Name: 엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 배우세요 양친수성 엘라스틴 유사 단백질을 이용한 초분자 구조 조립 방법을. 베시클, 섬유, 응축체 형성 및 다양한 화물 캡슐화 기술을 통해 약물 전달 및 최소 세포 설계에 활용할 수 있습니다.

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저자는 재정 지원을 위한 BMBF및 생물학 시스템 분석 센터 (ZBSA)를 위한 연구 시설을 제공하기위한 감사합니다. 우리는 P. G. 슐츠, TSRI, 라 호야, 캘리포니아, 플라스미드 pEVOL-pAzF를 제공에 감사드립니다. 우리는 알버트 루드비히스 대학 프라이부르크의 생물 학적 시스템 분석 센터 (ZBSA)의 생명 이미징 센터 (LIC)의 직원에게 공초점 현미경 자원에 대한 도움과 이미지 기록에 대한 탁월한 지원에 감사드립니다.

1. 양과성 엘라스틴과 같은 단백질의 설계 및 복제 (ELP)
<ol><li>다른 곳에서 설명한 대로 구성을 복제하고디자인합니다 8,,20. 플라스미드는 요청 시 이용 가능합니다.</li>
</ol>2. 단백질 발현, 정제 및 준비
<ol><li>F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현<ol>
<li>하룻밤 사전 배양에서 0.3의 OD600까지 메인 발현 배양액을 접종합니다. 37°C에서 배양, 멸균 된 400 mL LB 배지에서 2 L 플라스크에서 적절한 항생제로 보충.</li>
		<li>초순수에서 발현 배양의 유도를 위한 IPTG 스톡 솔루션(1M)을 준비한다.</li>
		<li>OD600 0.5-0.8에 도달하면 발현 배양에 IPTG를 추가하여 최종 농도인 1 mM을 추가하고 인큐베이션 온도를 20°C로 줄입니다. 200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>UAA pAzF를 포함하는 양과성 ELP의 발현<ol>
<li>2개의 플라스미드 pEVOL pAzF 및 예를 들어 pET28-NMBL-(TAG)를 포함하는 하룻밤 대장균 사전 배양으로부터 의 주요 발현 배양으로부터 의 OD600에 0.3의 그의 접종(아미노산 서열에 대한 보충 정보 참조). 37°C에서 배양하고, 2L 플라스크에 카나마이신과 클로람페니콜을 보충한 멸균 400 mL LB 배지에서 200 rpm을 배양하였다.</li>
		<li>초순수에 100 mMM pAzF 스톡 솔루션을 준비하십시오. 10 mL의 pAzF 스톡 솔루션의 경우 206.2 mg의 pAzF를 측정하고 8 mL의 초순수로 다시 일시 중단하십시오. pAzF를 용해시키기 위해 용액의 pH를 3 M NaOH로 올리고 격렬하게 혼합한다. pAzF가 용해되면 pH를 10.5로 조심스럽게 낮추고 최종 부피 인 10 mL에 초순수를 추가하십시오. 멸균 필터(0.22 μm)를 사용하고 2 mL 반응 튜브에서 용액을 알리쿼트합니다.</li>
		<li>초순수에 1M IPTG 스톡 솔루션과 초순수에 20% 아라비노스 스톡 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>OD600 0.5-0.8에 도달하면, 2 mM의 최종 농도에 발현 배양에 pAzF를 추가한다. pAzF 섭취를 허용하도록 10분, 37°C, 200 rpm동안 배양배양한다.</li>
		<li>IPTG (1 mM) 및 아라비노스 (2%)의 동시 첨가를 통해 필요한 tRNA /t-RNA 합성물의 표적 단백질 발현 및 발현 유도 인큐베이션 온도를 20°C로 낮추십시오.</li>
		<li>200 rpm에서 약 20 시간 동안 20 °C에서 발현을 허용하십시오. 4°C, 4000 x g,40분에서 원심분리에 의한 수확 발현 배양.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 용해 및 단백질 정제<ol>
<li>리소자임(0.1 mg/mL) 및 PMSF(0.1 mg/mL)를 함유하는 용해 완충액(배양 리터당 10 mL, 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% 트리톤 X-100)에서 대장균 펠릿을 재중단시켰다. 얼음에 30 분 동안 배양하고 액체 질소에 샘플을 침수하여 나중에 두 번 동결 및 해동.</li>
		<li>현탁액을 초음파 처리 (30%, 15 회, 30 초 : 10 초 휴식)를 원심 분리를 통해 용해 (4 °C, 40 분 동안 10,000 x g)를 제거하십시오.</li>
		<li>친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다(예를 들어 분획 수집기에 연결된 FPLC 시스템을 사용하여 1 mL 니켈 컬럼에서; 재료 표참조). 용출 완충제 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M 우레아, 250-500 mM 이미다졸)로 단백질을 용출하고 추가 처리 될 때까지 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>SDS-PAGE를 통해 정제 효율을 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SPAAC를 통한 ELP의 염료 수정
<ol><li>ELP 용액의 농도를 대략 추정합니다.  pAzF-R40F20 서열은 UV 범위에서 흡수되는 아미노산이 결여되어 있기 때문에 농도 평가를 위한280 흡수는 가치가 없다. 따라서, 이전에 는 동약 및 가중 ELP 양피필SSS PAGE 대역 비교를 위한 참고자료로 사용될 수 있다. ELP 솔루션에서 SDS PAGE 대역의 합산된 회색 값 의 영성을 비교하여 알려진 농도와 시료의 대략적인 농도를 추정할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 염료 BDP-FL-PEG4-DBCO (10 mM 스톡 솔루션; 20 μM 최종 농도)를 ELP 용액 의 500 μL (~20 μM)에 추가합니다. 15°C에서 약 10시간 동안 반응을 배양하면서, 흔들면서 빛으로부터 보호하였다.</li>
	<li>추가 사용에 대 한, 과도 한 BDP를 제거 하는 반응을 투석.<ol>
<li>10 분 동안 초순수에서 투석 막 (예 : 12 kDa 컷오프)을 평형화. 투석 막을 올바른 크기로 잘라 클릭 한 ELP 용액을 함유한 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다. 개구부에서 투석 막을 고정하려면 개구부에 코어를 펀칭하여 반응 튜브 뚜껑을 놓아 튜브를 닫습니다.</li>
		<li>반응 튜브를 선택한 버퍼에 거꾸로 놓습니다. 투석 후 버퍼(2-5L)를 매번 적어도 3시간 동안 교환합니다. 투석 막과 완충제 사이에 갇힌 기포를 제거하여 성공적인 투석을 보장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. THF 붓기 프로토콜
<ol><li>투석 균질 ELP 용액은 안정된 pH 7.5를 가진 인산염 또는 트리스 완충액(10 mM)에 대하여 그의 태그 정제로부터 염 및 잔여 화합물을 제거한다.</li>
	<li>동결 건조를 위해 동결 건조를 시작하고 온도로 식히십시오.</li>
	<li>1.5 mL 반응 튜브 (튜브 당 50-500 μL)에서 투석 단백질 용액을 알리쿼트하고 액체 질소에서 충격 동결. 동결 건조 중에 다른 단백질 용액의 원치 않는 혼합을 방지하기 위해, 작은 구멍이있는 캡을 반응 튜브 위에 올려 부분적으로 밀봉 할 수 있습니다.</li>
	<li>액체 질소에서 냉동 된 단백질 샘플을 가지고 즉시 동결 건조를 시작하기 위해 동결 필로에 배치합니다. 시료가 완전히 건조되면 동결 건조가 완료됩니다 (약 24-48 시간). 그 후, 건조 N2와공기 애호가 ELPs를 환기, 다음 즉시 공기 수분과의 접촉을 피하기 위해 반응 튜브 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>용약 샘플 (ELP, 5-10 μM)에 순수한 THF를 추가하고 THF에서 ELP의 팽윤을 허용하기 위해 얼음 물이 함유 된 수조 초음파 처리기에 용액을 15 분 동안 놓습니다.</li>
	<li>소포 형성을 위해 30-60 °C또는 섬유 형성을 위해 최대 90 °C까지 열열 처리하고 초순수 또는 완충액을 포함하는 새로운 반응 튜브를 준비합니다 (50 mM NaH2PO4/ Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 5-13). 구형 응고체는 pH 9-13 내에서 20°C에서 주로 조립됩니다. 소포 형성은 pH 7과 9 사이의 50-60°C에서 선호된다. 섬유 형성은 pH 5 와 12 사이에서 60°C 이상으로 미리 유도된다.</li>
	<li>초음파 처리 단계 후 ELP /THF 용액과 준비된 초순수 또는 완충액을 열순환기에서 넣고 원하는 온도까지 5 분 동안 가열하십시오. 온도에 도달하면 예열 된 ELP / THF 용액은 예열 된 초순수 또는 완충액 위에 신중하게 계층화해야합니다. 고유한 인터페이스를 가진 두 단계의 명확한 분리가 표시되어야 합니다.</li>
	<li>혼합물을 다시 열사이클러에 넣고 20 분 동안 배양하여 계면에서 소포 또는 섬유 형성을 허용합니다. 그 후, 형광 현미경 또는 투석을 통해 분석하기 전에 샘플을 실온으로 10 분 동안 식힙니다.</li>
	<li>초순수 또는 완충액에 대한 초분자 구조를 함유하는 투석액(50 mM NaH2PO4/Na2HPO4,50 mM NaCl, pH 7-10).</li>
</ol>5. BuOH 압출 프로토콜
<ol><li>초순수 또는 완충액(50 mM pb pH 7.5, 100 mM NaCl, 최대 4M 우레아을 함유할 수 있음)에서 1-50 μM ELP 용액을 준비한다. 양과성 ELP F20R20-mEGFP 및 F20R20-mCherry 용액의 농도는 어금니 소멸 계수(F20R20-mEGFP A280= 22015 M-1 cm-1 및 F20R20-mCherry A280= 34380M-1)를 사용하여 결정될 수 있다.-1</li>
	<li>10%-20%(v/v) 1-부타놀을 추가하고 즉시 파이펫팅또는 주사기를 여러 번 통해 그려서 용액을 혼합합니다. 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 일반적인 100 μL 파이펫 또는 해밀턴 주사기를 적용할 수 있습니다. 혼합 중 용액의 탁도가 증가하여 소포 형성을 나타냅니다. 1-옥탄놀 5%-15% (v/v) 또한 1-부탄올 대신 소포 압출에 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 실온에서 1 μm의 기공 크기의 멤브레인을 통해 미니 압출기를 사용하여 소포를 압출한다. 압출에 사용되는 멤브레인 크기는 소포의 상부 크기 컷오프를 결정합니다.</li>
	<li>상기와 같이 소포를 투석(단계 3.3)하여 잔류 1-부탄올을 제거한다.</li>
</ol>6. BuOH 압출 프로토콜로 염료 캡슐화
<ol><li>약 40 μL ELP 용액을 10 mM Tris-HCl, pH 8과 1 μL Dextran 텍사스 레드 (0.0025 mg/mL 최종 농도)로 혼합합니다.</li>
	<li>용액에 BuOH 10 μL을 추가하고 0.25 x 25mm 바늘이 장착 된 주사기를 통해 5-10 회 돌출시하십시오.</li>
</ol>7. 형광 현미경을 이용한 초분자 구조 분석
<ol><li>유리 슬라이드에 보강 링을 놓고 접착제 면을 유리에 단단히 누릅니다.</li>
	<li>철근 링 안쪽에 시료 5 μL을 추가하고 커버 슬립을 위에 놓습니다.</li>
	<li>분석 중에 샘플이 증발하지 않도록 커버 슬립 가장자리에 매니큐어로 시료를 밀봉합니다.</li>
	<li>앞서 설명한 대로 형광 현미경 검사법을 수행8.</li>
</ol>

<ol><li>Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+nanocarriers+as+promising+drug+and+gene+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems.</a> Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).</li>
<li>Jang, Y., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Materials+Made+from+Functional+Recombinant+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins.</a> Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).</li>
<li>Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+nanoreactors+based+on+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+Triggered+Self-Assembly+of+Polypeptides+into+Multivalent+Spherical+Micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).</li>
<li>Matsuurua, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+self-assembled+proteins+and+peptides+for+nano-+and+micro-sized+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures.</a> RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).</li>
<li>Rocklin, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+folding+using+massively+parallel+design%2C+synthesis%2C+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing.</a> Science. 357 (6347), 168-175 (2017).</li>
<li>Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Toolbox+of+Tailored+Supramolecular+Architectures+Based+on+an+Amphiphilic+Protein+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library.</a> Small. 15 (30), 1900163(2019).</li>
<li>Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Coacervate-to-Vesicle+Transition+of+Globular+Fusion+Proteins+to+Engineer+Protein+Vesicle+Size+and+Membrane+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity.</a> Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).</li>
<li>Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+micelles+assembled+from+variants+of+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin.</a> Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).</li>
<li>Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+polypeptide+vesicles+by+conformation-specific+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly.</a> Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).</li>
<li>Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-Triggered+Self-Assembly+of+Elastin-Like+Block+Co-Recombinamers%3AThe+Controlled+Formation+of+Micelles+and+Vesicles+in+an+Aqueous+Medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium.</a> Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).</li>
<li>Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrafibrillar+Mineralization+of+Self-Assembled+Elastin-Like+Recombinamer+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).</li>
<li>Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+tunable+protein+suprastructures+from+recombinant+oleosin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).</li>
<li>Park, W. M., Champion, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Triggered+Self-Assembly+of+Folded+Proteins+into+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+synthetic+cells+using+peptide-based+reaction+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments.</a> Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).</li>
<li>Vogele, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vesiculo+Synthesis+of+Peptide+Membrane+Precursors+for+Autonomous+Vesicle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).</li>
<li>Huber, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+amphiphilic+proteins+as+building+blocks+for+the+intracellular+formation+of+organelle-like+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments.</a> Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).</li>
<li>Urry, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin%3A+a+representative+ideal+protein+elastomer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Elastin: a representative ideal protein elastomer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+combinatorial+DNA-toolbox+platform+constituting+defined+protein-based+biohybrid-materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials.</a> Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).</li>
<li>Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prebiotic+Protocell+Model+Based+on+Dynamic+Protein+Membranes+Accommodating+Anabolic+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions.</a> Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).</li>
<li>Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-Azido-l-phenylalanine+to+the+Genetic+Code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Sonnino, S., Prinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+domains+and+the+%22lipid+raft%22+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane domains and the "lipid raft" concept.</a> Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).</li>
<li>Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organische+Azide+-+explodierende+Vielfalt+bei+einer+einzigartigen+Substanzklasse%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse.</a> Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Structures+in+Tetrahydrofuran%E2%80%93Water+Mixture+with+a+Trace+Amount+of+Antioxidant+Butylhydroxytoluene+%28BHT%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT).</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).</li>
<li>Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimalist+Protocell+Design%3A+A+Molecular+System+Based+Solely+on+Proteins+that+Form+Dynamic+Vesicular+Membranes+Embedding+Enzymatic+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions.</a> ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).</li>
<li>Raghunathan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+stability+and+structure+of+two+different+green+fluorescent+proteins+in+organic+co-solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).</li>
<li>Sallach, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+biostability+of+self-assembling+protein+polymers+in+the+absence+of+covalent+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking.</a> Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

정의된 상분자 구조의 조립을 위한 기재된 프로토콜을 따르는 동안 결함은 주로 비특이적 응집체의형성(도 2,IV) 또는 균질적으로 분포된 ELP-양서류에 이르게 한다. 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다.
양서류 ELP의 높은 발현 수율을 위해 20°C의 비교적 낮은 온도가 최적입니다. 양과성 ELP의 성공적인 친화도 기반 정제를 위해 용해 완충액에서 4M의 우레아 농도는 양과성 ELP를 가장 잘 용해시키고 수용성 용출 분획에서 단백질 수율을 증가시키는 것으로 입증되었다. 용해 완충액에 있는 더 낮은 우레아 사격이 요구되는 경우에, 친화성 정제는 개별 구조물을 위해 시험되어야 합니다. 2 M 우레아는 특히 His-tag가 친수성 도메인에 융합되어 수지를 결합 할 수있는 일부 구조에 대해서도 잘 작동했습니다.  크기 배제 크로마토그래피를 통한 그의 태그 정제 후 추가적인 정제 단계는 소포 수율을 증가시킬 수 있다.
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생명 공학 응용 프로그램에 대한 상분 분자 구조의 조립은 점점 더 중요해지고있다1,,2,,3,,4,,5. 원하는 물리 화학적 특성을 가진 코서바트, 소포 및 섬유와 같은 기능적 아키텍처의 조립을 위해 구성 요소의 물리 화학적 및 형태적 특성을 이해하고 제어하는 것이 중요합니다. 자연에서 발견되는 분자의 분자 정밀도로 인해, 상분 분자 구조에 대한 빌딩 블록은 점점 지질, 핵산 또는 단백질에 기초하고 있습니다. 합성 폴리머에 비해, 단백질 구성 요소는 유전 수준에서 응급 최후의 분자 구조6에 대한 정확한 제어를 할 수 있습니다. 개별 단백질 빌딩 블록의 1차 아미노산(aa) 서열은 최종 초분자구조의3차원 형상 및 물성뿐만 아니라 거시적 수준까지의 분자로부터 그들의 조립 전위성에 대한 정보를 본질적으로 인코딩한다.
다른 상분 분자 구조의 조립을위한보고 된 방법은 종종 온도에 민감한 엘라스틴과 같은 단백질 (ELP)과 같은 양과 성 단백질을 포함5,8,9, 재조합 올레오신10및 인공 단백질 양서류11. 온도 트리거 방법은 미셀의 조립을 주도하고있다4,10,12섬유13시트14및 소포9,15,16. 유기 용매와 관련된 방법은 동적 단백질 기반 소포의 형성을 위해 적용되었습니다.8,11,14. 지금까지 소포 형성을 위한 응용 프로토콜은 마이크로미터 크기의 어셈블리에 대한 조립 제어가 부족한 경우가 많습니다.16,17또는 조립 수율이 제한되어 있습니다.5. 또한, 일부 보고 ELP 기반 소포 는 캡슐화 잠재력을 손상12또는 시간이 지남에 따라 제한된 안정성9. 이러한 단점을 해결하는 제시된 프로토콜은 뚜렷한 물리화학적 특성, 양호한 캡슐화 잠재력 및 장시간 안정성을 갖춘 마이크로미터 및 서브 마이크로미터 크기의 초분자 구조의 자체 조립을 가능하게 합니다. 맞춤형 양서류 ELP는 구형 응고체와 고도로 주문된 꼬인 섬유 번들에서 적용된 프로토콜 및 관련 환경 조건에 따라 unilamellar 소포에 이르기까지 다양한 범위의 상분자 구조로 조립됩니다. 큰 수피 단백질 막 기지를 둔 구획 (PMBC)는 리포좀과 유사한 막 융합 및 상 분리 행동과 같은 모든 주요 표현형을 밝힙니다. PMBC는 간단한 epifluorescence 현미경 검사법을 사용하여 모니터링할 수 있는 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 효율적으로 캡슐화합니다. 이 연구에서 사용되는 반복적 인 ELP 도메인은 단백질 기반의 초분자 아키텍처를위한 매력적인 빌딩 블록입니다.18. ELP 펜타펩타이드 반복 유닛(VPGVG)은 구조적 및 기능적 특성을 유지하면서 네 번째 위치(발린, V)에서 프롤린 외에 다른 aa를 견딜 수 있는 것으로 알려져 있습니다.19. 특유의 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 양과성 ELP의 설계는 뚜렷한 소수성, 극성 및 전하를 가진 VPGXG 반복에 aa 게스트 잔류물 (X)을 삽입함으로써 실현되었습니다.20. 친수성 도메인이 충전된 글루탐산(E) 또는 아르기닌(R)을 게스트 잔류물로 함유하는 동안 소수성 페닐알라닌(F) 또는 이솔루신(I)을 구비한 양과성 ELP 도메인. 적격 한 양과 성 ELP 구문 및 해당 aa 시퀀스의 목록은 보충 정보 및 참조에서 찾을 수 있습니다.8,21. 형광 현미경 검사법을 통해 시각화를 위한 작은 형광 염료 또는 형광 단백질을 갖춘 모든 빌딩 블록. mEGFP 및 기타 형광 단백질은 ELP 양서류의 친수성 도메인에 N-말단 융합되었다. 유기 염료는 구리가 없는 균주를 통해 공액화되었고 알키네-아지드 사이클로아더(SPAAC)를 동시 도입된 부자연 아미노산(UAA)으로 촉진시켰다. UAA의 공동 번역 편입para-아지도페닐알라닌 (파즈프)22친수성 ELP 도메인의 N 말단 수정을 허용합니다. 이에 녹색 형광염료 BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP) 또는 변형된 사이클로크틴을 가진 임의의 작은 형광 분자는 형광 프로브로서 사용될 수 있다. UAA pAzF의 성공적인 통합과 SPAAC를 통한 염료의 사이클로추가는 해당 트립틱 펩타이드의 효율적인 이온화로 인해 LC-MS/MS를 통해 쉽게 확인할 수 있습니다.8. 이 작은 유기 염료는 형광 단백질이 대부분의 유기 용매와 호환되지 않으므로 조립 프로토콜에 대한 용매 선택을 넓히기 위해 적용되었습니다. 실험실에서 개발된 상분자 구조에 대한 가장 효율적인 조립 프로토콜 2개는 아래에 설명되어 있습니다. THF 팽윤 방법은 유기 염료 변형 양과성 ELP와만 호환됩니다. 대조적으로, 1-부탄올(BuOH) 압출 방법은 형광 프로브와 같은 많은 단백질과 호환되며, 예를 들어 mEGFP, 기재된 방법은 이들 융합 단백질의 형광을 완전히 보존하기 때문이다. 또한, 소분자 및 수혈융합 거동을 캡슐화하는 것은 BuOH 압출 방법을 채택함으로써 가장 잘 작동한다.

<table><tbody><tr><td>1 &마이크로; m 및 0.2 &마이크로; m 멸균 필터</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-butanol. >99.5% p.a.</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2log DNA 사다리</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>79249 알킨 메가 스톡스 염료</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>빙하</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, 무수, 99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염, 99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BDP-FL-PEG4-DBCO</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biofuge</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PES 멤브레인이 있는 병 상단 필터(45 &마이크로; m, 22 &마이크로; m)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brillant Blue G250(Coomassie)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BspQI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카메라 DS Qi1</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5417r</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810r</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF-400-Cu 사각 메쉬 구리 그리드</td><td>EMS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CompactStar CS 4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 소닉파이어</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EarI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>환경 셰이커 인큐베이터 ES-20</td><td>Biosan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터는</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass 플레이트</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>를 지원합니다.글리세롤 단백질체학 등급</td><td>Amresco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Applichem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H4-Azido-Phe-OH</td><td>Bachhem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열판 MR</td><td>HeiTec Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HisTrap FF 원유 컬럼</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>니켈 컬럼</td></tr><tr><td>하이드로클로라이드 산 발연, 37%, p.a. </td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator ix 20</td><td>INTAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illuminator LAS-4000</td><td>Fujifilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 검사용 침지 오일</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커 Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 1000</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG, >99%</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfate</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose</td><td>Roth Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scales Extend ed2202s/224s-OCE</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer Alpha 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme, 20000 U/mg</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope CM 100</td><td>Philips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Eclipse TS 100</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경 (15 x 15 mm)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Studio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미니 압출기 세트</td><td>Avanti 극지 지질</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨, >99.5%, p.a.</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid pellets,</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA, Agarose, PerfectPro</td><td>5 Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane</td>, <td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH meter 766 calimatic</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 컬럼 (1 mL)</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac basic</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propanol-2-ol</td><td>Emplura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 사다리 10-250 kDa</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재순환 냉각기 F12</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>보강 링</td><td>Herma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SacI HF</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 펠릿</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 필터 0.2mm 셀룰로오스 아세테이트</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Roth TexasRed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran-Conjugate</td><td>MolecularProbes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>써모믹스 편안함</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THF, 연 >99.5%</td><td>Acros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton/Pepton from Casein</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea p.a.</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프 2.5</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZelluTrans 재생 셀룰로오스 관형 멤브레인(12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

맞춤형 단백질성 빌딩 블록은 최소 세포, 약물 전달 차량 및 효소 스캐폴드와 같은 포부 분자 구조의 조립을 위한 다목적 후보입니다. 유전적 수준에서의 생체 적합성 및 튜닝성으로 인해 엘라스틴과 같은 단백질(ELP)은 생명 공학 및 생물 의학 응용 분야에 이상적인 구성 요소입니다. 그럼에도 불구하고, 뚜렷한 물리화학적 특성과 양호한 캡슐화 잠재력을 가진 단백질 기반의 상분자 구조의 조립은 여전히 도전적이다.
여기에서 우리는 구형 응고체, 섬유 및 안정한 소포와 같은 초분자 단백질 아키텍처로 양과성 ELP의 유도자가 조립을 위한 2개의 효율적인 프로토콜을 제공합니다. 제시된 조립 프로토콜은 적응형 물리화학적 특성을 가진 ELP를 기반으로 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성합니다. PMBC는 위상 분리 거동을 시연하고 방법 의존적 멤브레인 융합을 드러내며 화학적으로 다양한 형광화물 분자를 캡슐화할 수 있습니다. 생성된 PMBC는 약물 제형 및 전달 플랫폼, 인공 세포 및 구획화된 반응 공간으로서 높은 적용 잠재력을 가지고 있다.

소포 생산을 위한 프로토콜 개발 그림 1은 두 가지 다른 소포 준비 방법을 간략하게 설명합니다. 좌측의 THF 팽윤 방법은 3개의 연속적인 단계로 구성되며 온도에 따라 ELP의 상이한 상이한 분자 어셈블리를 초래한다. 그림 1A 에피오레스내시크 현미경 이미지는 BDP-R20F20에서 조립된 소포와 BDP-R40F20에서 조립된 섬유소 구조를 보여줍니다. 오른쪽에 예시된 BuOH 방법은 ELP 소포의 형성을 독점적으로 유도하여 THF 팽윤 방법에 비해 약 2배의 더 많은 소포를 산출합니다. 도식 그림은 BuOH 소포의 준비 과정을 보여줍니다. 도 1B BDP-R40F20에서 소포 제제를 위해 10-15% (v/v) BuOH및 소포를 혼합하여 혼합물의 압출을 통해 제조하였다.
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유기 및 수성 용매의 계면에서 맞춤형 양피 성 엘라스틴과 같은 단백질은 환경 매개 변수에 의해 유발되는 소포, 섬유 및 응고체와 같은 복잡한 상분자 구조로 조립됩니다. 설명된 조립 프로토콜은 튜닝 가능한 특성을 가진 단백질 멤브레인 기반 구획(PMBC)을 생성하여 다양한 화물을 캡슐화할 수 있도록 합니다.

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

최소한의 세포 설계 및 약물 전달을 위한 수프라 분자 구조의 효율적인 조립은 여전히 어려운 일입니다. 여기서, 우리는 양용 성 엘라스틴과 같은 단백질을 기반으로 수분자 구조를 산출하는 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 제시된 조립 프로토콜은 소포, 섬유 및 동서와 같은 적응 가능한 물리화학적 특성을 가진 다목적 수분자 구조를 생성합니다.단백질 멤브레인 기반 구획은 상 분리 거동을 보여주고 화학적으로 다양한 형광화물 분자의 캡슐화를 허용합니다. F20E20-mEGFP 및 F20E20-mCherry의 표현을 위해, 1박 전문화에서 0.3의 OD600까지 의 주요 표현 문화를 접종한다. 37섭씨 와 200 rpm에서 적절한 항생제로 보충된 멸균 LB 배지의 400 밀리리터에서 배양하십시오.발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면 IPTG를 1밀리머의 최종 농도에 추가하고 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮춘다. 부자연스러운 아미노산을 가진 수륙양용 ELP의 발현을 위해, 0.3의 OD에 적합한 플라스미드를 포함하는 야간 대장균 전 배양으로부터 주요 발현 문화를 접종한다. 카나마이신과 클로람페니콜을 섭씨 37도, 200rpm에 보충한 멸균 LB 배지 400밀리리터로 인큐베이션을 증식합니다.100 밀리풀라 부자연스러운 아미노산 육수를 준비하려면 206.2 밀리그램의 부자연스러운 아미노산을 초순수 수의 8 밀리리터에 추가하십시오. 용액의 pH를 수산화 나트륨 3마리로 올리고 적극적으로 섞습니다. 부자연스러운 아미노산이 용해되면 pH를 약 10.5로 낮추고 초순수수를 10밀리리터의 부피에 추가합니다.멸균 0.22 마이크로미터 필터로 용액을 걸러내고 2밀리리터 반응 튜브로 알리쿼트합니다. 발현 배양은 0.5 ~0.8의 OD600에 도달하면, 2밀리머의 최종 농도에 부자연스러운 아미노산을 첨가한다. 10 분 더 배양.그런 다음 IPTG 및 아라비노스의 동시 첨가를 통해 표적 단백질 및 필요한 tRNA 합성제의 발현을 유도한다. 인큐베이션 온도를 섭씨 20도로 낮추고 식이 약 20시간 동안 계속되도록 합니다. 인큐베이션 후, 40분 동안 4도, 000배 g에서 원심분리로 세포를 수확한다.리소지메 및 PMSF로 리시스 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음에 30 분 동안 솔루션을 인큐베이션합니다. 그런 다음 액체 질소에 잠기면 두 번 동결하고 해동하십시오.서스펜션을 초음파 처리하고 10, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 원심 분리로 lysate을 40 분 동안 취소합니다. 그런 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질을 정화합니다. 단백질 용출 후 추가 사용이 될 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오.ELP 용액 500 마이크로리터에 형광 염료 1개를 추가하고 ThermoMixer에서 흔들리는 동안 섭씨 15도에서 약 10시간 동안 반응을 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 과도한 형광염을 제거하려면 초순수 수역에서 투석 막을 10분 동안 평형화합니다. 멤브레인을 올바른 크기로 잘라 서 응고 된 ELP 용액을 사용하여 반응 튜브의 개구부 위에 놓습니다.그런 다음 코어가없는 뚜껑으로 튜브를 닫아 멤브레인을 개구부로 고정합니다. 공기의 트래핑을 방지하기 위해 뚜껑과 멤브레인 사이의 공간을 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 반응 튜브를 선택한 버퍼에 넣고 표면 아래로 밀어 거꾸로 놓습니다.섭씨 4도에서 적어도 3시간 동안 투석을 수행하여 각 버퍼 변경 후 투석이 적어도 3시간 이상 계속될 수 있도록 합니다. THF 팽윤의 경우, 안정적인 pH 7.5로 인산염 또는 트리스 버퍼에 대해 균질한 ELP 용액을 투석한다. 리오필라이저를 준비하고 동결 건조를 위해 온도를 시동하도록 식힙니다.Aliquot는 1.5 밀리리터 반응 튜브에서 투석 된 단백질 용액을 인용하고 동결 건조 과정에서 압력 변화로 인해 고체 샘플을 잃지 않도록 작은 구멍이있는 캡으로 밀봉하십시오. 액체 질소에 있는 견본을 충격 동결합니다. 냉동 단백질 샘플을 액체 질소에서 꺼내 서 즉시 동결 건조를 시작 하는 lyophilizer에 배치 합니다.시료가 완전히 건조한 후, 건조한 질소로 환기시키고 반응 튜브 뚜껑을 즉시 닫아 공기 습기와의 접촉을 피하십시오. lyophilized 샘플에 순수 THF를 추가하고 15 분 동안 얼음 물이있는 수조 초음파 식소식에 용액을 넣습니다. 열순환기를 섭씨 30~60도로 예열하여 소포 형성을 위해 섭씨 30도 또는 섬유 형성을 위해 섭씨 90도까지 예열하고, 초순수 수또는 완충액으로 새로운 반응 튜브를 준비합니다.초음파 처리 후 ELP/THF 용액과 준비된 물 또는 버퍼를 5분 동안 열순환기에 배치합니다. 그런 다음 ELP 용액을 물 이나 버퍼 위에 계층화하여 두 단계와 뚜렷한 상호 위상의 분리가 보이는지 확인하고 혼합물을 열순환기에 다시 배치합니다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 식히고 물 이나 버퍼 또는 형광 현미경 검사법에 대한 투석을 진행하십시오.일대일 50 마이크로몰라 ELP 용액을 준비하고 10~20%에서 20%1-부타놀을 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 즉시 용액을 섞는다. 용액의 탁도는 혼합 하는 동안 증가 해야 합니다., 소포 형성을 나타내는.좁은 크기 분포를 달성하기 위해, 하나의 마이크로 미터의 모공 크기와 멤브레인을 통해 미니 압출기로 소포를 돌출. 염료 캡슐화를 위해, DMSO에 Dextran 텍사스 레드 스톡 솔루션 의 한 마이크로 리터와 10 밀리머 트리-HCl에 ELP 용액의 약 40 마이크로 리터를 혼합. 1부타놀 10마이크로리터를 넣고 0.25 x 25mm 바늘이 장착된 주사기를 통해 5~10회 돌출합니다.THF 팽윤 방법은 3개의 연속단계로 구성되고 온도에 따라 ELP의 상이한 수분자 어셈블리를 초래한다. 상피 형광 현미경 이미지는 BDP-R20F20및 BDP-R40F20에서 조립된 세동 구조에서 조립된 소포를 보여줍니다. 1부타놀 압출 방법은 ELP 소포의 형성에만 이르게 한다.THF 붓기 방법에 비해 약 2개의 크기의 더 많은 소포가 생성된다. BDP-R40F20은 10~ 15%의 부타놀과 혼합되었고, 소포는 혼합물의 압출을 통해 제조되었다. 상이한 수분자 구조는 THF 팽창 프로토콜을 통해 BDP-R40F20으로부터 조립되었다.완충제의 pH 및 조립 공정의 온도는 동서병, 피브릴 또는 소포를 형성하도록 조정되었다. 어셈블리 프로토콜의 작은 실수는 집계의 형성으로 이어질 수 있습니다. 양전하 염료 ATTO Rho(13)와 다당류 도포(3000)는 1부타놀 압출 방법을 통해 F20R20-mEGFP에서 조립된 소포의 루멘으로 캡슐화되었다.공초점 현미경 이미지는 녹색 채널의 소포, 빨간색 채널의 화물 및 그로 인한 병합 채널의 성공적인 캡슐화를 보여줍니다. 단일 PMBC 빌딩 블록과 조립된 PMBC 인구의 혼합 시 ELP 수륙 양용애호가의 위상 분리 및 융합 거동도 입증되었습니다. PMBC 어셈블리 이전에 혼합하면 조립된 PMBC 멤브레인 내에서 균질하게 분포된 분자로 이어지며, 조립된 소포 집단을 혼합하면 적어도 20분 동안 볼 수 있는 적색 또는 녹색 형광의 막 패치로 이어집니다.이 절차를 시도할 때, THF 팽윤 방법과 부타놀 압출 방법 사이의 차이에 대해 올바른 단계 순서와 차이점에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라, ELP 소포는 약물 전달 셔틀, 시험관 내 전사 및 번역과 같은 효소 반응의 플랫폼으로 사용하거나 합성 최소 세포의 형성으로 사용될 수 있다.

directed-assembly-elastin-like-proteins-into-defined-supramolecular

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 논문은 자기 조립의 자연 프로세스에 의해 주문한 높은 펩타이드 기반 구조의 형성을 설명합니다. 이 방법은 시판 펩티드 및 일반적인 실험실 장비를 이용한다. 이 기술은 펩티드의 큰 다양성에 적용 할 수 있으며, 새로운 펩티드 어셈블리의 발견으로 이어질 수있다.

짧은 펩타이드의 자기 조립에 의해 주문 생체 고분자 구조의 형성

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

엘라스틴 같은 폴리펩티드는 재조합 단백질 정제의 약물 전달에 이르기까지 다양한 응용 프로그램과 자극 - 반응 생물 고분자 물질이다. 이 프로토콜은 크로마토 그래피를 간단한 대안으로 그들의 낮은 임계 용액 온도 상전이 거동을 이용하여 대장균에서 엘라스틴 같은 폴리펩티드 및 그 펩티드 또는 단백질 융합체의 정제 및 특성을 설명한다.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

재조합 기술을 통해 재료 설계자는 조직 공학 응용 분야를 위한 맞춤형 기능을 가진 새로운 인공 단백질을 만들 수 있었습니다. 예를 들어, 인공 세포외 기질 단백질은 네이티브 ECM에서 파생된 구조 및 생물학적 도메인을 통합하도록 설계할 수 있습니다. 여기에서는 엘라스틴 유사 반복을 포함하는 aECM 단백질의 구성 및 정제에 대해 설명합니다.

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

여기에 제시된 펩티드 계의 작은 unilamellar 소포의 생성을 위한 프로토콜은 성장할 수 있다. 막 펩티드의 vesiculo 생산을 용이하게하기 위해, 이들 소포는 전사 번역 시스템 및 펩티드 인코딩 플라스미드를 구비한다.

자율 적인 소포 성장을 위한 펩티드 멤브레인 전구체의 베시큘로 합성

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

이 기사에서는 캡슐화 된 세포 골격 단백질로 거대한 unilamellar 소포를 신속하게 생산하기위한 간단한 방법을 소개합니다. 이 방법은 감금 및 세포골격-막 상호작용에서 세포골격 구조의 상향식 재구성에 유용한 것으로 입증된다.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 대장균에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)를 정제하기 위한 빠르고 재현 가능한 유기 용매 기반 추출 및 침전 방법을 설명 하며, 기존 ELP 정제 방법에 대한 확장 가능한 대안을 제공합니다.

유기 용매 기반 추출 및 침전법을 이용한 대 장균 에서 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(ELP)의 효율적 정제

배우세요 양친수성 엘라스틴 유사 단백질을 이용한 초분자 구조 조립 방법을. 베시클, 섬유, 응축체 형성 및 다양한 화물 캡슐화 기술을 통해 약물 전달 및 최소 세포 설계에 활용할 수 있습니다.

엘라스틴과 같은 단백질을 체외에서 정의된 수분자 구조 및 화물 캡슐화로 조립하도록 지시

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