Name: 생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 생리적 조건에서 돼지 심장 조직을 절단하고 6일간 배양하는 방법을. 이 프로토콜은 심부전 치료제 효능 평가와 급성 심장 독성 테스트에 활용될 수 있습니다.

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TMAM은 NIH 교부금 P30GM127607 및 미국 심장 협회 보조금 16SDG29950012에 의해 지원됩니다. RB는 P01HL78825 및 UM1HL113530에 의해 지원됩니다.

모든 동물 절차는 루이빌 대학의 제도적 지침에 따라 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 슬라이스 준비 (슬라이스 하루 전)
<ol><li>진동 마이크로토메의 제조
	<ol>
<li>다음 단계에 따라 세라믹 블레이드를 홀더에 넣습니다: 블레이드를 조심스럽게 래핑한 후 날카로운 모서리를 먼저 블레이드 도구의 슬롯에 넣습니다. 그런 다음 홀더의 팔에 있는 두 개의 나사를 풀어 홀더에 블레이드를 끼이고 각 와셔 아래에 블레이드를 밀어 넣고 뒤쪽 정지에 단단히 밀어 넣습니다. 나사를 조여 블레이드를 고정합니다. 참고: 나사를 과도하게 조여서는 안됩니다.</li>
		<li>제조업체의 프로토콜에 따라 교정 프로토콜 및 도구를 사용하여 블레이드를 교정합니다. 참고: 간단히, 이동 축과 블레이드의 정렬을 용이하게하고 Z 축 편향을 최소화하기 위해, 진동 마이크로 북은 탈착식 교정 장치를 사용합니다. 교정 장치가 계측기에 연결되면 그 존재가 자동으로 감지되고 진동 마이크로톤은 블레이드의 진폭 및 주파수 설정을 블레이드 정렬 오류를 가장 잘 조정할 수 있는 크기로 조정하는 제어합니다.<ol>
<li>슬라이스 버튼을 눌러 블레이드를 자동으로 이동하여 절삭날이 최상의 정렬 평가를 위해 교정 장치에 비해 최적의 위치에 있도록 정렬 프로세스를 시작합니다. 제공된 드라이버를 사용하여 블레이드를 조정하여 Z 정렬이 1 μm 이내인지 확인하기 위해 화면상의 지침에 따라 블레이드를 조정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>내부 욕조와 진동 마이크로토메의 모든 금속 부분을 오토클레이브합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>대형 금속 트레이 (슬라이스를 수집하고 전기 자극 플레이트 커버를 담그기 위한), 유리 용기, 일반 직사각형 블레이드, 집게, 가위, 프린터 타이밍 벨트 (6mm 너비로 잘라내기), 금속 와셔 및 이중 증류수 5 L (ddH2O).</li>
	<li>심전도 용액으로 1 L 항아리, 500 mL 항아리 1 개 및 심장용 플라스틱 트레이 1 개를 소독하고 심전도 용액으로 체외 관류에 담습니다.</li>
	<li>2 L 비커에 슬라이스 티로드의 용액의 2 L을 준비합니다.
	<ol>
<li>슬라이스 티로드 용액 1L의 경우, 3 g/L 2,3-부탄디온 단색(BDM), 140 mM NaCl(8.18 g), 6mM KCl(0.447 g), 10 mM D를 혼합합니다. - 포도당 (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 의 1 M 솔루션), 1.8 mM CaCl2 (1.8 mL 의 1 M 용액), 최대 1 L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000 mL, 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 사용하여 용액을 걸레질하고 밤새 4°C에서 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>심전도 용액 4 L을 준비하십시오.
	<ol>
<li>심전도 용액 1L의 경우, 110 mM NaCl (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL 의 1.19 g), 16 mM KCl (1.19 g), 16 mM MgCl2 (3.25 g), 10 mM NaHCO3 (0.84 g), 1 U/mL heparinin, 최대 1L의 ddH2O. NaOH를 사용하여 pH를 7.40으로 조정합니다. 그런 다음 1,000 mL, 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 사용하여 용액을 걸레질하고 밤새 4°C에서 보관합니다. 참고: 슬라이스 당일 심전도 용액에 1,000 U/L 헤파린을 추가하십시오(2.1단계 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>생물 안전 성 캐비닛에 원래 병에 배양 배지의 500 mL을 신선하게 준비 : 혼합 매체 199, 1x 인슐린 트랜스 페린 셀레늄 (ITS) 보충, 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 5 ng / mL 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 ng / mL FGF-기본, 및 2x 항생제 항 항. 0.22 μm, 진공 필터/저장 시스템을 통해 필터를 살균하고 밤새 4°C에서 보관하십시오. 참고: pH를 조절하지 말고, 사용하기 전에 VEGF와 FGF를 신선하게 추가하십시오.</li>
	<li>4% 한천 젤 플레이트를 준비합니다.
	<ol>
<li>500 mL 멸균 플라스크에 멸균 된 ddH2O 200 mL를 추가하십시오. 아가로즈 8 g의 무게를 측정하고 플라스크에 부드럽게 붓습니다. 전자레인지에서 2분간 끓인 다음 실온에서 5분간 식힙니다.</li>
		<li>각 100mm 페트리 접시에 25 mL를 생물 안전 성 캐비닛에 붓고 (6 접시를 준비하십시오) 고형화 될 때까지 1 시간 동안 기다립니다. 그런 다음 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 깨끗한 랩으로 감싸고 4 °C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>오토클레이브 ddH2O에서200 증거 절대 에탄올을 희석하여 70% 에탄올 4L를 준비합니다.</li>
	<li>멸균 된 ddH2O에서 2 x 항생제 항 균제를 준비하십시오 : 생물 안전 성 캐비닛 에서 항생제 항 균제 20 mL와 멸균 된 ddH2O980 mL을 혼합하십시오.</li>
</ol>2. 돼지 심장 관류
<ol><li>심전소 용액 1L에 1mL의 1mL의 U/mL 헤파린을 추가하십시오. 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 조직 배양실로 이송되는 동안 심장의 관류 및 보존을 위해 적어도 3L이 필요하다.</li>
	<li>돼지 수술실에 다음 항목을 가져 가라: 얼음으로 가득 찬 큰 얼음 양동이 1 개, 멸균 된 금속 트레이 1 개 (심장 관류를위한 얼음 양동이에 보관), 살균 된 500 mL 항아리 1 개, 1 L 항아리 (심장 전도액에서 심장을 다시 조직 배양실로 옮기기 위해) , 얼음에), 얼음으로 가득 한 살균 플라스틱 트레이 (얼음에 심전도 용액을 유지하기 위해).</li>
	<li>3방향 스톱콕, 60mL 주사기, 18G 나비 바늘 카테터 및 심전도 용액 저장소에 연장 튜브를 포함하는 내부 심장 관류 시스템을 준비합니다.</li>
	<li>요크셔 수컷 돼지(생후 2-3개월, 20-25kg)를 케타민(20 mg/kg)/자일라진(2 mg/kg) 칵테일로 먼저 마취시금으로 마취시다. 턱 긴장의 손실에 의해 적절한 마취를 확인합니다. 이어서, 돼지를 수술실로 옮기고, 앞서 설명한 바와 같이 폐를 삽관하고 기계적으로환기시키는 14.</li>
	<li>(1.5-2%)로 마취 유지 이소플루란.</li>
	<li>동물을 오른쪽 측면 위치에 놓고 가슴 부위에서 털을 면도합니다. 알코올 스크럽으로 피부를 청소한 다음 10 % (v) 포비도 - 요오드 용액으로 수술 부위를 살균하십시오.</li>
	<li>왼쪽 흉부 절개에 의해 가슴을 열고 4번째 늑간 공간에서 메스를 사용하여 가슴을 열고 갈비뼈 사이에 흉부 리트랙터를 사용하여 가슴을 열고 심장을 노출시다. 참고: 이 절차에 는 모든 멸균 된 기구를 사용하십시오.</li>
	<li>나비 바늘 카테터를 왼쪽 심방으로 삽입하고 지갑 끈 잠금 장치로 바늘을 고정합니다. 헤파린 (100 U /kg)의 볼루스 용량의 정맥 주사 후, 왼쪽 심방 카테터를 통해 얼음 차가운 심전도 용액 500 mL (심박수 감속)으로 심장을 정력하기 시작합니다.</li>
	<li>5 % 이소플루란으로 돼지를 깊이 마취시다. 외과 용 가위로 가슴에서 심장을 신속하게 절제하십시오. 대동맥을 대동맥 캐뉼라로 칸막이에 담고 체외에서 심장을 다른 1L의 얼음 차가운 심전도 용액(100 mL/min)으로 침전하여 혈관 내 혈액을 씻어냅니다.</li>
	<li>심장 관류 후, 얼음으로 차가운 심전도 용액으로 채워진 1 L 항아리에 심장을 유지하고 조직 배양실로 옮기는 동안 얼음을 유지하십시오.</li>
</ol>3. 돼지 심장 조직 슬라이스
<ol><li>진동에 티슈 목욕을 설정하고, 티슈 목욕 냉각 재킷에 얼음을 추가 한 다음 티로드의 용액을 티슈 욕조에 추가하십시오. 티슈 목욕 냉각 재킷에서 녹은 얼음의 처리를 수집하기 위해 1L 플라스틱 항아리를 설정합니다.</li>
	<li>생체 안전 성 캐비닛에서 돼지 심장을 신선한 차가운 심전도 용액 1 L이 들어있는 트레이로 옮니다.</li>
	<li>개폐식 멸균 메스를 사용하여 좌심실을 분리하기 위해 심장을 해부하십시오. 그런 다음 면도기 직사각형 블레이드를 사용하여 좌심실을 각각 1-2cm3 블록으로 자른다. 슬라이스에 한 조각을 사용하고 필요한 경우 나중에 절단 얼음에 차가운 Tyrode의 용액에 50mL 튜브에 남아있는 유지. 참고: 특히 두 번째 블록인 경우 손으로 자르기 전에 조직을 마사지하십시오. 마사지는 올바른 근육 섬유 구성을 복원하는 데 도움이 심장 블록 내의 강성을 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>금속 샘플 홀더에 1-2 방울의 티슈 접착제(재료 표)를넣고 표면적이 약 1cm2인4 % 한천 블록 조각을 붙입니다.</li>
	<li>한천에 티슈 접착제 1-2 방울을 넣습니다.</li>
	<li>심장 에피카듐 측이 조직 접착제를 아래로 향하게하여 한천에 심장 블록을 붙이고 가능한 한 평평한지 확인하십시오. 그런 다음, 심장 블록을 가진 티슈 홀더를 진동의 슬라이스 욕조에서 그 위치로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로</li>
	<li>슬라이스 욕조에 산소 튜브를 부착하고 슬라이스 (산소 Tyrode의 목욕)를 수집하기위한 Tyrode의 용액으로 채워진 금속 트레이. 그런 다음 금속 트레이에 40 μm 셀 스트레이너를 추가하여 절단 후 슬라이스를 수집합니다.</li>
	<li>슬라이싱 위치 조정
	<ol>
<li>진동 작동 소프트웨어와 대시보드를 사용하여 블레이드/샘플의 높이를 조정합니다. 높이 버튼을 선택하고 높이를 조정하기 위한 화면 지침을 따릅니다. 이상적으로는 블레이드를 조직의 상단에 가까이 있지만 유두 근육 아래에 있고 자르기 전에 조직과 블레이드를 덮는 액체가 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>사전 버튼을 선택하여 조직을 슬라이스 시작할 위치를 조정합니다. 슬라이스 버튼을 누르고 노브를 사용하여 블레이드를 티슈 가장자리쪽으로 이동하여 속도를 높입니다. 그런 다음 슬라이스를 다시 눌러 중지하고 진행 버튼을 눌러 프로세스를 비활성화합니다.</li>
		<li>절삭 파라미터 조정: 전진 속도 = 0.03mm/s, 진동 주파수 = 80Hz, 수평 진동 진폭 = 2mm. 그런 다음 슬라이스 단추를 선택하여 슬라이스를 시작합니다.</li>
		<li>비브라토임슬라이스가 조직의 끝에 도달할 때까지 슬라이스하지만 시편 홀더의 백 엔드에 닿기 전에 슬라이스합니다. 이 때 슬라이스를 다시 눌러 중지합니다. 돌아가기 버튼을 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.</li>
		<li>자동 반복(두 번 클릭)을 선택하면 진동 마이크로토임이 최대 99회 까지 슬라이스 프로세스를 자동으로 반복할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>슬라이스 수집
	<ol>
<li>슬라이스가 전체 길이가 될 때까지 기다렸다가 (유두 근육 층을 지나간 후) 슬라이스수집을 시작합니다.</li>
		<li>차가운 Tyrode의 용액으로 채워진 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 조각을 모아 부드럽게 욕조에서 티슈를 잡습니다. 필요한 경우, 조직이 여전히 부착되어 있는 경우 집게와 스프링 가위를 사용하여 심장 블록에서 슬라이스를 해리합니다.</li>
		<li>산소를 공급받은 Tyrode의 욕조에서 슬라이스를 하나의 세포 스트레이너로 옮기고(단계 3.7 참조) 플라스틱 파스퇴르 피펫의 액체를 사용하여 조직을 세포 스트레이너 중 하나에 평평하게 눕힌 다음, 위에 금속 와셔를 추가하여 조직을 아래로 유지합니다. 참고: 슬라이스는 처리하기 전에 Tyrode의 용액에서 적어도 1 시간 동안 배양되어야합니다 (이것은 BDM이 조직을 이완시키기위한 것입니다).</li>
	</ol></li>
</ol>4. 심장 조각 을 배양
<ol><li>
문화용 슬라이스 준비
	<ol>
<li>가장자리에서 슬라이스를 잘라서 고르지 않은 가장자리를 방지합니다. 그런 다음, 조직 접착제를 사용하여 내장 된 금속 와이어와 살균 폴리 우레탄 6mm 폭 프린터 타이밍 벨트에 양쪽 끝에서 접착제.</li>
		<li>지원되는 심장 조각을 각 웰에 6 mL의 배양 배지를 포함하는 6 개의 웰 플레이트로 옮김을 옮김.</li>
		<li>자극 플레이트 커버(표 의재료)를6웰 플레이트의 상부에 놓고 커버를 세포 배양 전기 자극기(재료표)에 연결한다.Table of Materials 자극기를 조정하여 항상 10V, 1.2Hz에서 심장 슬라이스를 전기적으로 자극합니다. 참고 : 자극을 연결 한 후, 심장 조각이 이길 시작하고,이 운동은 시각적으로 분명 할 것이다.</li>
		<li>플레이트를 인큐베이터로 옮기고 가습 공기와 5%CO2로37°C에서 유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배양 배지를 하루에 3회 변경하고 각 미디어 변경 시 웰당 6 mL의 배양 배지를 추가합니다. 참고: 배양 배지는 각 배지 변화 전에 5분 동안 산소화된다. 매체는 하루에 적어도 1 배 를 변경해야합니다. 필요한 경우 주말에 괜찮습니다. 하루에 단 1개의 미디어 변경이 테스트되는 최대값입니다.</li>
	<li>
배양 배지에서 독성 흑연 입자의 방출을 방지하기 위해 매일 자극 플레이트 커버를 변경합니다 (일반적으로 중일 배지 변화 중).
	<ol>
<li>배양 접시에서 자극 플레이트 커버를 제거하고 커버가 전기 회로에 대한 물 손상을 방지하기 위해, 세포 배양 전기 자극기 케이블에 연결되는 흰색 폼 플러그를 삽입합니다.</li>
		<li>2 x 항생제 항 균제와 오토 클레이브 워터의 목욕에 접시 커버를 놓습니다. 하룻밤 동안 이 욕조(즉, 헹구기 욕조)에 보관하십시오.</li>
		<li>다음날, 플레이트 커버를 70% 에탄올 욕조에 5-15분 동안 옮겨 오염을 제거합니다. 목욕을 전환하기 전에 장치에서 많은 액체를 떨어 뜨리지 않도록하십시오.</li>
		<li>그런 다음 플레이트 커버를 오토클레이브 워터와 2 배 항균 항균제로 구성된 세 번째 및 마지막 욕조 (즉, 깨끗한 목욕)로 옮겨 남은 에탄올 흔적을 헹구고 있습니다.</li>
		<li>깨끗한 욕조에서 플레이트 커버를 헹구고 나서 깨끗한 보풀이없는 닦아 (에탄올로 뿌리내린)를 사용하여 플라스틱 부품의 잔류 물을 말린 다음 흰색 거품 조각을 제거하고 플레이트 커버를 배양 판에 조심스럽게 놓습니다. 참고: 장치가 더 이상 멸균되지 않기 때문에 우물로 들어가는 검은 흑연 전극을 만지지 마십시오.</li>
		<li>멸균 집게를 사용하여 플레이트 커버가 조직에 닿지 않도록 조직이 우물 중앙에 있는지 확인하십시오. 플레이트 커버의 곡선면이 플레이트의 각진 면과 일치하고 사각형 모서리가 정렬되어 있는지 확인합니다. 참고: 자극 플레이트 커버의 오염을 최소화하려면 실험을 마친 후 6개의 웰 플레이트를 깨끗하고 비어 있게 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MTT 분석, 칼슘 측정 및 수축 기능 평가를 신선한 돼지 심장 슬라이스(일 0일)에 수행하고,13일후에 배양후.</li>
</ol>

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여기서 우리는 급성 심장 독성을 테스트하기에 충분히 긴 기간 동안 돼지 심장 슬라이스의 배양을 가능하게 하는 단순화된 중간 처리량(최대 48개의 슬라이스/장치) 방법에 대한 우리의 최근 발표된 방법에 대한 상세한 비디오 프로토콜을 설명합니다13. 제안된 조건은 전기 자극의 주파수, 영양 가용성 및 간헐적인 산소화를 포함하여 심혼의 환경을 모방합니다. 우리는 우리의 생체 모방 자극 문화에 심장 슬라이스의 장기간 생존은 그대로 심장에 의해 경험 생리 조건을 재현에 우리의 초점에 속성. 이 개념은 필수 영양소를 제공하지 않고 전기 자극만으로는 심장 슬라이스 생존력을 유지하기에 충분하지 않다는 것을 보여주는 데이터에 의해 지원된다13. 따라서, 배양 매체의 새로운 구성 요소는 배양에서 심장 슬라이스 생존 력 및 기능을 연장시키는 주요 동인이다. 우리는 생존력을 유지하기 위해 배지에 FBS를 포함하는 것이 필수적이라는 것을 발견했으며, 이는 다양한 지방...

약물 유발 심장 독성은 시장 철수의 주요 원인1. 20세기의 마지막 십년간에서, 8개의 비 심장 혈관 약은 심실 부정맥 때문에 급격한 죽음의 결과로 시장에서 철회되었습니다2. 또한, 여러 항암 치료 (많은 경우에 효과적인 동안) 심근 증과 부정맥을 포함 하 여 여러 심장 독성 효과 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 전통적인(예를 들어, 안트라시클라인 및 방사선) 및 표적(예를 들어, 트라스투주맙) 유방암 요법은 환자의 서브세트에서 심혈관 합병증을 초래할 수있다 3. 심장 전문의와 종양 전문의 사이의 긴밀한 협력 ("심장 종양학"의 신흥 분야를 통해) 이러한 합병증을 효과적으로 치료 할 수 있도록 관리 할 수 있도록도움이되었습니다 2. Her2 및 PI3K 억제제, 특히 치료가 조합되어 사용될 때 새로운 제제의 심혈관 효과는 명확하지 않습니다. 따라서, 인간 임상 시험 이전에 새로운 항암 치료와 관련된 심혈관 독성에 대한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있다. 24시간 이상 기능적으로 그리고 구조적으로 실행 가능한 인간 심장 조직에 대한 배양 시스템의 가용성의 부족은 신뢰할 수 있는 심장 독성 테스트를 위한 제한 요소입니다. 따라서, 약물 독성 시험을 위한 생리적 조건 하에서 인간의 심장 조직을 배양하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 시급하다.
최근 심장 독성 테스트에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CMs)의 사용으로 의한 움직임은 이 문제를 해결하기 위한 부분적인 해결책을 제공하였다; 그러나, hiPSC-CM의 미성숙한 성질과 심장 조직의 다세포 성질에 비해 조직 무결성의 손실은 이 기술의 주요 한계이다4. 최근 연구는 하이드로겔에 hiPSC-CM에서 심장 조직의 제조를 통해 부분적으로 이러한 한계를 극복하고 시간이 지남에 따라 전기 자극의 점진적 증가를 복종5. 그러나, 그들의 전기 기계적 특성은 성인 인간 심근에서 볼 수있는 성숙도를 달성하지 못했습니다. 더욱이, 심장 조직은 구조적으로 더 복잡하며, 내피 세포, 뉴런 및 세포외 기질 성질 섬유아세포의 다양한 유형을 포함하는 다양한 유형의 세포외 매트릭스 단백질의 매우 특이적인 혼합물과 함께 연결되고6. 이러한 비심근세포 세포 집단의 이질성은 성인 포유류 심장에서7,,8,,9가 개별 세포 유형을 이용하여 심장 조직을 모델링하는 데 큰 장애가 된다. 이러한 주요 제한 사항은 심장의 생리적 및 병리학적 조건을 포함하는 최적의 연구를 위해 손상되지 않은 심장 조직의 문화를 가능하게하는 방법 개발의 중요성을강조5.
인간의 심장 조각을 배양하는 것은 그대로 인간의 심근의 유망한 모델입니다. 이 기술은 인간 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 안정적으로 반영할 수 있는 인간의 심장 조직과 유사한 완전한 3D 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 그러나, 그 사용은 2018년10,,11,,12까지보고된 가장 강력한 프로토콜을 사용하여 24시간 이상 연장되지 않는 배양물의 생존가능성의 짧은 기간에 의해 심각하게 제한되었다. 이러한 제한은 슬라이스를 배양하기 위한 공기-액체 인터페이스의 사용, 및 심장 조직의 높은 에너지 요구를 지원하지 않는 간단한 배양 배지의 사용 등 여러 요인에 기인하였다. 최근 연속적인 전기자극을 제공할 수 있는 침수배양시스템을 개발하고,13일까지심장조직슬라이스를 지속가능한 상태로 유지하기 위해 배양배지 성분을 최적화하였다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 해소하기 위해 급성 심독성 시험을 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다. 현재 기사에서는 돼지 심장을 예로 사용하여 심장 조각을 자르고 배양하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 인간, 개, 양 또는 고양이 의 마음에도 동일한 과정이 적용됩니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 과학 커뮤니티의 다른 실험실에 기술을 전파하기를 희망합니다.

<table><tbody><tr><td>1,000 mL, 0.22 &마이크로; m, 진공 필터 / 저장 시스템</td><td>VWR</td><td>28199-812</td><td></td></tr><tr><td>2,3- 부탄 디온 단산 (BDM)</td> <td>피셔</td><td>AC150375000</td><td></td></tr><tr><td>500 mL, 0.22 &마이크로; m, 진공 필터/보관 시스템</td><td>VWR</td><td>28199-788</td><td></td></tr><tr><td>6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)</td><td>Ion Optix</td><td>CLD6WFC</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline USA</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Thermo</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM ( Ion</td> <td>Optix</td><td>CEP100</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰용 세라믹 블레이드</td><td>Campden Instruments</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cooley Chest Retractor</td><td>Millennium Surgical</td><td>63-G5623</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스 # 20</td><td>Biologyproducts.com</td><td>DS20X</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 세포 여과기, 멸균, 코닝</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>보온</td><td>A3160502</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 집게</td><td>Fisher</td><td>NC9475675</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl BLUE 조직 접착제</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td></tr><tr><td>Iris Spring scissors</td><td>Fisher</td><td>NC9019530</td><td></td></tr><tr><td>Iris Straight Scissors</td><td>Fisher</td><td>731210</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ITS 액체 매체 보충제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCl (500 mg/10 mL)</td><td>West-Ward</td><td>NDC 0143-9508</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mayo SuperCut 수술용 가위</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>AROSuperCut&trade; 07.164.17</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199, Earle's Salts</td><td>Thermo</td><td>11-150-059</td><td></td></tr><tr><td>산소 조절기</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>산소 탱크 -</td><td>Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-48</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>AC193780010</tr><tr><td>프린터 타이밍 벨트</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td></tr><tr><td>Razor 직사각형 블레이드</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF 기본</td><td>R& D 시스템</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 VEGF</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>개폐식 메스</td><td>Fisher</td><td>22-079-716</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>AC217125000</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher</td><td>AC327300010</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>자일라진 HCl(100mg/mL)</td><td>하트랜드 수의학 공급</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

많은 신규 약물은 현재 시험관내 분석 및 생체 내 동물 모델이 인간의 심장 부채를 제대로 예측하지 못하므로 심장 독성 부작용으로 인한 임상 연구에서 실패하여 제약 산업에 수십억 달러의 부담을 안겨주고 있습니다. 따라서, 비용이 많이 들고 시간 소모 '남자에서 처음' 예심을 착수하기 전에 약 심장 독성을 확인하기 위하여 더 나은 접근을 위한 세계적인 충족되지 않은 의학 필요가 있습니다. 현재, 만 미성숙 심장 세포 (인간 유도 만능 줄기 세포 파생 심근 세포 [hiPSC-CMs])는 장기간 배양 할 수있는 유일한 인간 심장 세포이기 때문에 치료 효율성과 약물 독성을 테스트하는 데 사용됩니다. 약물 효능 및 독성을 테스트하는 데 필요합니다. 그러나, 단일 세포 모형은 다중 세포 모형의 형성되는 복잡한 3D 심혼 조직의 표현형을 복제할 수 없습니다. 중요한 것은, 미성숙 hiPSC-CMs에 비해 다른 특성 과 독성 반응을 가진 성인 심근 세포에 약물의 효력이 시험될 필요가 있습니다. 이 기술은 인간의 심장 조직을 모방하고 인간의 심근의 생리적 또는 병리학적 조건을 반영하는 완전한 다세포 시스템에 대한 액세스를 제공합니다. 최근에는 배양 배지 성분의 최적화와 배양 배지의 연속적인 전기 자극을 포함하는 배양 조건의 최적화와 배양배지의 간헐적 산소화를 통해 생존력을 보존하는 새로운 배양 시스템 설정을 개발했습니다. 그리고 문화에서 6 일 동안 인간과 돼지 심장 조각의 기능. 현재 프로토콜에서는 돼지 심장을 잘라내고 배양하는 방법을 예로 들어 자세히 설명하고 있습니다. 동일한 프로토콜은 인간, 개, 양 또는 고양이 하트에서 조각을 배양하는 데 사용됩니다. 이러한 배양 시스템은 전임상 및 임상 시험 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심독성 검사를 위한 situ 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있다.

시판되는 세포 배양 전기 자극기를 이용하여 8개의 웰 플레이트를 한 번에 수용할 수 있고, 생리적 주파수(1.2 Hz)에서 전기 자극을 유도함으로써 성인 심장 밀리유를 에뮬레이트하고, 배양13에서기능성 돼지 심장 슬라이스의 지속 기간을 연장하기 위해 근본적인 배지 성분에 대해 스크리닝하였다. 돼지와 인간의 마음은 크기와 해부학15가유사하기 때문에 돼지 하트를 사용하여 생체 모방 심장 슬라이스 배양 시스템을 개발하고 이어서 인간의 심장 슬라이스에서 검증했습니다. 여기에서, 우리는 인간적인 심혼 슬라이스 및 배양을 위한 동일 절차인 돼지 심혼 조각을 위한 프로토콜을 상세히 설명했습니다. 여기에 기재된 새로운 생체 모방 배양 설정은 MTT분석(도 1A)에의해 평가된 바와 같이 6일 동안 돼지 심장 슬라이스의 ...

이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

이 프로토콜은 급성 심장 독성 검사뿐만 아니라 심부전 치료의 효능을 테스트하는 데 사용할 수있는 생리적 조건하에서 6 일 동안 심장 조직 섹션을 잘라내고 배분하기위한 것입니다. 이 배양 시스템은 임상 전 및 임상 테스트 결과 사이의 격차를 좁히는 급성 심장 독성 테스트를 위한 시투 모델에서 강력한 예측 인간이 될 가능성이 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 실험실 매니저 인 칭후이 쿠 (Qinghui Qu)가 될 것입니다.돼지 심장 조직 조각을 얻으려면 먼저 진동의 조직 목욕 냉각 재킷에 얼음을 추가하고 욕조에 티로드 용액을 추가하십시오. 1리터 플라스틱 항아리를 사용하여 티슈 목욕 냉각 재킷에서 녹은 얼음 유출을 수집하고 돼지 심장을 생물 안전 캐비닛에 신선한 차가운 심근 용액 1 리터가 들어있는 트레이로 옮춥니다. 개폐성 멸균 메스를 사용하여 심장을 해부하여 왼쪽 심실을 분리하고 직사각형 면도날을 사용하여 왼쪽 심실을 1~2개의 큐브 센티미터 블록으로 자른다.슬라이스를 위한 하나의 티슈 블록을 따로 놓고 남은 티슈 블록 조각을 얼음 위에 차가운 티로드 용액50 밀리리터 튜브에 넣습니다. 예약된 티슈 블록을 부드럽게 마사지하고 진동의 금속 샘플 홀더에 1~2방울의 티슈 접착제를 추가합니다. 접착제에 약 1 평방 센티미터의 표면적으로 4 %의 천 블록을 붙이고 한천에 1 ~ 2 방울의 조직 접착제를 추가하십시오.심장 블록을 가능한 한 홀더에 평평하게 사용하여 천 심장 에피카르듐 측에 부착하고 심장 블록으로 조직 홀더를 진동의 슬라이스 목욕에 놓습니다. 심장 블록을 조직 접착제에 내려다보이는 심장 에피카르듐 측과 함께 한고에 붙이고 조직이 가능한 한 평평하다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 그런 다음 산소 튜브를 스티로데 액스로 채워진 슬라이스 욕조와 금속 트레이에 부착하고 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 금속 트레이에 배치하여 슬라이스할 때 심장 조직 섹션을 수집합니다.진동 작동 소프트웨어를 사용하여 블레이드와 샘플의 높이를 조정하여 블레이드가 조직의 상단에 가깝지만 유두 근육 과 액체 가 조직과 블레이드를 덮고 있습니다. 조직을 자르기 시작하는 위치를 조정하려면 사전을 선택합니다. 속도를 높이기 위해 슬라이스를 누르고 노브를 사용하여 블레이드를 조직의 가장자리쪽으로 이동시킵니다.슬라이스를 다시 눌러 중지하고 진행하여 프로세스를 비활성화합니다. 그런 다음 표시된 대로 절단 매개 변수를 조정하고 슬라이스를 눌러 조직을 자르기 시작합니다. 블레이드가 조직의 끝에 도달하지만 표본 홀더의 끝에 도달하기 전에 다시 슬라이스를 눌러 다시 멈추고 다시 눌러 시작 위치로 돌아갑니다.슬라이스가 전체 길이에 도달하고 좋은 품질의 것으로 보일 때, 부드럽게 필요한 심장에서 조각을 탈구하는 집게와 봄 가위를 사용하여 목욕에서 조직을 수집하기 위해 차가운 Tyrode 솔루션으로 채워진 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용합니다. 산소티로드 욕조의 단일 세포 스트레이너에 수집된 각 슬라이스를 놓고 파이펫의 용액을 사용하여 세포 스트레이너 표면의 조직을 누릅니다. 그런 다음 금속 와셔를 조직의 상단에 놓고 그것을 누를 수 있습니다.산소타이로드 용액에서 적어도 1시간 후, 각 슬라이스의 바깥쪽을 다듬어 고르지 못한 가장자리를 제거하고 각 슬라이스의 끝을 6mm 너비의 멸균 된 폴리우레탄 프린터 타이밍 벨트에 내장 된 금속 와이어가 내장 된 상태로 고정하십시오. 지원되는 심장 조각을 6밀리리터의 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트에 넣고 멸균 집게를 사용하여 조직이 우물의 중심에 있는지 확인합니다. 플레이트 커버가 조직을 만지지 않고 플레이트의 곡선면이 플레이트의 각진 측면과 일치하도록 플레이트 에 플레이트를 배치하고 사각형 모서리가 정렬되도록주의하십시오.슬라이스를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 넣습니다. 배양 슈퍼네이터를 하루에 세 번 신선한 산소 배양 배지의 6 밀리리터로 대체하십시오. 커버를 세포 배양 전기 자극기와 연결하고 자극기를 조정하여 10볼트의 전기와 1.2 헤르츠 주파수를 심장 슬라이스에 지속적으로 전달합니다.자극을 연결한 후 심장 조각이 박동하기 시작합니다. 매일 정오 의 미디어 변화 동안, 배양 접시에서 자극 플레이트 커버를 교체하여 독성 흑연 입자가 배양 배지로 방출되는 것을 방지한다. 사용된 커버가 전기 회로의 물 손상을 방지하기 위해 전기 자극기를 위해 케이블에 연결되는 흰색 폼 플러그를 삽입하고 플레이트 커버를 2X 항생제/항mycotic으로 보충된 오토클레이브 수의 목욕에 배치합니다.다음 날, 플레이트 커버를 70%에탄올 욕조에서 5~15분 동안 오염제거한 후 3분 동안 2X 항생제/항마이코틱으로 보충된 신선한 오토클레이브 수조로 커버를 옮기는 것입니다. 플레이트 커버를 헹구고, 에탄올 스프레이 클린 보풀 프리 와이프를 사용하여 플라스틱 부품의 잔류물을 제거하고 흰색 폼 플러그를 제거하십시오. 그런 다음 덮개를 배양 판에 다시 넣을 준비가 되었습니다.이 새로운 생체 모방 배양 설정을 사용하여, 돼지 심장 슬라이스 생존력은 MTT 분석에 의해 평가된 대로 6일 동안 유지되었습니다. 처음 6 일 동안, 신선한 심장 조각에 대 한 관찰 하는 응답과 유사, 돼지 심장 슬라이스 심근 세포 내에서 아무 자발적인 칼슘 과도. 심근세포는 외부 전기 및 베타 부전 자극에 반응했습니다.또한, 이소프로테레놀에 대한 수축력 및 반응은 신선한 심장 조각에서 관찰된 것과 유사한 최대 6일 동안 심장 슬라이스 배양에서 유지되었다. MTT 생존 가능성 분석, 면역 염색, 전자 현미경 검사, 칼슘 과도 측정, 수축 기능 평가, 신진 대사 평가 및 분석을 포함한 여러 구조적 및 기능적 평가가 심장 조각에서 수행될 수 있습니다. 우리는 현재 돼지와 인간의 심장 조각에 대한 관심의 급성 심장 독성및 약물 및 유전자 치료의 효능을 테스트하기 위해이 배양 시스템을 사용하고 있습니다.

slicing-and-culturing-pig-hearts-under-physiological-conditions

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

본 논문에서 우리는 성인 쥐 심장 myocytes를 분리하고 문화에 전형 방법을 설명했다. Collagenase와 단백 분해 효소는 단일 myocytes을 소화하고 격리하는 데 사용됩니다. Myocytes는 대부분의 실험 요구 사항을 충족이 프로토콜을 따라 교양.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

이 비디오는 돼지 심장의 실행 가능한 초박형 절편을 생성하는 진동 기반 절차를 보여줍니다. 준비된 조직 절편은 배양하여 약리학적 검사를 위한 모델 시스템으로 사용할 수 있습니다.

돼지 심실 절편의 생성: 돼지 심장 조직의 초박형 절편을 준비하기 위한 비브라톰 기반 기술

이 비디오에서는 심장 이식을 위해 돼지 모델에서 심장을 추출하는 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다.

돼지 심장 절제술: 심장 이식을 위해 돼지 심장을 추출하는 프로토콜

이 비디오는 산소가 함유된 영양이 풍부한 관류액 용액으로 분리된 돼지 심장을 관류하여 보존하는 현장 기술을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 생리학적 조건에서 심장 성능을 종합적으로 평가할 수 있습니다.

Ex situ heart perfusion: 고립된 돼지 심장 기능을 보존하는 기술

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.

전기 생리학 연구를위한 마우스 짧은 축 심실 조각

이 연구의 목적은 번역 동물 모델을 사용하여 심장 역학을 조사하는 방법을 확립하는 것이었습니다. 기술된 실험 접근법은 분리되고 손상되지 않은 돼지 심장 모델에서 전기 적 활동을 평가하기 위한 전기 생리학 연구와 함께 이중 방출 광검을 통합합니다.

전 비보 랑엔도르프-퍼블릭 하트의 검문 및 전기생리학 연구

이 프로토콜은 전임상 약물 검사를 위해 인간의 심장 조각을 단면화 및 배양하는 절차를 설명하고 이러한 조각에서 동시에 세포간 전압 및 세포내 칼슘 신호를 기록하기 위한 광학 매핑의 사용을 자세히 설명합니다.

인간 조직형 심장 슬라이스의 이중 전압 및 칼슘 광학 매핑에 의한 전임상 심장 전극생리학 평가

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

허혈성 심장 질환에 대한 심근 유전자 치료는 미래 치료법에 대한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 여기에서는 허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델을 소개합니다.

허혈성 심장에서 유전자 치료의 효능을 평가하기 위한 거대 동물 모델

학습하세요 생리적 조건에서 돼지 심장 조직을 절단하고 6일간 배양하는 방법을. 이 프로토콜은 심부전 치료제 효능 평가와 급성 심장 독성 테스트에 활용될 수 있습니다.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

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