될 때까지 -20 °C에 보관해야합니다. 시약 7은 응집체를 형성하는 경향이 있다. 37°C로 가열하면 응집을 감소시킬 것이다. 약간의 응집은 반응에 크게 영향을 미치지 않습니다. 시약 8 용액은 유백색과 탁한 입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>외부 솔루션<ol>
<li>DNase/RNase 프리H2O에서 포도당을 200 mM의 최종 농도로 용해시다.</li>
		<li>내부 용액의 100 μL의 경우 외부 용액 1.6 mL을 준비하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프리 이너 솔루션<ol>
<li>표 2에열거된 양 및 농도에 따라 시약 1-14를 첨가한다. 예를 들어, 100 μL의 최종 합성 세포 부피의 경우, 내부 용액의 100 μL을 준비한다. 참고: 최종 필요한 볼륨을 완료하려면 UPW를 추가해야 합니다. 이 단계에서, 혼합물은 몇 시간 동안 4°C에서 저장될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공급 솔루션<ol>
<li>표 3에 열거된 양 및 농도에 따라 모든 시약을 첨가한다. 참고 : 공급 용액 : 내부 용액의 1 : 1 비율을 사용합니다. 100 μL의 최종 합성 세포 부피를 위해 100 μL의 공급 용액을 준비하십시오. 외부, 내부 및 공급 용액의 작은 과잉 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 합성 세포의 준비
참고: 합성 세포의 100 μL의 제조를 위해 다음 부피가 조정됩니다.
<ol><li>단백질을 생산하는 합성 세포<ol>
<li>15 mL 튜브에 외부 용액의 12 mL를 놓고 오일 용액에 500 μL의 지질을 천천히 추가하십시오. 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
		<li>내부 용액 준비를 마무리하기 위해: 분쇄된 얼음 상에 내부 용액 성분을 해동하고 S30-T7 Lysate(시약 15) 및 DNA 플라스미드(시약 16)를 첨가하여 최종 부피 100 μL로 혼합하여 저장된 혼합물에 첨가한다.</li>
		<li>오일 용액에 500 μL의 지질을 가진 두 번째 2 mL 유리 병에 내부 용액의 100 μL을 추가하십시오. 파이펫을 1분 동안 힘차게 위아래로, 레벨 5에서 1분 동안 소용돌이를 피펫으로 바하십시오.<ol>
<li>분쇄된 얼음에 10분 동안 배양하고 15 mL 튜브(4.1.1부터)에서 오일 상 위에 결과된 에멀젼을 천천히 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>원심분리기는 100 x g 및 4°C에서 10분 간, 400 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하였다. 원심 분리가 끝나면 튜브 바닥에있는 펠릿이 관찰되어야합니다. 참고: 스윙 버킷 원심분리기 로터를 사용하면 물-인-오일 방울이 중간상을 통과하는 동안 지질의 두 번째 층을 더 잘 커버하는 것이 바람직하다. 관찰 가능한 펠릿이 없는 경우 원심 분리 속도를 1000 x g로늘릴 수 있습니다. 그렇지 않으면 외부 용액의 비중을 참조하는 토론 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>펠릿을 추출합니다.<ol>
<li>여분의 오일 층을 제거합니다.</li>
			<li>약 400 μL의 외부 용액이 적재된 트리밍 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 추출합니다. 수성 상에서 펠릿만을 수집하기 위해 오일 상을 통과하면서 외부 용액을 방출한다.<ol>
<li>펠릿을 추출한 후 팁을 닦아 오일 잔류물 이송을 피하고 펠릿을 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮김하십시오.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>1,000 x g 및 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 제거하고 상류를 제거하고 100 μL의 공급 용액 (내부 : 공급 용액의 1 : 1 비율)에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 참고: 고정각도 원심분리기 로터도 여기에서 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>단백질 발현을 위해, 흔들리지 않고 37°C에서 2시간 동안 배양한다. 참고: 최적의 배양 시간은 단백질마다 다릅니다.</li>
		<li>표적 단백질 특성에 따라 적합한 방법을 사용하여 생성된 단백질 양을 평가한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>권장 제어 그룹<ol>
<li>내부 용액 및 용해 활동 확인<ol>
<li>완벽한 내부 용액을 준비하십시오 (DNA 및 S30-T7 용해).</li>
			<li>즉시 250 rpm에서 바닥 인큐베이터 셰이커 또는 1200 rpm에서 열믹서를 사용하여 위의 반응을 2 시간 동안 37 °C의 일정한 온도에서 배양합니다. 참고 : 합성 세포 배양 시간과 일치하도록 인큐베이션 시간을 조정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>합성 세포<ol>
<li>음성 대조군: DNA없이 내부 용액으로 4.1에 제시된 프로토콜을 준비한다.</li>
			<li>양성 대조군: 리포터 유전자에 대한 T7 플라스미드 인코딩을 포함하는 내부 용액으로 4.1에 제시된 프로토콜을 준비한다. 참고: 캡슐화 효율 단계를 보장하기 위해 sfGFP와 같은 리포터 유전자로 구성된 양성 대조군을 테스트 그룹과 함께 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

이 프로토콜은 다량의 단백질 생산 합성 세포를 생산하기 위한 간단하고 저렴한 방법을 소개합니다. 활성 세포의 수율은 몇 가지 중요한 단계에 중점을 둔 프로토콜의 신중하고 정확한 실행에 달려 있습니다. 이 방법의 분해 제제 섹션에서, 세균 분해에 충분한 양의 단백질을 달성하기 위해 세포 가포하기 전에 적절한 박테리아 밀도에 도달하는 것이 필수적이다. 둘째, 용해 과정은 단백질 활성을 유지하기 위해 액체 질소로 신속하게 4°C 및 용해액을 동결하여 수행해야 한다. 더욱이, 이 프로토콜에서는 T7 RNA 폴리머라제발현을 pAR1219 플라스미드로 형질전환한 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하였다. 박테리아의 다른 긴장이 이용되는 경우에, 용해 농도에 변경은 RNA 중합효소 및 리보솜의 만족스러운 양에 도달하기 위하여 요구될 수 있습니다. 동일한 박테리아 균주를 사용하는 경우에도 다른 용해수기 생산은 일부 배치 대 배치 가변성을 가질 수 있습니다.
소포 생산 섹션에는...

합성 세포는 인공 세포와 같은 입자로서, 유전자 코드1,,2,,3에기초하여 단백질을 분열, 포름, 합성하는 능력과 같은 살아있는 세포의 하나 또는 다중 기능을 모방한다. 무세포 단백질 합성 (CFPS) 시스템을 둘러싸는 합성 세포는 DNA 템플릿의 변경 에 따라 다양한 단백질과 RNA 서열을 생산하는 능력으로 인해 높은 모듈성을 가지고 있습니다. 단백질 생산의 현재 접근법에 대한 매력적인 대안을 제시하는 CFPS 시스템은 세포 용해물, 정제 성분 또는 합성 성분을 기반으로 하며 리보솜, RNA 폴리머라제, 아미노산 및 에너지 원(예를 들어, 3-인산성산염 및 아데닌5,6,7,8,트리포스페이트)과 같은 단백질 합성에 필요한 모든 전사 및 번역 기계를4,포함합니다.9 지질 소포 내부의 CFPS 시스템의 캡슐화는 살아있는 세포(10)에의존하지 않고 단백질의 간단하고 효율적인 생산을 가능하게한다. 더욱이, 이 플랫폼은 천연 세포 내부의 분해될 수 있는 펩타이드의 합성을 허용하고, 살아있는 세포에 독성이 있는 단백질의 생산을 허용하며, 비천연 아미노산11,,12로단백질을 수정한다. 합성 세포는 진화적 관점에서 세포 생명을 가능하게 하는 데 필요한 최소한의 세포 성분을 조사하는 연구 목적으로 모델로 사용되어 왔다1,,13. 합성 세포는 또한 유전 회로를 구축하고 구현하는 데 사용되었으며 지시 된 진화14,,15,,16을위한모델로 사용되었습니다. 다른 연구는 당뇨병 환자에서 베타 세포와 같은 손상된 천연 세포를 대체하는 것을 목표로 천연 세포의 생물학적 활성을 모방하는 합성 세포의 능력에 초점을 맞추고있다 17. 더욱이, 다양한 치료 단백질을 생산하는 합성 세포를 캡슐화하는 이러한 CFPS의 능력은 임상 용법18에통합될 수 있는 잠재력을 보여준다.
여기서 우리는 지질 소포에 캡슐화된 CFPS 시스템에 기초한 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 생산을 위한 상향식 실험실 스케일프로토콜(그림 1)을기술한다. 이는 생체내 치료 단백질 약물의 현장 생산을 위한 신규한 약물 전달 시스템으로서 합성 세포 플랫폼의 잠재적 사용을 보여준다19. 이전 연구는 CFPS 반응및 세포 리세이트 제제 과정의 최적화를조사한 4,,8,,20. 더욱이, 미유체 및 중합체 계,물방울 안정화 방법21,22,,23,리포좀 의 지질 조성물24,25,26과 같은 세포 크기의 리포좀 제제에 여러 기술이 적용되었다.,, 제시된 프로토콜에서, 합성 세포는 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하여 제조되고 캡슐화 과정은 저온(&4°C)5,,10,,24,,27,,28에서수행된다. 이러한 온화한 조건은 분자 기계, 즉 리보솜 및 단백질27,,29,,30의생체 기능 적 무결성을 유지하는 데 유리한 것으로 밝혀졌다. 입자의 지질 조성물은 콜레스테롤과 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC)으로 구성된다. 첫 번째는 모든 포유류 세포막에서 발견되며 멤브레인의 안정성, 강성 및 투과성 감소에 필수적이며, 후자는 포유류 인지질 조성물11,,13을모방한다. 세포 전사 및 번역 분자 기계는 BL21 (DE3) 대장균 (대장균) 균주에서 추출되며, 이는 pAR1219 플라스미드로 변형되어 T7 RNA 폴리머라제와 함께 변형되어 CFPS 효능 및 단백질 합성을 증가시킵니다. 이 시스템은 생체외 및 생체내19,,31의분자량으로 진단 및 치료 단백질을 생산하는 데 사용되었습니다. 다음 프로토콜은 합성 세포 시스템의 생산을 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 본질적으로 단백질 합성과 관련된 광범위한 근본적인 문제를 해결할 수 있으며 약물 전달 응용 분야에도 활용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>A. 1단계(S30-T7 용해물 준비)에 필요한 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli BL21(DE3)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>대장균 BL21 (DE3).</td></tr><tr><td>pAR1219</td><td>Sigma</td><td>T2076</td><td>변형을 위한 TargeTron 벡터.</td></tr><tr><td>50 mg/mL 암피실린</td><td>시그마</td><td>A9518</td>의 원액은 <td>-20°C에 보관됩니다.</td></tr><tr><td>10 g/L 박토 트립톤</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Luria Bertani (LB) 한천 (1.5 %) 플레이트의 준비.</td></tr><tr><td>10 g/L 염화나트륨 (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L Bacto-Yeast 추출물</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>15 g/L 한천 정제</td><td>Merck</td><td>1.01614.5007</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; g/mL 암피실린</td><td>시그마</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>10 g/L 박토-트립톤</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Luria Bertani(LB) 배지(20mL) 준비용.</td></tr><tr><td>10 g/L 염화나트륨 (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L Bacto-Yeast 추출물</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>50 &마이크로; g/mL 암피실린</td><td>시그마</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>12 g/L 박토-트립톤</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>TB(Terrific Broth) 매체(1L) 준비용.</td></tr><tr><td>24 g/L 박토 효모 추출물</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>4% (v/v) 글리세롤 무수</td><td>Bio-Lab</td><td>7120501</td><td></td></tr><tr><td>2.32 g/L K2HPO4</td><td>스펙트럼 화학물질</td><td>P1383</td><td></td></tr><tr><td>12.54 g/L KH2PO4</td><td>스펙트럼 화학물질</td><td>P1380</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 50 &마이크로; g/mL 암피실린</td><td>시그마</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>100mM 이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 원액&nbsp;</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td>은 <td>0.2 &micro를 사용하여 필터링되었습니다. m 친수성 PVDF 주사기 필터.</td></tr><tr><td>0.1M 디티오트레이톨(DTT)의 원액&nbsp;</td><td>TCI</td><td>D1071</td>은 <td>0.2 &마이크로를 사용하여 필터링되었습니다. m 친수성 PVDF 주사기 필터.</td></tr><tr><td>pH = 7.4에서 10mM 트리스-아세테이트</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>S30 용해물 완충액(1.5L)</td></tr><tr><td>14mM 마그네슘 아세테이트</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td></td></tr><tr><td>60mM 아세트산</td><td>칼륨 Carlo Erba</td><td>470147</td><td></td></tr><tr><td>1mM DTT</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td></td></tr><tr><td>0.5mL/L 2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1단계에 필요한 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 멸균 삼각 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-154-2846</td><td>2 플라스크</td></tr><tr><td>2 L 멸균 삼각 플라스크 (배플 포함</td>) <td>KIMAX-KIMBLE</td><td>25630</td><td>2 플라스크</td></tr><tr><td>바닥 인큐베이터 쉐이커</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>실험실 쉐이커 인큐베이터 450x450mm, 400rpm, 70 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX 고정 각도 로터. 최소 13,000 x g.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; * 4 &deg;C.에 미리 냉각하는.</td></tr><tr><td>고압 균질화기</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>4°C로 사전 냉각</td></tr>.<tr><td>-80oC freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>멸균된 1.5 mL 플라스틱 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>-20 °C로 사전 냉각하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>: TECAN</td><td>IN-MNANO</td><td>Infinite M200 pro</td></tr><tr><td>96-well transparent plate</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Sterilized graduated cylinder</td>, <td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterilized centrifuge tubes</td>, <td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>-20°C로 예냉각하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>멸균된 피펫 팁</td><td>Corning</td><td></td><td>은 -20°C로 사전 냉각하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>분쇄 얼음 양동이</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>소형 액체 질소 탱크</td><td>NALGENE</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>B. 3 단계 (유액 제제의 지질)에 필요한 시약 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td> <td>Lipoid</td><td>556400</td><td>분말</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8667</td><td>분말</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>바이오 랩</td><td>3082301</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마</td><td>M5904</td><td>경유</td></tr> <tr><td>< 강> 2 단계에 필요한 장비 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>와류 믹서</td><td>과학 산업</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>TECHNE</td><td>FDB03AD</td><td>80 &deg;C. 로 예열되어 온도를 제어할 수 있어야 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>2mL 스크류 넥 유리 바이알</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td>더 큰 스케일의 경우 50mL 팔콘을 사용하고 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 증발시킵니다.</td></tr><tr><td>9mm 스크류 캡</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>C395R-09LC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>C. 3 단계 (내부 및 공급 반응 혼합물)에 필요한 시약 : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Spectrum</td><td>H1089</td><td>1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH 버퍼</td></tr><tr><td>수산화 칼륨 (KOH)</td> <td>Frutarom</td><td>55290</td><td></td></tr><tr><td>1 M 마그네슘 아세테이트</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td>코팩터 및 음전하 안정제.</td></tr><tr><td>1 M 칼륨 아세테이트</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td>음전하 안정제.</td></tr><tr><td>5.2 M 암모늄 아세테이트</td><td>Merck</td><td>1.01116.1000</td><td>음전하를 안정화합니다.</td></tr><tr><td>50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG)</td><td>Merck</td><td>8.07491.1000</td><td>거대분자의 농도를 증가시킵니다.</td></tr><tr><td>0.5 M 3-포스포글리세레이트 (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td>2차 에너지원.</td></tr><tr><td>50 mM 아미노산 혼합물 I</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>아미노산 첨가제. 함유: 다음의 17&nbsp; 천연 아미노산 각각 50 mM - 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 그리고 발린.</td></tr><tr><td>50 mM 아미노산 혼합물 II</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>아미노산 첨가제. 함유 성분: 트립토판, 페닐알라닌, 티로신의 3가지 천연 아미노산 각각이 50 mM.</td></tr><tr><td>100mM 아데닌 삼인산(ATP)</td><td>Sigma</td><td>A3377</td><td>뉴클레오티드 및 에너지원.</td></tr><tr><td>50mM 구아니딘 삼인산(GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>뉴클레오티드 및 에너지원.</td></tr><tr><td>100 mM 우리딘 트리포스페이트(UTP)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>226310010</td><td>뉴클레오티드 첨가제.</td></tr><tr><td>100 mM 이소프로필 &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>유전자 발현 유도.</td></tr><tr><td>2 M 설탕</td><td>J.T. Baker</td><td>1933078</td><td>밀도 구배 생성.</td></tr><tr><td>2 M 포도</td>당 <td>시그마</td><td>16301</td><td>밀도 구배를 생성합니다.</td></tr><tr><td>H2O 초순수(UPW)</td><td>Bio-Lab</td><td>2321777500</td><td>DNase & RNase free</td></tr><tr><td>S30-T7 용해물</td><td>_</td><td>_</td><td>1단계에서 준비합니다. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 전사 출처 & translation components. -80 &deg에 저장; C, 사용 직전에 부서진 얼음에서 해동합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>선택한 DNA 플라스미드 재고</td><td>_</td><td>_</td><td>요청된 단백질에 대한 염기서열을 포함합니다. Under T7 promotor</td></tr><tr><td>D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floor incubator shaker or Thermomixer</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 &deg; C</td></tr><tr><td>PHMT 그랜트 바이오&nbsp;</td><td>PSC18</td><td>써모믹서</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003629) - TX-400 4 x 400mL 스윙 버킷 로터. 15mL 크기의 튜브에 적합합니다. 스윙 버킷 선호. 최소 1000 x g. 4°C로 사전 냉각해야 합니다.</td></tr><tr><td>테이블 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td>(75003424) - 24 x 1.5/2.0mL 로터, ClickSeal. Eppendorf 바이알에 적합. 4°C로 사전 냉각.</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific industries</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>분쇄 얼음 양동이</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 스크류 넥 유리 바이알</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td></td></tr><tr><td>멸균 15 mL 플라스틱 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>멸균 1.5 mL 플라스틱 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 팁</td><td>Corning</td><td></td><td>오토클레이브로 멸균.</td></tr></tbody></table>

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

합성 세포의 건설을위한 상향식 조립 방법은 세포를 모방 한 환경에서 세포 과정을 격리하고 조사하기위한 효과적인 도구입니다. 더욱이, 세포 없는 발현 시스템의 발달은 합성 생물학을 활용하는 통제된 방식으로 단백질 생산, 전사 및 번역 과정(DNA→RNA→단백질)을 재구성하는 능력을 입증하였다. 여기에서 우리는 강력한 세균 용해물의 생산을 포함하여 세포 자유 발현 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고, 합성 세포를 형성하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 지질 기지를 둔 거대한 unilamellar 소포 (GUV) (즉, 안정한 리포솜) 안쪽에 이 용해물을 캡슐화합니다. 이 프로토콜은 활성 세균 용해물의 생산을 포함하는 합성 세포의 성분을 제조하는 방법을 설명하고, 이어서 수중 오일 에멀젼 전달 방법에 기초하여 합성 세포의 상세한 단계별 제조를 기술한다. 이들은 단백질의 다른 모형을 생산하기 위한 높은 다양성으로 간단하고 적당한 방법으로 합성 세포의 수백만의 생산을 촉진합니다. 얻어진 합성 세포는 고립된 환경에서 단백질/RNA 생산 및 활동을 조사하기 위하여, 지시된 진화에서, 또한 바디 안쪽에 치료 단백질의 온디맨드 생산을 위한 통제된 약 납품 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.

우리는 지질 소포 내부의 BL21 대장균에 기초한 S30-T7 CFPS 시스템을 캡슐화하여 합성 세포의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 도 2에각 단계의 이미지를 포함하는 준비 과정에 대한 개략적 설명이 제시된다. 합성 세포 전처리 과정의 성공은 각 단계의 적절한 성능에 의존하고 상이한 파라미터에 의해 영향을 미친다. 프로토콜은 특정 단백질의 생산을 수용하도록 조정되어야 한다.
모델 단백질 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 및 르닐라 루시퍼라아제를 T7 프로모터로 발현한 플라스미드는 CFPS 벌크 반응 및 합성 세포에 도입되었고, 단백질 생산은 서양 블롯, 유세포 분석, 현미경 및 분광법을 포함한 다양한 방법을 사용하여 평가되었다(그림3). sfGFP-그의6 태그 단백질(~27 kDa<sup class="xref"...

이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

합성 세포를 생산하는 단백질은 고급 약물 전달을 위한 합성 세포 기반 치료법뿐만 아니라 삶의 기원을 연구하기 위한 다목적 플랫폼을 제공합니다. 이 방법은 RNA 및 단백질 발현에 간단하고 저렴하며 신체 내부의 현장 치료 단백질 생산을 직접 적용할 수 있습니다. 이 시스템은 대사 질환과 단백질 대체에서 암 및 당뇨병에 이르기까지 광범위한 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.이 다단계 프로토콜에는 정의된 중지 지점이 있습니다. 처음으로 수행 할 때 며칠 동안 작업을 나누는 것이 좋습니다. 합성 세포 생산을 위한 프로토콜은 세포없는 S30-T7 용해물의 준비로 시작됩니다.다음으로, 멤브레인 지질 및 세포 영양소 용액은 내부 환경을 시뮬레이션하고 단백질 생산을 지원할 준비가 되어 있습니다. 마지막 단계는 합성 세포 자체의 준비입니다. 100 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에서 중복 스타터 문화를 준비합니다.각 플라스크에, 암피실린의 밀리리터 당 50 마이크로 그램으로 보충 LB 미디어의 5 밀리리터를 추가하고 하나의 대장균 콜로니와 접종. 250 rpm과 섭씨 37도에서 바닥 인큐베이터 셰이커에서 하룻밤 문화를 성장. 다음으로, 암피실린 밀리리터 당 50 마이크로그램으로 보충된 500밀리리터의 결핵 매체를 함유한 두 리터 당황한 Erlenmeyer 플라스크를 준비합니다.5 밀리리터 스타터 배양으로 두 리터 플라스크를 접종합니다. 플라스크를 셰이커에 250rpm과 섭씨 37도로 놓습니다. 분광계를 사용하여 주기적으로 배양을 모니터링하고 OD600이 0.8에서 1 사이까지 배양을 성장시다.T7 RNA 폴리머라제 발현을 유도하기 위해, 각각의 플라스크에 100 밀리머 IPTG의 3밀리리터를 추가하여 0.6 밀리몰라에 도달한다. OD600이 약 4가 될 때까지 문화를 계속 성장시다. 배양이 원하는 광학 밀도에 도달하면 각 Erlenmeyer 플라스크에서 현탁액을 250 밀리리터 살균 원심분리기 튜브 2개로 옮기십시오.4섭씨에서 10분 동안 7, 000배의 튜브원심분리. 상부체를 폐기합니다. 원하는 경우 교반기를 사용하여 차가운 S30 용해 버퍼의 250 밀리리터에서 각 펠릿을 다시 중단합니다.섭씨 4도에서 10분 동안 7, 000배 g의 원심분리기. 상체를 버리고 차가운 S30 리세이트 버퍼의 15 밀리리터에서 모든 펠릿을 함께 재연하십시오. 거즈 패드를 사용하여 서스펜션을 필터링합니다.다음 단계로 진행하기 전에 lysate를 저장하는 데 필요한 1.5 밀리리터 바이알에서 팁을 미리 식힙니다. 서스펜션을 두 번 균질화합니다. 세포 파손에 대한 4개의 막대의 기압으로 15, 000 PSI의 작동 압력을 사용합니다.동종 모를 것을 수집합니다. 균질화 서스펜션의 10 밀리리터 당 0.1 어금니 DTT의 100 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분에서 24, 700배의 현탁액을 원심분리합니다.DTT와 클로로폼은 자극제와 유해로 분류되므로 주의하여 처리해야 합니다. 프로토콜의 나중에 사용되는 클로로폼은 연기 추출이 있는 영역에서 사용해야 합니다. lysate 활동을 유지하려면 단계를 신속하게 수행합니다.미리 냉각된 바이알에 200마이크로리터 알리쿼트의 알라쿼트를 놓고 즉시 스냅하여 액체 질소로 동결합니다. 바이알을 음수 섭씨 80도에 저장하여 향후 사용하십시오. 별도로 MMC와 콜레스테롤을 클로로폼에 용해하여 밀리리터당 100밀리그램의 최종 농도를 기록합니다.각 병병을 따로 소용돌이시다. 2 밀리 리터 유리 바이알에 구성 요소를 결합합니다. 콜레스테롤 클로로폼 용액 50마이크로리터, POPC-클로로폼 용액 50마이크로리터, 500마이크로리터의 미네랄 오일을 추가합니다.유리병을 소용돌이, 다음 클로로폼을 증발, 화학 후드에 섭씨 80도에서 약 1 시간 동안 가열. 합성 세포 생산 단계를 시작하기 전에 원고에 설명된 바와 같이 외부, 사전 내부 및 공급 용액을 준비합니다. 그런 다음 15 밀리리터 튜브에 외부 용액1.2 밀리리터를 넣고 첫 번째 유리 바이알에서 500 마이크로리터의 지질 용액을 천천히 추가합니다.실내 온도에서 20 분 동안 튜브를 배양하십시오. 내부 용액 준비를 마무리하려면 S30-T7 용액과 DNA 플라스미드를 추가하여 얼음을 100 마이크로리터의 최종 부피에 섞는다. 2밀리터 유리 바이알에 500 마이크로리터의 지질-인-오일 용액을 사용하여 내부 용액 100마이크로리터를 lysate 및 plasmid에 추가합니다.파이펫은 1분 동안 힘차게 위아래로 내려가고 5레벨에서 1분간 소용돌이합니다. 분쇄된 얼음에 10분 동안 에멀젼을 배양한 후, 15밀리리터 튜브의 오일 위상 위에 에멀젼을 천천히 추가합니다. 100g과 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브원심분리합니다.그런 다음 원심 분리기는 400 g와 섭씨 4도에서 10 분 동안. 원심 분리가 끝날 때까지 펠릿은 튜브 의 바닥에서 관찰 할 수 있어야합니다. 펠릿을 추출하려면 먼저 과도한 오일 층을 제거하십시오.다음으로, 약 400마이크로리터의 외부 용액으로 트리밍된 파이펫 팁을 로드하고 파이펫 팁을 사용하여 펠릿을 수집하여 파이펫 팁이 오일 단계를 통과할 때 외부 용액을 방출합니다. 파이펫 팁을 닦고 펠릿을 깨끗한 1.5 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다. 1, 000배, 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿원심분리합니다.상체를 제거하고 100 마이크로리터의 수유 용액에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 단백질 발현의 경우 흔들림 없이 섭씨 37도에서 2시간 동안 현탁액을 배양합니다. 모델 단백질 sfGFP및 레닐라 루시파라제를 발현하는 플라스미드는 세포없는 단백질 합성, CFPS 대량 반응 및 합성 세포로 도입되었다.단백질 생산은 여러 가지 방법을 사용하여 평가되었다. 서양 얼룩 분석은 CFPS 대량 반응과 합성 세포 내부에서 sfGFP His6 생산을 검출했습니다. 정제 된 sfGFP His6은 긍정적 인 제어로 사용되었다.브라이트필드와 GFP 필터를 갖춘 형광 현미경은 sfGFP를 생성하는 합성 세포를 보여줍니다. 유동 세포측정은 합성 세포를 생성하는 sfGFP를 분석하는 데 사용되었습니다. 활성 합성 세포 집단의 계산은 적색 히스토그램으로 표현되는 음의 DNA 샘플에 의해 정의된 sfGFP 형광 강도 임계값을 기반으로 하였다.합성 세포를 생성하는 sfGFP의 평균 형광 강도는 활성 합성 세포 집단으로부터 계산되고 부정적인 DNA 샘플로 정규화되었다. 활성 합성 세포의 직경 분포는 sfGFP 신호를 기반으로 계산되었다. Renilla luciferase 활동은 발광 측정으로 정량화되었습니다.이 방법은 매우 다재다능하며 lysate 기원, 지질 조성 및 내부 용액 농도를 변경하여 다른 표적 단백질에 최적화 될 수 있습니다. 형광 마커 단백질을 생산하는 합성 세포의 FACS 분석은 활성 합성 세포의 분획의 정량적 가치를 제공하기 위해 수행 될 수있다. 서양 얼룩 분석은 단백질 생산을 측정할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Wiegand, DJ, et al. 빠르게 성장하는 박테리아 Vibrio natriegens를 이용한 무세포 단백질 발현. J. Vis. Exp. (2019).이 비디오는 Vibrio natriegens 조 용해물을 기반으로 하는 박테리아 무세포 단백질 발현 시스템을 사용하여 결합된 시험관 내 전사 및 번역을 수행하는 방법을 보여줍니다. 필수 성분이 포함된 마스터 믹스의 준비와 DNA 주형에서 기능성 단백질의 단계별 합성을 강조합니다.

박테리아 조세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 발현

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구현을위한 프로토콜 대장균을 바탕으로 TX-TL의 무 세포 발현 시스템

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이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.

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E. coli의 재조합 단백질 충전 소포의 최적화된 생산 및 분석

이 프로토콜은 합성 세포를 구성하는 데 사용되는 CFPS(Cell-Free Protein Synthesis) 시스템을 설명합니다. 다양한 마이크로 컴파트먼트에서 대표적인 결과를 제공하는 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 합성 세포 커뮤니티의 다양한 실험실에 대한 모범 사례를 수립하여 합성 세포 개발의 진전을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

합성 세포 구축을 위한 Cell-Free 단백질 합성 시스템

학습하세요 세포가 없는 S30 세균 추출물과 리포좀 캡슐화를 이용한 합성 세포 제조 방법을. 이 기술은 현장 치료 단백질 생산과 약물 전달을 위한 생명공학 플랫폼을 제공합니다.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

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